乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定试剂盒说明书
猪乙酰胆碱(ACh)ELISA试剂盒
猪乙酰胆碱(ACh)ELISA试剂盒操作方法猪乙酰胆碱(ACh)ELISA试剂盒供应商：上海樊克生物有限公司规格：96T/48T。
用途：科研实验等领域科学研究，不得用于临床诊断。
保存条件及有效期：试剂盒保存：2-8℃| 有效期：6个月【猪乙酰胆碱(ACh)ELISA试剂盒】本试剂仅供研究使用计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒组成：封板膜:2片（48）/2片（96）说明书:1份密封袋:1个标准品：2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液:（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存【猪乙酰胆碱(ACh)ELISA试剂盒】实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人铁蛋白(FE) 水平。
用纯化的人铁蛋白(FE) 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入铁蛋白(FE) ，再与HRP标记的铁蛋白(FE) 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的铁蛋白(FE) 呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人铁蛋白(FE) 浓度。
胆碱酯酶活性测定试纸干化学法使用说明书
胆碱酯酶活性测定试纸（干化学法）使用说明书【产品名称】通用名：胆碱酯酶活性测定试纸（干化学法）【包装规格】1人份/袋、10-100袋/盒；25人份/筒、50人份/筒、1-20筒/盒。
【预期用途】用于体外定性检测人血清、血浆中胆碱酯酶活性。
【检验原理】胆碱酯酶催化水解乙酰胆碱（Ach）生成乙酸和胆碱，乙酸能使指示剂溴百里香酚蓝（BTB）发生颜色变化，通过颜色的改变反映生成乙酸的量，乙酸量的多少即可表示酶活力的高低；反应结果可与胆碱酯酶活性测定比色表直接进行比色测定。
【主要组成成份】本产品系由20%乙酰胆碱(Ach)、3%溴百里香酚蓝等试剂固定在通过双面胶粘贴有中速滤纸的PVC板上，干燥后裁切成胆碱酯酶活性测定试纸。
【储存条件及有效期】在2-30℃干燥、阴凉、无酸碱腐蚀的条件下密封保存，有效期二年。
试纸开封铝箔袋后在无酸碱腐蚀的条件下可保存3小时，有酸碱腐蚀的条件下开封即用。
【样本要求】1、在无菌条件下采集静脉血样本，尽快分离血清或血浆以避免溶血。
2、检测时应使用新鲜标本。
3、常规抗凝剂不影响检测结果。
【检验方法】在进行测试前必须先完整阅读使用说明书。
1、取测定试纸一片，放在培养皿中，向反应纸片中央加上8～10μl待测新鲜血清或血浆，盖上培养皿盖保持密封（保持一定的湿度以防血清蒸发，同时防外界酸碱影响），放置37℃水浴箱中并开始记时。
2、11分30秒后取出，所呈现色泽与胆碱酯酶活力比色表(见图一)比较，即得胆碱酯酶活力单位。
3、如无水浴箱，根据测定时室温，查附表确定反应所需时间，在到达反应所需时间后立即比色。
4、正常值30-80单位，如低于30单位的标本，欲求得较精确的结果，可将时间延长一倍，再观察结果。
附表：20～40℃内反应终点时间表温度(℃) 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 时间22′15″21′19′45″18′45″17′45″16′45″16′15″15′45″15′15″14′45″14′15″温度(℃) 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40时间14′13′30″13′12′30″12′15″12′11′30″11′15″10′45″10′30″【检验结果的解释】阳性：胆碱酯酶活力单位小于30。
胆碱酯酶(ChE)检测试剂盒(羟胺氯化铁比色法)
胆碱酯酶(ChE)检测试剂盒(羟胺氯化铁比色法)简介：胆碱酯酶(cholinesterase，ChE)属于特异性酯酶，可分为两大类。
一类是乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase，EC 3.1.1.7, AChE)又称为真性胆碱酯酶，能水解乙酰胆碱，起到生理的调节作用；另一类为胆碱酯酶，又称假性胆碱酯酶(Pseudo cholinesterase，3.1.1.8，PsChE)或拟胆碱酯酶，能水解胆碱的酯而不能水解乙酰胆碱酯。
乙酰胆碱酯酶主要存在于神经元的胞质内、神经与肌肉接头处即所谓运动终板处；PsChE主要存在于血浆、胰腺、唾液腺内，生理功能尚不明确。
测定胆碱酯酶可以判断有机磷中毒的程度，鉴定遗传性胆碱酯酶变异，肝实质性损害程度。
Leagene胆碱酯酶(ChE)检测试剂盒(羟胺氯化铁比色法)其检测原理是待测样品中的胆碱酯酶能催化乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。
剩余的乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酸羟胺，后者与三价铁离子结合生成呈棕色复合物，通过分光光度计检测吸光度，根据标准曲线即可测出ChE活力。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、蒸馏水2、离心管或小试管3、水浴锅4、离心机5、比色杯6、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TE021350TStorage试剂(A): ChE buffer Ⅰ16ml 4℃避光试剂(B): ChE buffer Ⅱ2ml 4℃避光试剂(C): ChE buffer Ⅲ2ml RT试剂(D): 羟胺溶液10ml 4℃避光试剂(E): 羟胺缓冲液10ml RT试剂(F): ChE酸化液40ml RT试剂(G): ChE显色液50ml RT 避光使用说明书1份1、准备样品：①血浆、血清样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定，-70℃冻存，用于ChE的检测。
