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何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相 应的缓冲体系
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作 要轻柔
离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕 猴桃大提，10000转20min）
针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的 去杂质的方法
核酸沉淀、溶解
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
第四章 基因工程的主要技术与原理
周毅峰 2019.03
核酸的提取与纯化 核酸电泳 分子杂交 PCR技术 DNA序列分析 大分子相互作用
1、核酸的提取与纯化 材料准备
破碎细胞或包膜－内容物释放 核酸分离、纯化
沉淀或吸附核酸，并去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中
1.1、基因组DNA的提取与纯化
当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附 在细胞碎片上一起被离心除去。
所用的试剂作用
① 葡萄糖
增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用 而降解。
② EDTA
Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。
③ NaOH-SDS
NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合 物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
最好使用新鲜材料，低温保存 的样品材料不要反复冻融
使用处于对数期的新鲜菌体（老 化菌体导致开环质粒增加）
提取血液基因组DNA时，要选 择有核细胞（白细胞）
培养时应加入筛选压力，否则菌 体易污染，质粒易丢失
基因工程的原理和技术有哪些
基因工程的原理和技术有哪些1. 引言基因工程是一门以改变生物体的遗传信息为核心的生物技术领域。
通过改变生物体的基因组，基因工程使得我们能够实现对生物体的精准编辑和控制，以达到特定的目的。
本文将介绍基因工程的原理和常见的技术，包括基因克隆、DNA测序、PCR扩增、CRISPR-Cas9系统等。
2. 基因工程的原理基因工程的原理基于对生物体遗传信息的理解和改变。
生物体的遗传信息储存在DNA分子中，通过改变DNA序列，我们可以影响生物体的表型和功能。
基因工程通常包括以下几个步骤：•DNA提取：从目标生物体中提取DNA，可以通过化学方法或者机械方法进行。
•DNA切割：利用限制性内切酶将目标DNA分子剪切成特定的片段。
•DNA连接：将所需的DNA片段连接到载体DNA上，生成重组DNA。
•DNA转化：将重组DNA导入到宿主细胞中，宿主细胞根据重组DNA的指令表达特定蛋白质。
3. 基因工程的常见技术3.1 基因克隆基因克隆是一种常见的基因工程技术，它通过将目标基因从源生物体中提取并插入到宿主细胞中，实现对基因的复制和繁殖。
基因克隆通常包括以下步骤：1.DNA提取：从源生物体中提取目标基因的DNA。
2.DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因的DNA切割成特定片段。
3.载体DNA准备：将一种称为“载体”的DNA分子准备好，它可以将目标基因插入其中。
4.DNA连接：将目标基因的DNA片段与载体DNA连接，生成重组DNA。
5.DNA转化：将重组DNA导入到宿主细胞中，宿主细胞会按照重组DNA的指令表达特定蛋白质。
3.2 DNA测序DNA测序是一种确定DNA序列的技术，它是基因工程领域中非常重要的一项技术。
DNA测序可以帮助我们了解生物体的遗传信息，从而对基因进行研究和编辑。
常见的DNA测序技术包括Sanger测序和新一代测序技术。
这些技术基于不同的原理和方法，可以高效准确地确定DNA序列。
3.3 PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种能够从极少量的DNA模板扩增大量DNA的技术，也是基因工程中常用的技术之一。
第四章基因工程的主要技术及其原理
第一节 DNA和RNA的提取和纯化
DNA酶抑制剂 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使
用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTANa2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；
阴离子型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白 质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合 物在高盐溶液中沉淀。
该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的 ，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加 入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在 将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不 要低于15℃。
一、 Cl
CTAB PVP40 β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4 M
3%(W/ 5%(W/ 2%（V/V）
V)
V)
使用前加入
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多
酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少
DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效
去除多糖。
一、DNA提取的基本原理与方法
上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后
用SD乙S醇组法份沉D淀NA水Tr提i相s-取H中C缓）l的（冲pDHN液8A.0。（pE）HD8TA.0
NaCl
SD S
终浓度
10 mM
20 mM 0.4M 2
一、DNA提取的基本原理与方法
SDS法流程图（以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分 子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提 取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。
