核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定一一紫外吸收法［原理］核昔、核昔酸、核酸的组成成分中都有瞟吟.嚅嗖疏基，这些戚基都具有共觇双键 (-C-C=C-C=C-),在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的•摩尔消光系数e (P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的e (P)260nm ()为7 700〜7 800, R7A 的含鱗量约孰 因此每亳升溶液含1 P g RNA 的光吸收值 相当于〜。
小牛胸腺D7A 钠盐的£ (P) 260nm ()为6 600,含磷量为％因此每亳升溶液含 lug DNA 钠盐的光吸收值相当于。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度 显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅 为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核 酸制品中混有大疑的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能 用紫外吸收值作定量测定。
从也/ A 珈的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的 W 仏鼻；DNA 的 W A 网工。
当样 品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于和时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
［方法和步骤］11、测定 取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入DNA/RNA 样液，然后向甲管加入蒸馆水，向乙 管加入过氯酸-钥酸枝沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min,使沉淀完全。
3000r/min 离心lOmin, 各吸取上清液转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mLo 以蒸徭水作空白对照，使用紫外 光度计分别测定上述甲乙两稀释人缈值。
紫外吸收法测定核酸含量
思考题
1．干扰本实验的物质有哪些？ 2. 设计排除这些干扰的实验。
0.024──每毫升溶液内含1μ gRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
在本实验中，1项
1. 紫外分光光度计使用前要预热。
2. 比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。
3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须 从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然 后将转速打到最低。
4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
实验十六 紫外吸收法测定核酸含量
目的要求 学习紫外线（UV）吸收法 测定核酸浓度 的原理。
实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有 吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸 的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升 溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值） （表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以 计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅 速，并对被测样品无损，用量也少。
试剂和器材
• 试剂：
• 材料
• 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取 3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼 酸铵溶于96.4mL蒸馏水中， 即成0.25%钼酸铵－2.5%过 氯酸溶液。
酵母RNA干粉。
请节约使用。 每八个同学用一份， 即50 ml/8人
高中生物 实验五、核酸定量测定
设波长，置空白，调零，置“吸光度”，读出样品吸光度 ↓
重复上步读出各标准溶液吸光度 ↓
以各样品中已知含量及读得吸光度绘制坐标图，并画出相关 最佳的曲线
↓ 读未知样品的吸光度，在曲线表上找出对应浓度
标准曲线的制作 表5-1
试管
1
标准DNA溶液（mL） 0
蒸馏水（mL）
5
DNA浓度(ug/ml) 0
A260
0
2 3 4 5 67 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4
混匀后以1号试管为空白在260nm处测定光吸收值A，以标准DNA 溶液的浓度为横坐标、A为纵坐标在坐标纸上绘制出标准曲线，
它是一条直线。
2、核酸最大紫外吸收波长（λｍ）的确定：