②细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行匀浆，低速离心取上清，-70℃冻存，用于ChE的检测。
乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书
乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书人胆碱乙酰化酶(CHAc)ELISA试剂盒说明书本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中CHAc含量。
实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CHAc抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CHAc抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的CHAc呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板:一块(96孔)2. 标准品(冻干品): 2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/ml，做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成10 ng/ml，5 ng/ml，2.5ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。
如配制5 ng/ml标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 10 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液:1×20ml。
4. 检测稀释液A:1×10ml。
5. 检测稀释液B:1×10ml。
6. 检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。
乙酰胆碱酯酶实验方案
大豆肽乙酰胆碱酯酶抑制活性实验乙酰胆碱酯酶（AchE）是老年痴呆疾病阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s Disease,AD）的一个酶抑制剂作用靶点。
乙酰胆碱酯酶浓度过高，催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱过度的缺失，直接造成神经信号传递失败，引起老年痴呆症。
在以往的研究中，已经被证明发酵豆腐乳中具有ACHE的抑制活性，大豆异黄酮（染料木素、山奈酚、大豆素）也具有抑制活性，但是大豆蛋白不具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。
本次实验旨在检测大豆肽中是否具有乙酰胆碱酯酶抑制活性肽，如果具有，则可证明大豆肽具有保护大脑神经记忆的作用，同时也可以进行接下来的实验，利用层析分离大豆肽，找出具有活性的具体肽，鉴定其结构，人工合成此肽，检验活性。
1实验原理根据Ellman的方法，底物碘代硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AchE)作用下分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成在405nm处有光吸收的黄色物质，在酶催反应的稳态阶段其OD值即可代表起始反应速率。
O+AchE→Acetyrate+ThiocholineAcetylthiocholine+H2Thiocholine+5’5’-thiobis-2-nitrobenzoic acid→5-thio-2-nitrobenzoic acid2实验材料与仪器2.1实验材料磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成0.1M的PBS磷酸缓冲液。
乙酰胆碱酯酶(AchE)：冻干粉溶于PBS中，配成4.3U/ml溶液。
DTNB：溶于PBS中，配成756uM的溶液。
碘代硫代乙酰胆碱(ATch)：溶于PBS中，配成0.3mM的溶液。
2.2实验仪器酶标仪、96孔板3实验步骤3.1实验样品阴性对照组、阳性对照组、产品对照组、大豆肽原液、0~1000u、1000~3000u、3000~10000和10000~30000共八组，每组做五组平行实验取平均值。
胆碱酯酶(CHE)测定操作规程
胆碱酯酶（CHE）测定操作规程一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中胆碱脂酶（CHE）的活性。
二、临床意义（一）概述胆碱脂酶可以分为乙酰胆碱酯酶和假性胆碱酯酶，前类亦称真性胆碱酯酶，主要存在于胆碱神经末梢突触间隙。
乙酰胆碱酯酶可以在神经末梢、效应器接头或突触间隙等部位终止乙酰胆碱作用。
（二）临床意义1. 病理性升高：肾病综合征，甲状腺功能亢进，糖尿病，脂肪肝，原发性家族性高CHE血症，血清CHE变异，原发性肝癌等。
2. 病理性降低：重症肝炎，慢性肝炎活动型，肝硬化，肝脓肿，各种癌，低蛋白血症(营养不良，贫血，感染，皮肌炎，急性心肌梗死)，遗传性血清CHE异常症，有机磷中毒(轻度中毒降低30%，中度中毒降低50%，重度中毒降低70%)，溃疡性结肠炎，肾功能不全，天疱疮，烧伤等。
（三）检验原理胆碱酯酶催化S-碘化丁酰基硫代胆碱水解，生成丁酸与硫代胆碱，硫代胆碱与黄色的铁氰化钾[Fe(CN)6]3-反应后形成无色的[Fe(CN)6]4-，在405nm吸光度下降的速率与标本中胆碱酯酶活性成正比。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
