实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。
有机溶剂能使许多溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。
例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。
溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。
这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。
同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。
沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。
用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；V0－原溶液的体积；S1－原溶液中有机溶剂的浓度；S2－要求达到的有机溶剂浓度；100－指加入的有机溶剂浓度为100％。
如所加入的有机溶剂的浓度为9 5％，上式(100一S2)项应改为(95一 S2)。
在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交叉方法求出。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。
酶工程实验碱性磷酸酶实验报告
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。
生化实验碱性磷酸酶的提取与鉴定
实验中的问题与改进
通过总结实验中的问题 并寻找改进方法，我们 可以提高实验效率和准 确性，从而更好地完成 生化实验任务并为未来 的研究打下坚实基础
生化实验:碱性 磷酸酶的提取与
鉴定
1 实验目的 3 实验步骤 5 实验结论 7 实验思考与拓展 9 实验中的问题与改进
-
2 实验原理 4 结果分析 6 实验讨论与改进 8 实验总结
1
实验目的
实验目的
本实验旨在学习 掌握碱性磷酸酶 的提取与鉴定方 法，了解其理化 性质及生物学意 义
2
实验原理
实验原理
该酶的理化性质及生物学意义，还锻炼了我们的实验操作技巧和处理生化样品的能力
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通过实验，我们认识到碱性磷酸酶作为一种重要的生物酶，在生物体内发挥着参与物质代谢、能量转 化等重要生物学功能。此外，该酶在临床诊断、生物工程和环境监测等领域也具有广泛的应用价值
在实验过程中，我们需要注意实验细节和试剂的正确使用，以保证实验结果的准确性和可靠性。例如，
4
结果分析
结果分析
通过本实验，我们成功地提取并鉴 定了碱性磷酸酶
实验结果显示，该酶具有较高的活 性，且蛋白质浓度符合预期
通过本实验，我们掌握了碱性磷酸 酶的提取与鉴定方法，了解了其理 化性质及生物学意义
同时，实验过程中需要注意操作细 节和试剂的正确使用，以保证实验
结果的准确性和可靠性
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实验结论
实验中的问题与改进
在实验过程中，我们可能会遇到一
01
些问题，例如提取的酶活性不高、
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg•pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm 处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。
分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。
本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。
方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。
同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。
实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。
透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。
在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。
但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。
同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
生化大 实验报告
内蒙古大学生命科学学院生物系生物化学实验室生物化学大实验结题报告论文题目：重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析学生姓名：年级：专业：指导教师：2011年xx月xx日重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析X X（xxxxxxxxxxxxxxxxxxx(地址)）摘要: 将外源基因BAP克隆在含有lac启动子的表达载体coli中，让其在E. coli 中表达。
培养宿主菌，在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，而外源基因大量转录并高效表达。
将宿主菌进行超声波破碎，用亲和层析柱将蛋白分离纯化，最后SDS-PAGE检测转录表达蛋白，用Western-blotting方式分析蛋白特性。
关键词：细菌性碱性磷酸酶；亲和层析；SDS-PAGE；Western-blotting 碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称。
它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,是分子生物学中常用的工具酶之一。
它的作用是催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5'-Pi末端转换成5'-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。
而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。
碱性磷酸酶有两种来源：一种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,简称BAP)；BAP属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。
每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。