以上5-1表中的７号试管为测定对象，以1号试管 为空白，在240～290nm范围内每隔10nm分别 测定光吸收值A。注意，每次换了波长之后都需 要用空白重新调校“0％T”和 “100％T”。以A 为纵坐标、λ（nm）为横坐标作一条平滑曲线， 找出最高峰处所对应的波长λｍ。
3、样品测定
取一支试管，编号8，加入6mL左右待测的DNA 溶液，仍以1号试管为空白，分别在260nm和 280nm处测定其光吸收A，用A260在标准曲线上 查出DNA溶液浓度C1
根据公式计算出待测DNA溶液的浓度C2 （g/mL）。
根据A260/A280的值来判断该待测的DNA样品是否 纯净。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性 核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将 样品配制成一定浓度的溶液(20～ 50ug/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。
核酸含量实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸含量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸含量测定中的应用。
3. 通过实验操作，提高实验技能和数据分析能力。
二、实验原理核酸是一类重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
核酸含量的测定对于生物学研究具有重要意义。
本实验采用紫外分光光度法和定磷法两种方法测定核酸含量。
1. 紫外分光光度法核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，在紫外光照射下具有特定的吸收峰。
通过测定核酸溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出核酸含量。
2. 定磷法核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为5%，DNA中含磷量为9%。
通过测定核酸溶液中磷的含量，可以推算出核酸含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料核酸样品、标准核酸溶液、标准磷溶液、定磷试剂、浓硫酸、蒸馏水、移液管、容量瓶、试管、紫外分光光度计、电炉、水浴锅等。
2. 实验仪器紫外分光光度计、电子天平、移液器、试管架、试管、烧杯、滴定管、酒精灯、玻璃棒等。
四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸溶液：准确称取一定量的核酸样品，用蒸馏水溶解并定容至一定体积。
（2）测定吸光度：取一定量的核酸溶液，在特定波长下测定吸光度。
（3）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。
2. 定磷法测定核酸含量（1）配制核酸溶液：同紫外分光光度法。
（2）消化：将核酸溶液加入浓硫酸，在电炉上加热至有机物分解，冷却后定容。
（3）测定磷含量：取一定量的消化液，加入定磷试剂，在特定波长下测定吸光度。
（4）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定核酸含量根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。
2. 定磷法测定核酸含量根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意避免核酸样品的污染，保证实验结果的准确性。
2. 紫外分光光度法和定磷法各有优缺点，在实际应用中可根据具体情况选择合适的方法。
核酸的含量测定I——紫外吸收法
实验35 核酸的含量测定Ｉ——紫外吸收法一、 目的和要求1、 学习紫外吸收法测定核酸含量的原理。
2、掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法。
二、 实验原理DNA 和RNA 都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm 波长处。
紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的性质。
核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用ɛ（P ）表示。
ɛ（P ）为每升溶液中含有1摩尔核酸磷时的吸光度（即光密度，或光吸度）。
RNA 的ɛ（P ）260nm （pH7）为7700~7800，RNA 中磷的质量分数约为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0μg RNA 的吸光度为0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ɛ（P ）260nm （pH7）为6600，含磷的质量分数为9.2%，因此每毫升溶液中含1.0μg DNA 钠盐的吸光度为0.020。
不同形式DNA 紫外吸光度不同，因为DNA 具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使DNA 变性，则出现ɛ（P ）260nm 值升高的增色效应现象。
在核苷酸量相同的情况下，ɛ（P ）260nm 有以下关系：单核苷酸＞单链DNA ＞双链DNA 。