CHE测定样品为不溶血的血清、血浆（肝素抗凝）。
样品应在低温条件下运输并及时测定。
不能使用EDTA抗凝剂的标本。
五、试剂（一）试剂组成不同批号试剂中各组份不能互换。
（二）试剂准备R1和R2试剂为即用型液体试剂，开瓶装载即可使用，用后应及时冷藏保存。
（三）试剂的保存及稳定性1. 不能冰冻试剂。
2. 未开瓶的R1和R2试剂应在2～8℃密闭避光贮存，稳定期为瓶签标示的有效期。
乙酰胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性的测定
乙酰胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性的测定全血胆碱酯酶活性的测定——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。
2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。
3. 学会末梢血的采集。
实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。
未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。
颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。
在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。
试剂和材料蒸馏水分光光度计盐酸溶液(1＋2) 10mL比色管碱性羟胺溶液漏斗磷酸盐缓冲液(PH＝7.20) 恒温水浴箱，控温±0.5℃三氯化铁溶液采血针头氯化乙酰胆碱标准液血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴+1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min + 1.0mL 乙酰胆碱应用液30minD 空白管 1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴+1.0mL水37℃水浴30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇2min；2.加入2.0mL 盐酸溶液，充分振摇2min；3.加入2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。
实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B C D吸光度0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得：Xs=0.538+0.003-0.299⨯7=3.149μ0.538molXs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL37℃30min)；A：试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；以B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。
y乙酰胆碱酯酶染色
y乙酰胆碱酯酶染色
乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）染色是一种用
于观察神经元和突触前膜上的乙酰胆碱酯酶活性的染色方法。
乙酰
胆碱酯酶是一种重要的酶，它在神经系统中起着关键的作用，主要
负责降解神经递质乙酰胆碱，从而调节神经冲动的传递。
乙酰胆碱
酯酶染色可以通过对组织切片进行特殊处理和染色来观察乙酰胆碱
酯酶的分布和活性情况。
乙酰胆碱酯酶染色的原理是利用染色试剂与乙酰胆碱酯酶反应，形成可见的颜色变化，从而标记出乙酰胆碱酯酶的分布。
这种染色
方法通常使用乙酰胆碱酯酶的底物和染色试剂，底物在乙酰胆碱酯
酶的作用下产生可染色的产物，从而形成染色反应。
这样就可以在
显微镜下观察到乙酰胆碱酯酶的分布情况。
乙酰胆碱酯酶染色在神经科学研究中具有重要意义。
通过观察
乙酰胆碱酯酶的分布和活性，可以揭示神经元和突触前膜的结构和
功能，从而帮助科学家更好地理解神经系统的工作原理和相关疾病
的发病机制。
此外，乙酰胆碱酯酶染色也被广泛应用于临床诊断，
特别是在神经系统疾病的诊断中起着重要作用。
总的来说，乙酰胆碱酯酶染色是一种重要的实验技术，通过观察乙酰胆碱酯酶的分布和活性，可以帮助科学家深入了解神经系统的结构和功能，对神经科学研究和临床诊断都具有重要意义。
乙酰胆碱酯酶实验方案
大豆肽乙酰胆碱酯酶抑制活性实验乙酰胆碱酯酶（AchE）是老年痴呆疾病阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s Disease,AD）的一个酶抑制剂作用靶点。
乙酰胆碱酯酶浓度过高，催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱过度的缺失，直接造成神经信号传递失败，引起老年痴呆症。
在以往的研究中，已经被证明发酵豆腐乳中具有ACHE的抑制活性，大豆异黄酮（染料木素、山奈酚、大豆素）也具有抑制活性，但是大豆蛋白不具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。
本次实验旨在检测大豆肽中是否具有乙酰胆碱酯酶抑制活性肽，如果具有，则可证明大豆肽具有保护大脑神经记忆的作用，同时也可以进行接下来的实验，利用层析分离大豆肽，找出具有活性的具体肽，鉴定其结构，人工合成此肽，检验活性。
1实验原理根据Ellman的方法，底物碘代硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AchE)作用下分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成在405nm处有光吸收的黄色物质，在酶催反应的稳态阶段其OD值即可代表起始反应速率。