细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
Ⅲ—02碱性磷酸酶的分离纯化及鉴定
酶工程实验内容实验一碱性磷酸酶的分离纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶简称AKP。
先用低浓度醋酸钠低渗破模作用制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性释出膜中酶过滤后以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33的丙酮或30的乙醇中溶解而在50的丙酮或60的乙酸中不溶解的性质用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
三、仪器、原料与试剂仪器移液管、量筒、玻璃勺浆器管、剪刀、离心机、新华定性滤纸。
原料新鲜兔肝试剂 1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中定容至1000 m1。
2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中定容至1000 m1 3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液准确吸取20mL 0.5mol/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液混匀后定容至1000 m1。
4. Tris—HCl pH8.8缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷12.1g用蒸馏水溶解后定容至1000mL即为0.1mol/LTrls 溶液。
取100m10.1mol/LTrls 溶液加蒸馏水约780mL再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1混匀后用1冰醋酸调pH 为8.8用蒸馏水定容至l000m1。
5. 正丁醇、丙酮、95乙醇均为分析纯试剂。
四、实验操作分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下以下操作均在0-4℃进行将分离提取的碱性磷酸分装成2ml瓶冰冻干燥保存或液体保存也可但均置于-60℃低温冰箱保存。
应用时稀释5—7倍测其Km值。
实验二碱性磷酸酶的动力学鉴定——Km测定一、原理当温度、PH及酶浓度恒定的条件下酶促反应的初速度随作用物浓度S增大而增大但增大到一定限度时作用物浓度再增加则反应速度不再增加。
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
#### 一、实验背景碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有在碱性条件下水解多种磷酸酯底物的能力。
AKP在生物体内参与多种生理和代谢过程，如钙磷代谢、细胞信号转导等。
本研究旨在通过实验手段对AKP进行分离纯化，并对其性质进行初步探讨。
#### 二、实验材料与仪器1. 材料：- 兔肝匀浆液- 丙酮、乙醇、正丁醇、硫酸铵等有机溶剂- DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200等层析介质- SDS-PAGE电泳试剂- 蛋白质分子量标准品- 碱性磷酸酶底物及检测试剂2. 仪器：- 高速离心机- 紫外可见光分光光度计- 凝胶成像系统- 层析柱- 电泳槽- 移液器#### 三、实验方法1. 碱性磷酸酶的提取：- 将兔肝匀浆液用4℃预冷的丙酮沉淀，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入硫酸铵至饱和，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入正丁醇，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集含有碱性磷酸酶的上清液。
2. 碱性磷酸酶的纯化：- 将上清液用DEAE-Sepharose FF层析柱进行阴离子交换层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
- 将活性峰用Sephacryl S-200分子筛层析柱进行分子筛层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
3. 碱性磷酸酶的鉴定：- 将纯化后的碱性磷酸酶进行SDS-PAGE电泳，与蛋白质分子量标准品进行对比，确定其分子量。
- 利用紫外可见光分光光度计测定碱性磷酸酶的吸光度，计算其浓度。
4. 碱性磷酸酶的性质研究：- 通过酶活性测定，探讨碱性磷酸酶的最适pH值、最适温度等性质。
#### 四、实验结果1. 分离纯化结果：- 经过上述实验步骤，从兔肝匀浆液中成功提取并纯化了碱性磷酸酶。
实验三 碱性磷酸酶的分离纯化和Km
AKP
磷酸苯二钠 PH 10
磷酸盐 + 酚
铁氰化钾 酚 + 4-氨基安替比林 碱性 红色醌类衍生物
利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活 性（A），按 Lieweaver-Burk 二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其 Km 值。
三、实验仪器及试剂
仪器： 恒温水浴锅，721 型分光光度计。 试剂： 1. 0.04mol/L 作用物液：称取 10.16g 磷酸苯二钠 （C6H5PO4Na2· 2H2O），用 煮沸后冷却的蒸溜水溶解， 并稀释 至 1,000ml， 4ml 氯仿防腐， 加 贮于棕色瓶内， 置冰箱内保存， 可用一周。
• 将分离提取的硷性磷酸分装成 2ml 瓶，冰 冻干燥保存或液体保存也可，但 均置于60℃低温冰箱保存。应用时稀释 5—7 倍测 其 Km 值。
第二部分 碱性磷酸酶Km测定
一、实验目的
掌握碱性磷酸酶的的动力学鉴定—Km 鉴定
二、实验原理
• 当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度 随作用物浓度[S]增 大而增大，但增大到一定限度时，作 用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此 时反应速度为 最大速度（Vmax）。Michaelis Menten 对酶促反应速度与
• 试剂：
1 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至 1000