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36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
ห้องสมุดไป่ตู้
基因工程(基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析)课件
核心原理：
利用特定的化学试剂对不同碱基进行特异 性切割。
硫酸二甲酯： 哌啶甲酸： 肼+NaCl： 肼：
G G和A C T和C
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5′ 3′
G A+G
3′ 5′
待测DNA
放射性标记5′末端 R
限制性酶切
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热使模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合；
3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
凝胶电泳分离，放射线ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T基因T工T程(基T因T工程G的G主要G技术C与原T理T- A G C 3′
通过凝胶电泳分离，放射自显影确定DNA片段 末端的碱基，进而推断DNA的核苷酸序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´
正常的DNA合成反应基因工程(基因工程d的dN主T要P技掺术与入原到理-DNA合成反应后导致反应终止
核苷酸序列分析)
基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于 1977年建立了以双脱氧链终止反应为基础来 测定DNA序列的方法；
该方法以待测DNA为模板，在DNA聚合酶的 催化作用下合成新的DNA链；
04_基因工程的主要技术及其原理
第一节 DNA和RNA的提取和纯化
DNA酶抑制剂 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用 金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙
二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；
阴离子型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋 白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复 合物在高盐溶液中沉淀。
第四章基因工程的主要技术及其原理第一节dna和rna的提取和纯化第二节凝胶电泳第三节聚合酶链式反应技术第四节核酸和蛋白质的分子杂交第五节dna序列分析第六节基因定点诱变第七节dna与蛋白质互作分析第一节dna和rna的提取和纯化核酸是遗传信息的载体是最重要的生物信息分子是分子生物学研究的主要对象因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要最基本的操第一节dna和rna的提取和纯化核酸提取与纯化的原则保持核酸分子一级结构的完整性温度不要过高控制一定的ph值范围ph值59保持一定的离子强度减少物理因素对核酸降解的机械剪切力防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键破坏核酸一级结构
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使
酚容易去除
一、DNA提取的基本原理与方法
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl （pH8.0） 100 mM EDTA NaCl （pH8.0） 20 mM
组份
终浓度
CTAB
PVP40
β-巯基乙醇
基因工程的主要技术原理文稿演示
（3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。
（4）沉淀DNA 用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。
（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。
（5）除去RNA污染 用RNase A。
三、DNA的定量和纯度测定
1. 紫外光谱法 原理： DNA（或 RNA）在260nm波长处 有特异的紫外吸收峰。
变性 强碱
DNA单链 中性
复性
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性 后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构， 与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心 的时候沉淀下去。
变性
（2） 所用的试剂作用
① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH>8）下有活性。
蛋白质在280nm处有吸收峰
用微量比色杯（10l）在紫外分光光 度计直接测定。
2
2. 琼脂糖凝胶电泳估计
原理： 溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中， 紫外光照射下能发 红色荧光。
与已知浓度的DNA电泳带荧光强度 对比，就可以估计出DNA含量。
一般过程及原理： （1）组织粉碎 动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研 磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接 使用。
（2）细胞裂解
O CH3—(CH2)11—O—S—ONa
O
0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。
SDS是离子型去垢剂（detergent），可 以使细胞膜崩解。
2. 影响质粒DNA产量的因素
最重要的是： 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。
（1）受体菌株
基因工程的原理及技术
基因工程的原理及技术导言基因工程是一门重要的生物学分支，通过改变生物体内的基因组成，使其具有特定的性状和功能。
随着基因工程领域的不断发展，人类已经可以利用基因工程技术来改良农作物、研发新药、治疗基因疾病等。
本文将介绍基因工程的基本原理和常用技术。
基本原理基因是生物体内控制遗传信息的载体，基因工程的核心原理是通过改变特定基因的组成及其表达方式来改变生物体的性状和功能。
基因工程的基本原理包括以下几个方面：1.基因克隆：基因克隆是基因工程的重要手段之一。
通过将特定基因从一个生物体中剪切出来，并将其插入另一个生物体的染色体中，实现对目标基因的复制和表达。
常用的基因克隆方法包括限制性内切酶切割和连接、PCR 扩增等。
2.DNA序列分析：DNA序列分析是基因工程研究的基础。
通过对基因组DNA的测序和分析，可以对基因的结构、功能和调控进行深入研究。