O+AchE→Acetyrate+ThiocholineAcetylthiocholine+H2Thiocholine+5’5’-thiobis-2-nitrobenzoic acid→5-thio-2-nitrobenzoic acid2实验材料与仪器2.1实验材料磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成0.1M的PBS磷酸缓冲液。
乙酰胆碱酯酶(AchE)：冻干粉溶于PBS中，配成4.3U/ml溶液。
DTNB：溶于PBS中，配成756uM的溶液。
碘代硫代乙酰胆碱(ATch)：溶于PBS中，配成0.3mM的溶液。
2.2实验仪器酶标仪、96孔板3实验步骤3.1实验样品阴性对照组、阳性对照组、产品对照组、大豆肽原液、0~1000u、1000~3000u、3000~10000和10000~30000共八组，每组做五组平行实验取平均值。
胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性测定方法主要有以下几种常用的方法：
1. 利用酶促反应产生的色素变化测定：
(1) 比色法：将胆碱酯酶底物乙酰胆碱与碱性溴化镉等试剂反应，生成黄色产物，利用比色计或分光光度计测定产物的吸光度，间接测定胆碱酯酶活性。
(2) 荧光法：将胆碱酯酶底物与荧光染料反应，使底物和产物之间发生荧光变化，利用荧光光谱仪测定荧光强度，间接测定胆碱酯酶活性。
2. 利用电化学方法测定：常用的是反应器中使用碳电极或银电极，利用底物和产物之间的电位差变化测定胆碱酯酶活性。
3. 利用放射性同位素标记测定：将底物或产物标记上放射性同位素，通过测定放射性同位素的放射性强度，间接测定胆碱酯酶活性。
4. 利用质谱法测定：将底物和产物分离并通过质谱仪测定其质荷比，间接测定胆碱酯酶活性。
需要注意的是，不同的测定方法适用于不同的实验目的和样本类型，具体的选择应根据实验需求和设备条件来确定。
乙酰胆碱酯酶酶活测定胆碱酯酶的测定
乙酰胆碱酯酶酶活测定
胆碱酯酶的测定
胆碱酯酶（CHE）的测定
一、原理：血清及组织中CHE使乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，未被水解的剩余乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酰羟胺，再与铁离子在酸性溶液中形成棕色复合物，根据颜色深浅推算出酶的活力。
二、试剂：
1、试剂一：溶液60ml×1瓶，室温保存。
2、试剂二：乙酰胆碱粉剂×1支，-20℃保存，稀释液5ml×1瓶，4℃保存。
80μmol/ml 乙酰胆碱底物贮备液的配制：将一支乙酰胆碱碱粉剂倒入5ml稀释液中即成，4℃。
8μmol/ml乙酰胆碱应用液的配制：贮备液：试剂=1：9稀释。
3、试剂三：甲粉剂×1支；乙液30ml×1瓶；丙液30ml×1瓶；室温保存。
试剂三应用液的配制：每次测试前将甲粉倒入乙液中，充分摇匀，根据需要量将甲乙混合液
与丙液等量混合，充分混匀，配成试剂三应用液，现用现配。
4、试剂四：溶液30ml×1瓶，室温保存。
5、试剂五：溶液20ml×1瓶，室温保存。
6、试剂六：粉剂×1瓶，稀释液30ml×1瓶，测试前将稀释液倒入粉剂中，充分混匀，避光
4℃冷藏。
测各管吸光度值。
四、计算：
1、定义：血清中CHE的计算：每毫升血清在37℃和底物作用20分钟，分解1μmol乙酰胆
碱为1个活力单位。
2、计算公式：
血清中CHE活力。
鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶(ACHE)的活性测定及对有机磷农药的敏感性研究
※
２ ０ ， ｏ． ７Ｎｏ １ ７ ０６ Ｖ１ ， ．２ １ ２
鲫鱼脑 乙酰胆碱酯酶（ Ｈ ） ＡＣ Ｅ 的活性测定 及对有机磷农药的敏感性研究
刘 晓宇 － ，郝 强 － ，吴谋成 １ ，杨 健 ２ ，徐 盈 ３ （． １ 华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 ４０ ７ ： ３０ ０ ２中国水产科学研 究院淡水渔业研究 中心 ，内陆渔业环境与资源重 点开放实验室 ，江苏 无锡 ２ ４ ８ ； ． １０ １ ３中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重 点实验室 ，湖北 武汉 ． ４０ ７） ３０ ２
２ Ｋｅ ｂ ｒｔｒ ｆＥ ｏｏ ｉａ ｎ ｉ ｎ ｎ ｄＲｅ ｏ ｒｅ ｆＩｌ ｄＦ ｓ ｅ ｉｓ Ｆ ｅ ｈ ｔｒ ｉｈ ｒ ｓＲｅ ｅ ｒ ｈ ． ｙＬａ ｏ ａｏ ｙｏ ｃ ｌｇ ｃ ｌ ｖ ｒ ｍｅ ｔ Ｅ ｏ ｎ ａ ｓ ｕ ｃ ｓｏ ａ ｉｈ ｒｅ ， ｒｓ ｗａｅ ｓ ｅ ｉ ｓ ａｃ ｎｎ Ｆ ｅ
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大鼠乙酰胆碱(Ach)酶联免疫吸附测定试剂盒 使用说明书
所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意，收到试剂盒后请尽快将标准品、检
This Manual: /file/981092
测溶液 A、检测溶液 B 以及 96 孔板保存于-20 。开封后的酶标板要密封加干燥剂后保存 于-20 ，避免潮湿。有效期为 6 个月。
3、 温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体 蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应 严格遵守给定的温育时间和温度。
4、 洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程 中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要 消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。