m1。 2 3 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至 1000 m1。 0.0lmol/L 醋酸镁-0.01mol/L 醋酸钠溶液： 准确吸取 20ml0.5mol/L 醋 酸 镁溶液及 100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至 1000 m1。 4 Tris-HCl pH8.8 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷 12.1g，用蒸馏水溶解 后 定容至 1000mL，即为 0.1mol/LTrls 溶液。取 100m1 0.1mol/LTrls 溶 液，加蒸 馏水约 780mL，再加 0.1mol/L 醋酸镁溶液 100m1，混匀后 用 1％冰醋酸调 pH 为 8.8，用蒸馏水定容至 l000m1。 5 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。
酶的纯化实验报告
实验名称：碱性磷酸酶的分离纯化实验实验日期：2023年11月15日实验地点：生化实验室实验目的：1. 掌握碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化技术。
2. 了解不同纯化方法对AKP纯度的影响。
3. 学习AKP的比活性测定与动力学分析。
实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种在碱性条件下能水解多种磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适范围为pH 9.5-10.5，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP的分离纯化方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 正丁醇3. 丙酮4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液6. 酶活性测定试剂盒7. 其他实验试剂及仪器实验步骤：1. 样品制备：将兔肝匀浆液用磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度。
2. 有机溶剂沉淀：向稀释后的匀浆液中加入正丁醇，充分混匀，静置一段时间，过滤除去杂蛋白，收集滤液。
3. 丙酮沉淀：向滤液中加入丙酮，充分混匀，静置一段时间，过滤收集沉淀。
4. 复溶于磷酸盐缓冲液：将沉淀用磷酸盐缓冲液复溶于一定体积。
5. AKP活性测定：按酶活性测定试剂盒说明书进行AKP活性测定。
6. 比活性测定：计算AKP的比活性。
7. 动力学分析：进行AKP的动力学分析，确定米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。
实验结果：1. 有机溶剂沉淀法：通过有机溶剂沉淀法，从兔肝匀浆液中成功提取了AKP。
2. 比活性测定：AKP的比活性为0.6 U/mg。
3. 动力学分析：AKP的米氏常数为0.5 mM，最大反应速率为1.2 U/min。
讨论：本实验采用有机溶剂沉淀法成功从兔肝匀浆液中提取了AKP，并通过比活性测定和动力学分析，对AKP的纯度和特性进行了研究。
碱性磷酸酶实验报告
实验日期：2023年10月25日实验地点：生化实验室实验目的：1. 了解碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化原理和方法。
2. 掌握碱性磷酸酶活性测定的原理和方法。
3. 通过实验验证碱性磷酸酶的动力学特性，计算其米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种非特异性磷酸单酯酶，主要存在于动物和微生物体内，具有磷酸基团转移活性。
在碱性条件下，AKP能水解多种磷酸单酯化合物，生成相应的醇和磷酸盐。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP，并通过比色法测定其活性。
实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 丙酮3. 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）4. 磷酸苯二钠5. 4-氨基安替比林6. 铁氰化钾7. 移液管、移液枪、试管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计实验步骤：1. 碱性磷酸酶提取：- 将兔肝匀浆液与丙酮以体积比1:1混合，室温下静置过夜。
- 4,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。
- 将沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解，得到碱性磷酸酶粗提液。
2. 碱性磷酸酶活性测定：- 取6支试管，分别加入0.02 mol/L磷酸苯二钠溶液、0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、4-氨基安替比林溶液和铁氰化钾溶液。
- 在上述溶液中加入不同浓度的碱性磷酸酶粗提液，混匀后置于恒温水浴箱中反应10分钟。
- 在510 nm波长下测定吸光度，以酶活力单位（U）表示。
3. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）计算：- 以酶活力单位（U）为纵坐标，底物浓度（mol/L）为横坐标，绘制酶活力曲线。
- 利用双倒数法（Lineweaver-Burk plot）计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验结果：1. 碱性磷酸酶活性曲线：- 随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但在一定浓度后趋于稳定。
2. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）：- 米氏常数（Km）为0.05 mol/L，最大反应速度（Vmax）为150 U/min。
碱性磷酸酶生化实验报告
一、实验目的1. 熟悉碱性磷酸酶（ALP）的生化特性；2. 掌握ALP的分离纯化方法；3. 学习ALP比活性测定和动力学分析；4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理碱性磷酸酶（ALP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有磷酸基团转移活性，在碱性条件下能水解多种磷酸单酯化合物。
ALP在生物体内具有重要的生理功能，如参与骨骼生长发育、肝脏解毒、钙磷代谢等过程。
本实验旨在通过分离纯化ALP，测定其比活性和动力学参数，为进一步研究ALP的生物学功能提供实验基础。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：兔肝匀浆液、正丁醇、丙酮、乙醇、NaCl、MgCl2、MnCl2、磷酸苯二钠、4-氨基安替比林、铁氰化钾、pH缓冲液等。
2. 实验仪器：恒温水浴箱、离心机、分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验方法1. ALP的分离纯化（1）将兔肝匀浆液与等体积的正丁醇混合，充分振荡，静置，取上层滤液。