DNA 变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外吸光度增加，还可根据DNA 溶液在260nm 出吸光度的变化监测DNA 变性情况。
变性ＤＮＡ复性后，ɛ（P ）260nm 值降低，称为减色效应。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。
蛋白质的吸收峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸光度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
ＲＮＡ在260nm 与280nm 处的吸光度的比值在2.0以上，DNA 在260nm 与280nm 处的吸光度的比值为1.9左右。
当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。
紫外吸收发测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3ng/L 的检测水平。
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于～。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （）为6 600，含磷量为%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥；DNA 的A 260/ A 280≥。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于和时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 DNA/RNA 样液，然后向甲管加入蒸馏水，向乙管加入过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。
实验一 酵母RNA的提取及含量测定(紫外吸收法)
实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验是最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。
向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA 和蛋白质。
上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。
核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。
遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。
所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。
核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。
实验九紫外分光光度法测定核酸的含量
学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定
操作步骤
准备标准品、未知样品和空白对照；按照仪器操作说明调整波长、设置测量模 式；将标准品和未知样品分别放入样品池；记录吸光度值；根据标准品的标准 曲线计算未知样品的核酸含量。
02
核酸在260nm波长处有最大吸收 峰，这是核酸特有的吸收峰，可 用于核酸的定量分析。
核酸的紫外吸光度与浓度的关系
随着核酸浓度的增加，吸光度也相应 增加。
在一定浓度范围内，吸光度与核酸浓 度呈线性关系，可以用于定量分析。
核酸含量计算公式及注意事项
核酸含量计算公式：核酸浓度（μg/mL） = (A / V) / (1000 × L) × (100 / S)
其中，A为吸光度值，V为样品体积（mL），L 为光程（cm），S为核酸分子截面积 （cm²/μg）。
注意事项
实验过程中要保持光程一致，以减小 误差。
实验过程中要避免样品污染，以免影 响实验结果。
对于不同来源和性质的核酸样品，可能需要采 用不同的实验条件和标准曲线进行定量分析。
03
实验步骤
样品制备
实验结论
根据实验结果和分析，得出实验结论，总结实验的成功与不足之处， 并提出改进意见和建议。
05
实验总结
实验收获与体会
学会了使用分光光度计进行实验 操作。
认识到实验操作对结果准确性的 影响。
01
02
掌握了紫外分光光度法测定核酸 含量的原理和方法。
03
04
了解了核酸在紫外光下的吸收特 性。
实验 DNA的琼脂糖凝胶电泳 紫外吸收法测定核酸的含量
实验DNA的琼脂糖凝胶电泳紫外吸收法测定核酸的含量【实验预习】–凝胶电泳分为哪几种？–在常规的电泳缓冲液中（pH 约8.5），核酸分子带——电，在电场中向——极移动？–什么是琼脂糖，它随温度有怎样的变化？–影响核酸分子的迁移率的因素有哪些？–核酸在——有特征吸收峰？蛋白质在——有特征吸收峰？【实验目的】●1.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理及其操作；●2.学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。
●3.学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。
