荧光光度分析法与药物分析

荧光光度分析法与药物分析

化材院化工3班姚依弟 10081224

前言

当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的光，而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。利用这种能够反映物质特性的荧光对该物质进行定性和定量分析的方法称为荧光分析法。

荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光，激发的完成是由于光的吸收。吸收与荧光密切相关，因为吸收必须先于荧光发射。由于碰撞和热的耗散常使一部分吸收能丧失，剩余荧光的能量比吸收的能量小，因此荧光在更长的波长发射。

【一】荧光分光光度法的分析方法

荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色法和分光光度法。比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几；而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的。荧光分析法的另一优点是选择性高。荧光分析法还有方法快捷，重现性好，取样容易，试样需要少等优点。荧光分析法也有它的不足之处，主要是指它比起其它方法来说应用范围还不够广泛，因为有许多物质本身不会产生荧光。

为使荧光分析法的应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法，如

对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质，对荧光较弱的物质可采取荧光增敏分析法。荧光分析法可分为直接荧光测定法和间接荧光测定法。直接测定法是利用物质自身发射的荧光进行定量测定。但是自身发荧光的药物寥寥无几，所以一般采用间接法测定。

1、直接荧光分析法

直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的药物。因荧光性质与溶液的EF值有关，故荧光强度的测定需在适宜的EF缓冲溶液中进行。对于成分复杂的生物供试品，为了防止干扰，有时需利用萃取、沉淀、色谱分离等方法除去干扰物，以降低荧光空白本底，提高分析灵敏度。已用于直接荧光分析法的药物有盐酸洛哌丁胺、双水杨酯、左旋溶肉瘤素、叶酸等。

本身能发荧光的物质,可用荧光分光光度法直接测定。鲍霞认为可用荧光分光光度法直接测定氧氟沙星胶囊的含量。取氧氟沙星胶囊药粉用醋酸-醋酸钠缓冲溶液配溶液,2h后,室温,用试剂作空白,在RF-5301 型荧光分光光度(日本岛津) 上,以427nm 为激发长,500nm 为发射波长测定荧光强度,计算其标示量的百分含量。本法操作简单,快捷,灵敏度高,结果满意。

2、间接荧光分析法

本身荧光很弱的物质,常采用氧化还原反应、配位反应等化学反应将其变为能发荧光的物质,用荧光分光光度法间接测定。

（1）氧化还原反应

叶酸本身荧光很弱, 用KMnO4氧化叶酸,其氧化产物喋呤-6-羧酸能发荧光。刘欣等人认为通过测定叶酸氧化产物喋呤-6-羧酸的荧光强度,可间接测定叶酸的含量。测定时,在日立850 型荧光分光光度计上,以289nm 为激发波长,440nm 为发射波长,测定叶酸氧化产物喋呤-6-羧酸的荧光强度,同时做空白实验,间接测定叶酸的含量。此方法较直接荧光分析法测定叶酸的灵敏度提高12.5倍。

（2）配位反应

铋(Tb) 作为荧光探针,能与喹诺酮核形成m3→m 发光配合物。王磊等人用荧光分析法测定诺氟沙星胶囊的含量,加入了1.6E-4mol/L Tb3 +溶液和pH=6.0的HOAc/NH4OAc 缓冲溶液,在日立850 型荧光分光光度计上,λex 330nm ,λem 545nm处测定其相对荧光强度。此方法具有线性范围宽,灵敏度高,简便,快速等特点。

3、胶束增敏荧光分析法

胶束增敏荧光分析法是在胶束溶液中进行的荧光分析法，胶束溶液对极性较小的弱荧光物质有增溶作用，对荧光物质的荧光发射有增敏增稳作用。因此，对某些不发荧光或荧光很弱的药物无法进行直接荧光分析法测定时，可通过加入某些增溶增敏试剂来增强药物的荧光，提高药物分析的灵敏度，如加入CT-MAB,SDS,CPB,PVA等表面活性剂。

4、化学引导荧光分析法

化学引导荧光分析法是利用化学反应（氧化还原反应、络合反应、光化反应、化学衍生、颜色反应等）改变药物的荧光特性，使药物产生荧光或提高其荧光强度。

5、荧光探针分析法

以稀土离子、荧光分子等和药物作用的荧光探针技术，大大拓宽了荧光分析法在药物分析中的应用范围，显著提高了荧光分析的灵敏度和选择性。对荧光探针研究已有综述。凌连生等综述了脱氧核糖核酸（DNA）荧光探针的研究进展。林章碧等综述了以纳米粒子作为荧光探针在生物分析中的应用。王磊等以铽离子作为荧光探针测定了尿样中痕量的环丙氟哌酸。赵长春等研究了小蘖碱的特殊的荧光性质。王敏等用荧光探针分析法研究了缩氨基硫脲类钯抗癌配合物的初步筛选与作用机理。

6、荧光猝灭分析法

对有些药物可利用其对某一特定体系的荧光猝灭作用而进行定

量测定。庞志功等利用苦参碱和氧化苦参碱对荧光试剂乙酸乙烯酯的定量猝灭作用，建立了测定苦参碱和氧化苦参碱的荧光分析方法。杜黎明等研究了氯苯胺酸与洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星发生的荷移反应，并对这4种药物进行了定量分析。此外，荧光猝灭法还用于分析羟基苯丙酮酸、甲硝唑等药物的含量。

7、几种新型荧光分析技术

（1）导数荧光分析法

利用导数荧光光谱法进行物质测定的方法称为导数荧光分析。导数荧光分析可以提高光谱精细结构的分辨能力，减小光谱干扰。所以，导数荧光分析的抗干扰能力强，应用于多组分混合物分析可不经分离而直接进行荧光测定。该方法已用于维生素B、氧氟沙星对映体、环丙沙星等药物的定量测定。

（2）同步荧光分析法

当一些化合物的激发波长和发射波长存在比较大的差距时，应用同步荧光技术能有效降低散射峰的干扰。同时，对激发和发射光谱同步扫描，对描出的图谱进行微分处理，使重叠的峰彼此分离，可得到较可靠的测量结果。同步荧光分析法与导数荧光分析法联用能取得较高的灵敏度，如用同步--导数荧光光谱法测定尿样中的痕量左氧氟沙星和洛美沙星，检出限分别可达0.3,0.35mg/L。

【二】荧光光度分析法在药物分析中的应用

荧光分析法在药物分析中主要用于微量或痕量物质的定性和定量测定,尤其是中药有效成分的检测,在这个领域上的探讨也越来越多,近几年也有报道用于测定脂质体的包封率。但是荧光分析的干扰因素较多,测定时对环境因素敏感,对实验条件要求严格,因此荧光分析法在药物分析中的应用不够广泛,远少于紫外--可见分光光度法。因为中药的化学成分复杂,有效成分难以确定,仅单方制剂亦为一多种成分的混合物,因此要求更严格和更先进的分离、分析手段进行鉴别和含