（2）向滤液中加入1/10体积的MgCl2、MnCl2溶液，混匀。
（3）加入等体积的丙酮或乙醇，静置，离心（3000r/min，10min），取沉淀。
（4）沉淀用少量pH7.0的磷酸缓冲液溶解，再次离心，取上清液。
2. ALP比活性测定采用磷酸苯二钠为底物，在pH10的碳酸缓冲液中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸盐。
苯酚与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌类衍生物，通过测定吸光度变化计算ALP的比活性。
3. ALP动力学分析采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，测定不同底物浓度下的酶活性，计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
五、实验结果1. ALP的分离纯化通过有机溶剂沉淀法，从兔肝匀浆液中成功提取纯化ALP。
SDS-PAGE结果显示，纯化后的ALP蛋白呈单一条带。
2. ALP比活性测定通过测定不同底物浓度下的酶活性，计算出ALP的比活性为1.5U/mg。
3. ALP动力学分析采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算出ALP的米氏常数（Km）为0.01mmol/L，最大反应速度（Vmax）为200U/min。
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定
VX = 5/6（0.83） VB/ /
注意事项
1. 低温条件进行 2. 有机溶剂边加边搅拌 3. 加完有机溶剂后，立即离心，分析沉淀 4. 加有机溶剂的量计算精确 5. 乙醇上层液入回收瓶
比色分析的原理
有色溶液
设： I IO
T (透光度)
A = lg IO = -lg I = -lg T
I (吸光度)
实验二 碱性磷酸酶的提 取及其比活性测定
材料选择
细胞的破碎
分离纯化
鉴定
碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法；
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算；
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。
（待测蛋白质含量）
剩余A液
加2ml正丁醇，搅拌 3-5'，室温放置30'， 过滤，入离心管
上述滤液
加等体积冷丙酮，混匀， 离心2000 rpm、5分钟
上清入回收瓶
沉淀
加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2,
搅拌，记体积VB
B液
B1管
0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织
本次实验：肝脏
② 生物组织与细胞的破碎
➢ 机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 ➢ 渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎
➢ 反复冻融法 ：
➢ 超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而
使细胞破碎
➢ 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞
碱性磷酸酶的分离纯化-袁野20101009
50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min，弃上 清 （3）沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。 作为D液用于比活性测定。
用于活性测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将 A液稀释25倍、B液稀释10倍、 C液稀释5倍， D液不稀释。
酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶 活性。
(三)碱性磷酸酶的蛋白含量测定
BCA法测定AKP蛋白浓度
BCA (bicinchoninic acid, 二喹啉甲酸)
Protein + Cu2+
OH-
BCA 试剂
Cu+
紫色复合物
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）
管号
空白
酶液体
蛋白标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
每步总活力 初提液总活力（A液体）
分离 阶段
A B C D
蛋白质 酶活性 比活性 mg/ml U/ml U/mg
纯化 倍数
得率
9. 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好， 清洗比色杯并晾干。
使用分光光度计的注意事项
1. 分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随 意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶 干燥袋，需定期更换。
2. 开机预热15分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定 期进行波长校准。
酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、 最适的pH、必要的激动剂等），一定的时间 内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗 量或产物的生成量来确定。
AKP
磷酸苯二钠
磷酸盐 + 酚
酚 + 4-氨基安替比林
碱性磷酸酶的分离纯化-袁野20191009
7. 一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。
8. 一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.2～0.7的范围内进行测 定。这样所测得的读数误差较小。如吸光度不在此范围内，可调 节样品溶液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较高的范 围内进行测定。
(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60% （0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清， 沉淀用3ml 0.5M Mg(AC)2溶解,记录体积c。取 0.1ml作为C液于EP管,待测比活性用。
6.