3、 脑脊液：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。 4、 其它生物标本：请 1000 g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-
80 保存，但应避免反复冻融。 注意： 1、 以上标本均需密封保存，4 保存应小于 1 周，-20 不应超过 1 个月，-80 不应超
5、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔 10 分钟观 察一次），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪 光密度读数。
6、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
洗板方法
1、 手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少 0.4mL 注入孔内，浸泡 1-2 分钟，吸去（不 可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力 拍几次；根据需要，重复此过程数次。
检测范围：3.12 nmol/L - 200 nmol/L
胆碱酯酶活力判定标准
胆碱酯酶活力判定标准胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是一种重要的酶类物质，在生物体中具有重要的生理功能。
它主要是在神经系统中发挥作用，通过降解神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）来调节神经信号的传递。
胆碱酯酶活力的检测是评估神经系统功能的一种重要方法。
胆碱酯酶活力的检测方法包括体外测定和体内测定两种。
在体外测定中，可以通过测定样品中酶催化降解底物乙酰胆碱所生成的产物酰胆碱酸（acetic acid）的释放量，来反映胆碱酯酶的活力。
常见的体外测定方法有刺激电极法、色谱法和酶联免疫吸附法等。
体内测定是通过测定动物体内胆碱酯酶活力来评估其功能状态。
常用的体内测定方法主要包括测定血浆或血清中酶活力、组织或细胞中酶活力、脑脊液中酶活力等。
胆碱酯酶活力的正常范围因检测方法、样本来源、性别、年龄等因素而有所差异。
一般来说，胆碱酯酶活力的正常参考范围是：1. 血浆或血清中酶活力：正常成年人的胆碱酯酶活力一般在0.4-1.2 U/mL之间。
2. 组织或细胞中酶活力：胆碱酯酶在不同组织和细胞中的活力差异较大，但一般都会显示较高的活力。
3. 脑脊液中酶活力：正常成年人的脑脊液中胆碱酯酶活力一般在低微的水平。
胆碱酯酶活力的异常变化可能与多种疾病和病理状态有关。
一些疾病和药物、毒物等因素可能引起胆碱酯酶活力的增加或降低。
例如，胆碱酯酶在神经系统中的活力降低可能与阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关。
胆碱酯酶活力的增加可能与肝功能损害、某些药物中毒等有关。
此外，胆碱酯酶活力的检测在医学诊断中也具有一定的参考价值。
例如，胆碱酯酶活力的测定可用于鉴别肾上腺激素分泌过多的原因，可与尿儿茶酚胺、瘤胃癌相关的胆碱酯酶比较，以进行肿瘤的诊断。
此外，胆碱酯酶活力的异常变化还可能与某些遗传性疾病有关。
需要注意的是，在进行胆碱酯酶活力检测时，应遵循实验室的规范操作流程和标准方法，以确保测试结果的准确性和可靠性。
乙酰胆碱酯酶活性测定
乙酰胆碱酯酶酶活的测试作者：陈志坚1 准备工作0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。
2 酶液制备SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。
将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。
然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。
将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。
3 酶活性抑制测试3.1 配药液参照脲酶实验3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH3.3 酶活测试在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。
这是未加药酶活力为E1。
在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
计算出此时酶活，为E2。
抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100%得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。
鲤鱼脑中乙酰胆碱酯酶活性的测定
一、实验目的：
1.掌握吸光值的测定方法
2.掌握乙酰胆碱酯酶活性测定的方法、原理。 3.学会使用分光计、匀浆机。
二、实验原理 1.摩尔吸光系数 摩尔吸光系数是指物质在1 mol/L的浓度下，比 色杯厚度为1CM时的吸光值。可以用实验的方法通过 测量一系列已知浓度的物质的吸光值来绘制一条标准 曲线。这样，在所要求的浓度范围内，便可确定吸光 值与浓度之间存在的线性关系，该直线的斜率即为摩 尔吸光系数。 2. 乙酰胆碱酯酶活性的测定 取一定量的乙酰胆碱与鱼脑胆碱酯酶作用，水解 后，剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺作用，生成乙酰羟胺， 它们在酸性溶液中与三氯化铁作用，生成 深褐色异羟 肪酸铁络合物，其颜色的深浅与乙酰胆碱量成正比， 用分光光度法测出剩余乙酰胆碱的含量，从而间接地 测定胆碱酯酶的活性。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三、实验材料与方法 1.材料： 鲤鱼、氯化乙酰胆碱标准溶液，FeCl3溶液， 1:2盐酸溶液。