【实验原理】1. 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，基本结构是1,3连结的β-D-半乳呋喃糖和1,4连结的3,6-脱水α-L-半乳呋喃糖,在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，凝胶上具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，这是它具有多种用途的主要特征和基础可以形成。
2. DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
3.琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系：1)核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系：（1）DNA分子的大小在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。
但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。
此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值;（2）琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb)0.3 5～60 0.9 0.5～70.6 1～20 1.2 0.9～60.7 0.8～10 1.5 0.2～30.9 0.5～7 12.0 0.1～22).核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。
紫外分光光谱法和化学法测定核酸含量
紫外吸收光谱法及化学法测定核酸含量
实验原理
o 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌 呤、嘧啶碱基具有共轭双健（C＝CC＝C ），能够强烈吸收250～280nm波长的紫 外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸 收值在260nm左右。核酸、核苷酸及其衍 生物分子组成中都含有这些碱基，因而具有 吸收紫外光的作用。遵照LambertBeer定 律，可以从紫外吸收光谱的变化来测定核酸 类物质的含量。
o 当已知ε（p）时，只要将被测核酸溶液在紫外分 光光度计260nm波长处，通过光径为1cm的比色 杯，测得OD值，即可测得该核酸溶液的浓度。 o 现已知RNA的ε（p）在260nm（pH7）时为 7700～7800，RNA的磷含量约为9.5%。因此， 每毫升溶液（中性）含1μg的RNA钠盐，在 260nm波长处通过光径为1cm的比色杯时的光密 度相当于0.020～0.024
o 化学法DNA含量的的原理： o DNA在强酸条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核 糖 之间的糖苷键断裂。生成嘌呤碱、脱氧 核糖和脱氧嘧啶核苷酸。脱氧核糖在酸性条 件下脱水生成酮基戊糖，后者与二苯胺在酸 性条件下生成蓝色物质，在597nm波长处 有最大吸收。
实验器材
o 紫外分光光度计
实验方法
o 1．碱基、核苷、核苷酸的定性测定 o 现在已经知道碱基、核苷、核苷酸在一定pH值时 有4个特定的紫外光吸收值（光密度）的比值是固 定的。要鉴别测得的未知样品中这些成分，只要测 定它们在一定pH条件下如下几个特定波长 （250nm，260nm，280nm，290nm）紫外光 的吸收值（光密度），然后根据其光密度比值 （250nm/260nm，280nm/260nm， 290nm/260nm）即可鉴别碱基、核苷和核苷 酸。
核酸纯度鉴定的方法和原理
核酸纯度鉴定的方法和原理核酸纯度鉴定是在实验室中常用的核酸质量控制方法之一。
在进行分子生物学研究、基因克隆、PCR反应、基因测序等实验过程中，准确评估核酸的纯度是确保实验结果准确可靠的重要步骤。
核酸纯度的鉴定方法主要包括比色法、比浊法、紫外吸收光谱法等。
其中，紫外吸收光谱法是最常见且最常用的一种方法。
紫外吸收光谱法是利用核酸在紫外光（200-300 nm）波长范围内的特征吸收来评估核酸的纯度。
纯的核酸在260 nm处有一个最大吸收峰，而蛋白质、有机物等可能存在的污染物则往往在280 nm处有吸收峰。
因此，通过测量核酸在260 nm 和280 nm处的吸光度比值（A260/A280），可以初步判断核酸的纯度。
一般来说，纯度良好的DNA样品的A260/A280比值应在1.8-2.0之间，而纯度良好的RNA样品则应在1.9-2.1之间。
除了A260/A280比值，还有一个常用的指标是A260/A230比值。
这个比值是衡量核酸样品中存在的有机物污染程度的指标。
在制备核酸样品时，常常会使用一些试剂，如酚/氯仿、异丙醇等，这些试剂残留在核酸样品中会导致A260/A230比值下降。
一般来说，纯度良好的DNA样品的A260/A230比值应在2.0-2.2之间，而纯度良好的RNA样品则应在2.0以上。
此外，可以通过琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等方法进一步鉴定核酸纯度。
这些方法可以更加精确地确定核酸样品中的杂质含量，并进一步评估核酸的质量。
综上所述，核酸纯度鉴定的方法主要包括紫外吸收光谱法，通过测量A260/A280和A260/A230比值来初步评估核酸的纯度。
此外，还可以采用其他分析方法，如凝胶电泳、高效液相色谱等，来进一步确定核酸纯度。
这些方法的应用可以确保实验结果的准确性，并为后续实验提供良好的实验基础。
实验二 紫外吸收法测定 DNA 的含量
实验二紫外吸收法测定DNA 的含量生命科学学院——齐向英紫外法测定核酸的含量，操作简便、快速、灵敏、用量少、对样品无损害，是一种常用的核酸测定方法。
