核酸含量的测定——紫外吸收法

核酸含量的测定——紫外吸收法

[原理]

核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。

核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。

测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。

蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。

从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。

pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。

本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。

[方法和步骤]

1、测定

取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。

2、计算

试液中DNA / RNA 总含量按下式计算：

D V A A g DNA ⨯⨯-=

总乙甲020.0)(660660μ D

V A A g RNA ⨯⨯-=总乙甲022.0)(660

660μ

式中 甲A 260——被测稀释液在260nm 处的总光密度值；

乙A 260——加沉淀剂除去大分子核酸后被测稀释液在260nm 处的光密度值； 两者之差（甲A 260 －乙A 260）为被测稀释液的光密度值；

V B ——被测试液总体积（mL ）

D ——样液的稀释倍数。

0.020——脱氧核糖核酸的比消光系数，即每毫升含1μgDNA 钠盐的水溶液（pH 为中性）在260nm 波长处，通过光径为1cm 时的光密度值。

0.022——核糖核酸的比消光系数，是浓度为1mg/L 的核糖核酸水溶液（pH 为中性）在260nm 波长处，通过光径为1cm 时的光密度值。

由于大分子核酸易发生变性，此值也随变性程度不同而异，因此一般采用比消光系数计算得到DNA 或RNA 量是一个近似值。