核酸分子杂交技术与应用综述样本

核酸分子杂交技术与应用综述

摘要核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它是基于DNA分子碱基互补配对原理, 用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形式的不同能够分为液相杂交、固相杂交、原位杂交, 而固相杂交又能够分为菌落杂交、点/狭缝杂交、 Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。各类型杂交稻基本原理和步骤是基本相同的, 只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。

关键字核酸分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交应用

本文是对分子杂交技术的原理和类型分类及其应用的一篇综述。旨在了解各种杂交类型的应用方向, 即在生物、医学上的应用。

一、核酸分子杂交原理

DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构, 维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。在一定条件下, 双螺旋之间氢键断裂, 双螺旋解开, 形成无规则线团, DNA分子成为单链, 这一过程称作变性或融解。加热、改变DNA融解的pH 值, 或有机溶剂等理化因素, 均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降, 沉降速度增加, 浮力上升, 紫外光吸收增加。在温度升高引起的DNA变性过程中, DNA的变性会在一个很狭窄的

温度范围内发生, 这一温度范围的重点被称作融解温度T

m 。T

m

值得大小取决于核酸分子的G-C

含量, 核酸分子的G-C含量越高, 其T

m

值越高。因为G-C碱基之间有三个氢键, 而A-T碱基之间只有两个氢键。变性DNA只要消除变性条件, 具有碱基互补的单链又能够重新结合形成双链, 这一过程称作复性。根据这一原理, 将一种核酸单链标记成为探针, 再与另一种核酸单链进行碱基互补配对, 能够形成异源核酸分子的双链结构, 这一过程称作杂交( hybridization) 。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补, 因此不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就能够形成杂交体。

二、核酸分子杂交类型

( 一) 固相杂交

固相杂交是把欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上, 再与溶解于溶液中的杂家探针进行反应, 杂交结果可用仪器进行检测, 但大多数情况下直接进行放射自显影, 然后根据自显影图谱分析杂交结果。

1、菌落杂交

用于重组细菌克隆筛选的固相杂交, 称作菌落杂交。主要步骤包括菌落平板培养、滤膜灭菌后放到细菌平板上, 使菌落粘附到滤膜上, 将滤膜放到经适当溶液饱和度吸水纸上, 菌斑溶解产生单链的DNA, 固定DNA用32P标记的单链探针与菌落DNA进行杂交。杂交后, 洗脱未结合的探针, 将滤膜暴露于X线胶片进行放射自显影。将自显影胶片、滤膜、培养平板比较就能够确定阳性菌落。

2、Southern杂交

Southern杂交是从环境样品中提取细菌总DNA, 用适当的限制性核酸内切酶切割, 经凝胶电泳分离后, 将凝胶中的条带转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上, 然后对该膜进行探针检测的方法。只有含有靶DNA序列的DNA分子才能与特定的核酸探针进行杂交。Southern杂交主要用于研究某些细菌多态性变化规律。

3、Northern印记杂交

Northern印记杂交和Southern印记杂交的过程基本相同, 区别在于靶核酸是RNA而非DNA。RNA在电泳前已经变性, 进一步经历变性凝胶电泳分离后, 不再进行变性处理。在Northern杂交中所使用的探针常常是克隆的基因。