一、实验原理DNA 和RNA 都有吸收紫外光的性质，它们的最大吸收峰在波长260 nm 处。
这是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，凡是含有嘌呤和嘧啶的一切物质，不论是核苷、核苷酸，均具有吸收紫外光的特性。
核苷和核苷酸的摩尔消光系数ε(P)(或吸收系数)表示为: 每升溶液中含有 1 mol 原子磷的消光值(即光密度或称光吸收值)。
RNA 的ε(P)260 nm (pH 7.0)为7700～7800。
RNA 的含磷量约9.5 % ，因此，每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.024。
计算如下:原子磷量: 1 mol / L = 31 g / 1000 mL = 31 mg / mL(磷相对原子质量：31)RNA 量: 31 mg / mL÷9.5 % = 330 mg / mL1 mg / mL RNA 的光吸收值: 7800÷330 = 241μg / mL RNA 的光吸收值: 0.024再如，小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P)2 60 nm (pH 7.0)为6600，含磷量为9.2 % ，因此，每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值为0.020。
由于蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，因此，也具有吸收紫外光的特性。
通常蛋白质的最大吸收峰在波长280 nm 处，而在260 nm 处的吸收值仅是核酸的 1 / 10 或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时，用紫外法测定核酸含量的影响不大。
RNA 的260 nm 与280 nm 的光吸收比值在 2.0 以上，DNA 的260 nm 与280 nm 光吸收的比值在1.9 左右。
当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。
二、器材与试剂(一)、器材25 mL、50 mL容量瓶，离心机，紫外分光光度计。
紫外吸收法测定核酸的含量
实验名称紫外吸收法测定核酸的含量（4课时）一、实验目的：学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理，熟悉紫外分光光度计的使用方法。
二、实验原理：核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C-C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。
核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。
根据Lambert-Beer 定律，在一定范围内，样品的紫外光吸收值与核酸含量成正比。
三、实验仪器、试剂和材料：1.仪器：分析天平、紫外分光光度计、冰或冰箱、离心机、离心管（10mL）、烧杯（10mL）、容量瓶（50mL、100mL）、移液管（0.5ml、2mL 和5mL）、药勺和玻璃棒、试管和试管架2.试剂和材料：核酸样品（DNA或RNA）、5%-6%氨水、沉淀剂（钼酸铵-过氯酸试剂）四、实验步骤1.核酸样品纯度的测定（1）准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用5%-6%氨水调至pH7.0,定容至50mL.此溶液为待测样品溶液。
（2）取两支离心管，甲管内加入待测样品溶液2mL和蒸馏水2mL；乙管内加入2mL 样品溶液和2mL 沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。
混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min，3 000r/min 离心10min。
从甲、乙两管中分别取上清液0.5mL，用蒸馏水定容至50mL.选用光程为1cm 的石英比色杯，测定260nm 下的吸光度值。
（3）计算DNA （或RNA）纯度按下式计算：2.核酸溶液含量的测定当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm 处吸光度作为对照。
（1）取2 支离心管，每管各加入待测的核酸溶液2mL，再向甲管内加2mL 蒸馏水，向乙管内加2mL 沉淀剂。
混匀，在冰浴（或冰箱）中放置10min，3 000r/min 离心10min。
核酸含量的测定
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
12
思考题
1. 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 酸度对测定结果的影响。
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实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。
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用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
3