（1）其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分
数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min， 取上清（弃沉淀）
1.称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入 0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml, 进行 匀浆。转入离心管，并加2ml 0.01 M的醋酸 镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒 入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a， 取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。
2.在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇， 玻璃棒搅拌 2min，室温放置30min，纱 布过滤，置于离心管。
酶液体
酚标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
复合底物
3.0
标准 A
B
0.1 0.1 0.1
3.0 3.0 3.0
CD 0.1 0.1
3.0 3.0
2. 加入底物后, 立即混匀, 37 ℃ 准确15 min后加 入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反应, 混匀, 静置15 min , 510 nm比色（大比色杯）
实验报告朱正荣
关于碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究生物技术1101班朱正荣201131301024摘要：为了掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理，熟悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
学会碱性磷酸酶动力学——Km测定方法，掌握碱性磷酸酶最适pH值及酸碱稳定性范围的测定方法。
掌握碱性磷酸酶的最适温度及热稳定性范围的测定方法。
了解碱性磷酸酶的抑制剂类型。
关键词：碱性磷酸酶；分离纯化；酶工程学碱性磷酸酶（ALP 或AKP ）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
目前已发现有AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与AKP6 六种同功酶。
其中第1 、2 、6 种均来自肝脏。
碱性磷酸酶是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存在于人体、动物、植物与微生物中，在生物体内发挥了重要作用[1]。
它在脊椎动物的骨化过程中发挥了重要作用[1]。
提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究、毒物学研究及医学研究[2]。
由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，该酶还可添加到药用化妆品中[3]。
本文在前人工作的基础上尝试了猪肝碱性磷酸酶的分离纯化，并对其性质进行了探讨。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆中分离纯化碱性磷酸酶。
分离纯化碱性磷酸酶后，控制温度和PH及酶浓度恒定的条件下。
用Km测定方法测定酶促反应的速度。
酶的生物学特征之一就是它们对酸碱度的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境PH 的影响。
PH对对酶的活性影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的PH条件下所表现的活性不同，其表现活性最高的PH值称为酶的最适PH。
PH除了对酶的解离状态产生影响外，还可能影响底物的解离和影响反应系统中其他组成成分的解离。
PH不仅对酶的活性有很大的影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响。
碱性磷酸酶的分离纯化鉴定
基本组件及常见分光光度计
分光光度计的使 用
一．打开电源预热15分钟 二．选择波长（ λmax ） 三．光标指向Trans 四．打开光门，调节0％；关上光门调节
100％ 五．重复4一次 六．将光标指向ABS 七．读数
碱性
红色醌式化合物
AKP活性测定基 本原理－－磷酸 苯二钠法
01
磷酸苯二钠 苯酚 + 4-氨基 安替吡啉 + 铁
A标
蛋白标准液浓度
计算
样品的酶活性单位 碱性磷酸酶比活性（U/mg） =
样品的蛋白含量
纯化倍数 =
每一步比活性 初提液比活性
得率 =
每一步总活性 初提液总活性
每一步总活性 = 酶活性 × 每一部记录的体积数
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碱性磷酸酶的分离纯 化
有机溶剂分步沉淀法
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分离纯化的一般程序
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破碎细胞
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提取
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分离纯化
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分析及鉴定
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AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中）， AKP不
氰化钾
02
碱性磷酸酶 苯酚 + 磷酸盐
稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ） /
/
25 10
5
1
单位（ml） 空白管 标准管 A
BCD
各阶段稀释液 / /
0.1 0.1
酚标准液
0.1 0.1
（0.1mg/ml） / 0.1
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实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。
3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。
酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。
若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。
当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。
底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示：式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。
①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。