DNA 序列分析常用的技术包括Sanger测序、高通量测序、基因芯片等。
3.基因敲除和突变：通过基因敲除和突变技术，可以特异性地删除或改变目标基因，从而观察其对生物体性状和功能的影响。
常用的基因敲除和突变技术包括RNA干扰、CRISPR-Cas9系统等。
4.基因表达和调控：基因的表达和调控是生物体内基因功能发挥的关键环节。
基因工程可以通过改变基因的启动子、增强子等序列，实现对基因表达和调控的精确操控。
常用的基因表达和调控技术包括质粒转染、转基因技术等。
常用技术基因工程领域有多种常用技术，以下列举几个代表性的技术：1.质粒转染技术：质粒转染技术是一种常用的基因工程技术，通过将外源基因表达载体（质粒）导入宿主细胞，实现基因的表达和功能研究。
该技术广泛应用于基因治疗、农作物遗传改良、疫苗研发等领域。
2.转基因技术：转基因技术是将外源基因导入到目标生物体中，实现特定性状的引入或改良。
转基因技术在农作物育种和药物研发中发挥了重要作用，成功开发出了多种转基因作物和转基因药物。
3.CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9系统是一种先进的基因编辑技术，具有高效、精确和可编程的特点。
基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析
(三) 化学降解法的应用
Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个
碱基，适合G+C含量较高及较短的寡核苷酸片段的 测序； 从DNA两端分别测定同一条DNA核苷酸序列，相互 参照测定结果，可以得到准确的核苷酸序列；
Maxam-Gilbert化学降解法不需要进行酶催化反应，
起始位点相同的、不同长度的、以不同碱基结
尾的DNA片段群； 3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
凝胶电泳分离，放射线自显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T T T T T G G G C T T A G C 3′
基因分析工具
NCBI:（美国国家生物技术信息中心）
EMBL:（欧洲生物信息学研究所）
Sanger中心:（基因组测序中心）
ExPASy:（瑞士生物信息学研究所蛋白质分析系统）
H
ddNTP
ddATP
ddCTP
通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳能分辨出小至一个碱基 长度差异的DNA片段,从 而将混合产物中不同长度 DNA片段分离开。
再通过放射自显影曝光, 根据片段尾部的双脱氧核 苷酸读出该DNA的碱基排列 顺序。
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热时模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合； 标记(labeling)：利用放射性同位素标记核苷酸 或引物； 延伸(extension)和终止(termination)：反应体 系中新生核苷酸的合成和随机终止过程； 电泳分析和数据读取：聚丙烯酰胺凝胶电泳，放 射自显影，读取DNA的碱基排列顺序。
基因工程的原理和技术
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
3、将重组DNA导入受体细胞
转化
• 常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
（1）将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法
（2）将重组DNA导入动物细胞
④利用PCR技术
⑤利用DNA转录
⑥人工合成
A．①②③⑤
B．①②⑤⑥
C．①②③④
D．①②④⑥
3.基因工程又叫基因拼接技术。
(1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之 一是：以目的基因转录的 信使RNA为模板，逆转录 成互 补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA(目的。基因)
(2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、动植物细。胞
显微注射技术
提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵
受精卵移植
1.将重组DNA导入植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法
2.将重组DNA导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效） 3.将重组DNA导入微生物细胞 Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。
目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成 后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是 普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。
②检测目的基因是否转录出了mRNA
方法: 分 子 杂 交
过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂 交带,表明目的基因转录出了mRNA.
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定等
基
基因工程的主要技术原理
应用领域和未来发展
1
医学
基因治疗、药物开发和疾病诊断等。
2
农业
生物农药、转基因作物和粮食安全等。
3
生物技术
基因合成、网络生物学和生物制造等。
定义和原理
通过合成DNA片段，制造具有特定功能的人工基因。
2
应用
用于生物燃料生产、药物开发和合成生物学研究等。
3
例子
合成可持续生物基材料、虚拟人类基因组和人工合成细菌等。
基因改造与修饰技术
定义和原理
通过修改基因组，改变生物 的性状和功能。
应用
用于农作物改良、动物育种 和生物医学研究等。
例子
转基因作物、生物安全防控 和基因标记技术等。
基因工程的主要技术原理
在遗传学领域，基因工程是一种重要的技术，它涉及到DNA重组、基因插入、 基因克隆、基因编辑、基因合成和基因改造与修饰等各种方法。这些技术的 成功应用在许多领域都产生了深远的影响。
DNA重组技术
1
定义和原理
通过体外技术将具有特定功能的DNA片
应用
2
段重新组合，形成新的DNA序列。
广泛应用于植物育种、动物遗传改良和
医学研究等领域。
3
例子
利用DNA重组技术生产抗生素、植物转 基因和人类胰岛素等。
基因插入与转导
定义和原理
把外源基因导入到宿主细胞中，使其表达特定的蛋白质。
应用
用于治疗基因缺陷性疾病和生物技术研究等。
例子
基因治疗、生物制药和疫苗研究等。
基因克隆技术
定义和原理
通过复制和繁殖一组遗传物质， 生成与原始个体相同的克隆。
பைடு நூலகம்应用
用于植物繁殖、动物保育和基础 科学研究等。