还原产物钼蓝在波长660nm测定 吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA 的含磷量平均为9.9%。
4
试剂
酵母RNA样品溶液：2000μg/mL
标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取 15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果 变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
含有核苷酸的核酸-紫外分光光度法测定
含有合核苷酸杂质的核酸含量测定凡文一、原理：DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。
吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。
RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700—7800。
RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022—0.024。
小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。
通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。
当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
具体如下：DNA样品：OD260/OD280≈1.8 DNA纯净＞1.9 RNA含量高＜1.7 蛋白质含量高RNA样品：OD260/OD280≈2.0 RNA纯净＞2.2 RNA已降解＜1.7 蛋白质含量高钼酸铵-过氯酸能够与核酸作用形成沉淀，通过离心可以将其沉淀到离心管底部，上清液的OD260反映出核苷酸的含量。
（也可以采用酸性乙醇进行沉淀核酸，详细方法原理参见参考资料[3]）二、器材与试剂：1．器材：容量瓶（50毫升）、离心管、离心机、紫外分光光度计、石英比色皿、微量移液枪、1.5ml Eppendorf管、枪头（灭菌）、烧杯。
2．试剂：①钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液]：取3.6毫升70%过氯酸和0.25克钼酸铵溶于96.4毫升蒸馏水中。
核酸鉴定的三种方法
核酸鉴定的三种方法一、紫外吸收法。
1.1原理。
核酸中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，在260nm波长处有强烈的紫外吸收。
这就像是核酸有一个独特的身份标识，在这个特定的波长下会被检测到。
咱们可以根据这个特性来对核酸进行定性和定量分析呢。
这就好比每个人都有自己独特的指纹，核酸在260nm处的紫外吸收就是它的“指纹”。
1.2操作及判断。
操作起来也不算复杂，把样品放到紫外分光光度计里，测定260nm处的吸光度值。
如果吸光度值在一定范围内，那就说明有核酸存在。
要是这个值比较高，那可能核酸的含量就比较多。
不过这里面也有个小问题，就是有些杂质也可能在这个波长附近有吸收，就像鱼目混珠一样。
所以这个方法虽然简单直接，但也不是百分百准确无误的。
二、琼脂糖凝胶电泳法。
2.1原理。
这就像是一场核酸分子的赛跑比赛。
琼脂糖凝胶就像跑道，核酸分子在电场的作用下在凝胶里迁移。
不同大小的核酸分子迁移速度不一样，就像短跑运动员和长跑运动员速度有差异一样。
小的核酸分子跑得快，大的跑得慢。
这样根据核酸分子在凝胶中的位置，就能判断核酸的大小和大概的纯度了。
2.2操作。
首先要制备琼脂糖凝胶，就像做蛋糕要先准备面糊一样。
然后把核酸样品和上样缓冲液混合，加到凝胶的小孔里，通上电，让它们跑起来。
等跑一段时间后，再用染料染色，这样核酸分子就像穿上了彩色的衣服，在凝胶里能清楚地看到它们的位置了。
2.3结果判断。
如果看到一条清晰的条带，那就说明核酸比较纯。
要是有拖尾或者多条带，那可能就有杂质或者核酸有降解等情况。
这就好比从一个人的走路姿势能看出他是不是健康一样，从核酸在凝胶里的条带情况能判断出核酸的质量好坏。
三、定磷法。
3.1原理。
核酸里面含有磷元素，这可是核酸的一个重要组成部分。
通过测定磷的含量，就能推算出核酸的含量。
这就像是通过数树上的果子数量来推测整棵树的产量一样。
3.2操作及注意事项。
先把核酸样品进行消化处理，让磷元素都释放出来，然后用特定的试剂和磷反应，通过测定反应产物的量来计算磷的含量。
实验一紫外分光光度法测定核酸的含量
实验一紫外分光光度法测定核酸的含量一、实验目的了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法学习使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法二、实验原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
RNA和DNA的紫外吸收高峰在260 nm波长处。
遵照有色溶液对光吸收的物理定律即Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
一般在260 nm波长下，每毫升含1μg DNA 溶液的光吸收值为0.020，每毫升含1μg RNA溶液的光吸收值为0.022。
故测定未知溶液在260 nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。
此法操作简便，迅速。
蛋白质和核苷酸等也有紫外吸收。