因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。
②Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km 值是研究酶动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。
③Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。
方程式与图如下：本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。
实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。
二、实验材料（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定１、样品兔肝２、试剂①0.5mol/L乙酸镁溶液②0.1mol/L乙酸钠溶液③0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液④0.01mol/L Tris－0.01mol/L乙酸镁PH８.８缓冲液⑤丙酮（分析纯）⑥95%乙醇（分析纯）⑦正丁醇（分析纯）⑧0.04mol/L底物液⑨１mg/ml分标准液⑩0.5mol/LＮａＯＨ⑪0.3% 4－氨基安替比林⑫0.5%铁氰化钾⑬0.1mg/mL蛋白标准液⑭碱性铜试剂⑮酚试剂３、仪器与器材①研钵②刻度离心管③刻度吸管④电动离心机⑤玻璃漏斗和玻璃棒⑥托盘天平⑦恒温水浴⑧可见分光光度计（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响１、样品兔肝匀浆液２、试剂①0.04mol/L底物液②0.1 mol/L碳酸盐缓冲液PH10（37℃）③碱性溶液④0.5%铁氰化钾⑤0.3% 4－氨基安替比林⑥酚标准液（0.1mg/ml）３、仪器与器材①恒温水浴锅②可见光分光光度计三、实验步骤（一）AKP的提取AKP提取实验步骤步骤操作（１）匀浆2g新鲜兔肝剪碎，加入0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液6.0ml，研磨成匀浆。
匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积，此为Ａ液吸取Ａ液0.1ml于另一试管中，加PH8.8Tris缓冲液4.9ml稀释，此为稀释Ａ液（1:50），供此比活性用（２）除杂蛋白在Ａ液中加入正丁醇 2.0ml，用玻璃棒充分搅拌2min，室温放置20min，用滤纸过滤（３）丙酮沉淀AKP 滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀离心（2000r/min）5min（４）AKP 溶解沉淀加入0.5mol/L乙酸镁4.0ml，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，记录其体积，此为B液。
取B液0.1ml于另一试管中，加入PH8.8Tris缓冲液4.9ml，此为稀释B液（1:50），供动力实验用(二) AKP的比活性测定1、AKP的活性测定AKP活性测定实验步骤步骤操作（1）加缓冲液取试管3支，按表操作试剂（ml）测定管标准管空白管PH8.8Tris缓冲液---- ----- 1.00.04mol/L底物液1.0 1.0 1.0（2）温浴37℃水浴预温5min(3)加酶和底物0.1mol/ml标准酚应用液待测液---- 1.0 ---- 1.0 ---- ----(4)酶促反应37℃准确保温15min(5)加显色液0.5mol/LNaOH 1.0 1.0 1.0 0.3% 4－氨基安替比林1.0 1.0 1.0 0.5%铁氰化钾2.0 2.0 2.0(6)显色反应混匀，室温放置10min(7)测吸光度510nm处测吸光度2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定实验步骤步骤操作（1）反应体系设置取3支试管，按表操作试剂测定管标准管空白管PH8.8Tris缓冲液---- ---- 1.0待测酶液 1.0 ---- ---- 蛋白标准液（0.1mg/ml）---- 1.0 ---- 碱式铜试剂 5.0 5.0 5.0（2）反应混匀后室温放置10min（3）加酚试剂酚试剂0.5ml（4）显色反应混匀后室温放置30min（5）比色反应在510nm处比色（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、底物浓度对酶促反应速度的影响将新鲜兔肝用PH10.0 0.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可酶曲线绘制步骤步骤操作(1)反应体系设置取6支试管标号，按表操作试剂（ml）1 2 3 4 5 60.01mol/l底物液0.01 0.20 0.30 0.50 1.00 ----- PH100.1mol/L碳酸盐缓冲液0.07 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 蒸馏水 1.10 1.00 0.90 0.70 0.20 1.20(2)保温37℃水浴中保温5min(3)加酶各管分别加入兔肝稀释匀浆液0.10ml（4）酶促反应混匀，立即记录时间，将各管准确保温15min（5）终止反应各管分别加入碱性溶液1.0ml（6）加各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0ml显色剂各管分别加入0.5%铁氰化钾2.0ml （7）显色充分混匀，放置15min（8）比色测定以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定（9）反应速度计算根据酚标准曲线计算出每样品酚的含量，算出反应速度（10）曲线绘制以各管底物浓度的倒数（1/[|S]）为横坐标，以各管反应速度的倒数（1/V）为纵坐标，作图求出Km值2、酚标准曲线的绘制的绘制酚标准曲线的绘制的绘制步骤步骤操作（1）反应体系设置取洁净干燥试管6支，依次加入试剂试剂（ml）1 2 3 4 5 6 0.1mol/ml酚标准溶液---- 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 蒸馏水 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60（2）预37℃水浴中保温5min加热（3）加显色剂碱性溶液1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.3% 4－氨基安替比林1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.00.5%铁氰化钾2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0（4）显色反应混匀后，室温放置15min（5）比色测定510nm波长处比色（6）曲线绘制以酚含量（微克）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制酚标准曲线注意事项（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定1、在纯化过程中，各步加入的有机试剂要计算精确。
2、加入有机试剂混匀后应立即离心，不宜放置过久。
3、在测定酶活性时，每加入一种试剂须立即混匀，避免浑浊。
（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、血清取量要准确。
2、标准曲线必须是过原点的一条直线。
3、在酶促反应中，每管加入后立即计时，保证各管反应时间一致。