2.方法：分光光度法
四、实验步骤 1、制备乙酰胆碱吸光值标准曲线 分别取乙酰胆碱使用标准液 0.0ml,0.2ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml，于试管中，然后用磷酸 缓冲液（PH＝7.2）添加到2ml，摇匀，各加碱性羟胺 4ml（临用前20min将盐酸羟胺与等 体积的3.5mol/L氢氧 化钠混合即成）振摇3min后再加1：盐酸溶液2ml，振摇 1min后，最后 加2ml三氯化铁，摇匀后待测（空白管中 先加1：2盐酸摇匀，然后再加碱性羟胺）。10min后分 别将溶液移入比色皿中，并在525nm波长下测定各管的 吸光值，以空白对照液调零。以吸光值为纵坐标，以乙 酰胆碱浓度为横坐标给出标准曲线。
2.样品分析 （1）称取0.02g鱼脑组织，放入已冰浴预冷的匀浆器中，然 后加入10ml磷酸缓冲液（PH＝7.2）于匀浆器中，使每毫升 鱼脑匀浆液中含鱼脑组织2mg. （2）取一支试管，加入1ml乙酰胆碱使用标准溶液，再加入 1ml鱼脑组织匀浆液，然后放入370C恒温水浴槽中,温育20min. （3）取出试管并立即分别加入4ml碱性羟胺，充分振摇1min 后再分别加入2ml 1：2盐酸，充分振摇。最后再分别加入 2ml三氯化铁，再次充分振摇，然后用快速滤纸过滤（除去 蛋白质及杂质） （4）将滤液移入比色皿中，在525nm波长下测定吸光值，仍 以试剂空白调零。
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货号：MS2000 规格：100管/96样乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。
AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。
测定原理：
AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。
试剂四：粉剂×1支，4℃保存。
临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。
粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加
入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500
万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
测定操作：
1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL试剂二、10μL试剂三和10μL 试剂四，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。
△A测定管=A2-A1。
注意：空白管只需测定一次。
AchE活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.组织AchE活性
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（Cpr ×V样）÷T
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= 245×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（W ×V样÷V样总）÷T
= 245×△A÷W
2.细菌、细胞AchE活性
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/104cell)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T
= 245×△A÷细胞数量
3.血清AchE活性
活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T
=245×△A
ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；V样总：提取液体积，1 mL；106：1mol=1×106μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），
3 min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
1.组织AchE活性
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（Cpr ×V样）÷T
= 490×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（W ×V样÷V样总）÷T
= 490×△A÷W
2.细菌、细胞AchE活性
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/104cell)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T
= 490×△A÷细胞数量
3.血清AchE活性
活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T
=490×△A
ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；V样总：提取液体积，1 mL；106：1mol=1×106μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。
第2页，共2页。