通常蛋白质的吸收高峰在280 nm波长处，在260 nm 处吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
RNA的260 nm与280 nm吸收比值在2.0以上；DNA的260 nm和280 nm吸收比值在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。
若样品中混有大量的蛋白质和核苷酸等紫外吸收物质时，应设法除去。
三、实验器材S54紫外分光光度计操作指南：插上电源插头，打开仪器左侧面下方的电源开关，本仪器具备计算机自检与波长及100％线自正功能，开机后显示窗两侧8灯全亮，指示灯进入自检与自校状态，约需10多分钟。
当TRANS灯亮即说明自校结束进入待机状态，可随时应用。
设定波长（本实验波长为260 nm和280 nm），按再按确认，显示窗改变波长至设定值。
推开比色室的盖子。
将空白和样品溶液分别仔细倒入特殊的石英比色皿中（倒入之前先用少量溶液润洗比色皿一次），用擦镜纸擦去比色皿表面的余液，然后将比色皿插入比色室里的卡座中，拉动卡座拉杆，将空白液的比色皿置于光路中。
按MODE键，使TRANS.透射比键灯亮，在比色室盖子关闭的状态下按一下0％T键，使显示窗中的数字为0.000。
关闭比色室的盖子，按一下100％ABS，使显示窗中的数字为100.0。
紫外吸收法测核酸浓度原理
紫外吸收法测核酸浓度原理
紫外吸收法测核酸浓度是一种常用的实验技术，其原理基于核酸在紫外光区域的吸收特性。
核酸分子中含有大量的连接在一起的碱基对，这些碱基对能够吸收紫外光。
在紫外光区域，核酸的吸收峰位于260纳米。
当一束紫外光通过含有核酸的溶液时，溶液中的核酸分子会吸收部分紫外光，其吸收程度与核酸的浓度成正比。
通过使用特定波长的紫外光源，如260纳米的波长，可以测量核酸溶液的吸收强度。
通过测量吸收的光强，可以根据比例关系计算出核酸的浓度。
而核酸以外的其他杂质物质，如蛋白质和杂质核酸，也会在紫外光区域产生吸收，从而干扰核酸浓度的测量。
为了准确测定核酸浓度，实验中通常使用空白试剂作为参照。
空白试剂中不含有核酸，只含有其他溶液和杂质物质，可以用于消除这些干扰。
核酸生物化学实验技术实验
核酸生物化学实验步骤（一）酵母中RNA的提取及紫外分光光度法测定核酸浓度1．稀碱法提取酵母中RNA实验原理：基于核酸不溶于乙醇。
先用稀碱将酵母细胞裂解，采用酸中和，通过离心去除菌体细胞的大碎片，采用乙醇可将上清液中的RNA沉淀出来。
该方法提取的核酸分子为变性失活的RNA。
操作方法：（1）称取2 g干酵母粉，放入100 mL烧杯中，加入20 mL 的1%氢氧化钠水溶液，搅拌30 min （玻璃棒手动充分搅拌）。
（2）30 min后，向（1）中加入少量乙酸调节pH至中性（切忌调节pH低于3，RNA的等电点2-2.5），试纸检查。
（3）将（2）全部转移至离心管中，3800 rpm离心10 min（最大装液量离心管体积的三分之二，等分两个离心管进行离心）。
弃沉淀（主要是细胞壁等碎片），留上清（含有RNA）。
（4）将上清液转移至干净的100 mL烧杯中，加入15 mL 95%的乙醇，充分混匀，静置10 min。
（此时，大部分RNA沉积于烧杯底部，转移时需要搅动，以免丢失RNA。
因此该步骤也可将上清液直接转移到离心管，静置10 min是必要的）（5）将（4）转移至离心管，3800 rpm离心5 min（一次离心管装不下，分两次离心），弃掉上清液，用95%乙醇重悬，离心洗涤2次，每次95%乙醇用量5 mL。
（6）将洗涤后的样品转移至干净的表面皿（已称重）上，95℃水浴蒸汽干燥（约10 min左右），称重计算干酵母中RNA含量。
干酵母中RNA含量(%)=提取的RNA重量（g）干酵母重量（g）×100%2．紫外吸收法测定提取RNA干粉中核酸含量实验原理：核酸分子在260 nm处具有特异性吸收峰试验方法：（1）称取实验1中提取的RNA干粉20 mg，加入少量0.5 mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，然后加入去离子水，用50 mL容量瓶定容，（2）以去离子水做空白，测260 nm处的吸光度（A），计算提取的RNA干粉中核酸含量。
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核酸含量的测定——紫外吸收法
[原理]
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]
1、测定
取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。
2、计算
试液中DNA / RNA 总含量按下式计算：
D V A A g DNA ⨯⨯-=
总乙甲020.0)(660660μ D
V A A g RNA ⨯⨯-=总乙甲022.0)(660
660μ
式中 甲A 260——被测稀释液在260nm 处的总光密度值；
乙A 260——加沉淀剂除去大分子核酸后被测稀释液在260nm 处的光密度值； 两者之差（甲A 260 －乙A 260）为被测稀释液的光密度值；
V B ——被测试液总体积（mL ）
D ——样液的稀释倍数。
0.020——脱氧核糖核酸的比消光系数，即每毫升含1μgDNA 钠盐的水溶液（pH 为中性）在260nm 波长处，通过光径为1cm 时的光密度值。
0.022——核糖核酸的比消光系数，是浓度为1mg/L 的核糖核酸水溶液（pH 为中性）在260nm 波长处，通过光径为1cm 时的光密度值。
由于大分子核酸易发生变性，此值也随变性程度不同而异，因此一般采用比消光系数计算得到DNA 或RNA 量是一个近似值。