实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析

实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室

合作者指导老师

总分教师签名批改日期

碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重

组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

一实验原理

1、碱性磷酸酶的分离纯化

AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。

2、碱性磷酸酶的比活性测定

根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚

在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。

3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示：

式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。

①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等

于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓

度。

②Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km 值是研究酶动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。

③Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。方程式与图如下：

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，

经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。

二、实验材料

（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定

１、样品

兔肝

２、试剂

①0.5mol/L乙酸镁溶液

②0.1mol/L乙酸钠溶液

③0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液

④0.01mol/L Tris－0.01mol/L乙酸镁PH８.

８缓冲液

⑤丙酮（分析纯）

⑥95%乙醇（分析纯）

⑦正丁醇（分析纯）

⑧0.04mol/L底物液

⑨１mg/ml分标准液

⑩0.5mol/LＮａＯＨ

⑪0.3% 4－氨基安替比林

⑫0.5%铁氰化钾

⑬0.1mg/mL蛋白标准液

⑭碱性铜试剂

⑮酚试剂

３、仪器与器材

①研钵

②刻度离心管

③刻度吸管

④电动离心机

⑤玻璃漏斗和玻璃棒

⑥托盘天平

⑦恒温水浴

⑧可见分光光度计

（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

１、样品

兔肝匀浆液

２、试剂

①0.04mol/L底物液

②0.1 mol/L碳酸盐缓冲液PH10（37℃）

③碱性溶液

④0.5%铁氰化钾

⑤0.3% 4－氨基安替比林

⑥酚标准液（0.1mg/ml）

３、仪器与器材

①恒温水浴锅

②可见光分光光度计

三、实验步骤

（一）AKP的提取

AKP提取实验步

骤

步骤操作

（１）匀浆2g新鲜兔肝剪碎，加入0.01mol/L乙酸镁

－0.01mol/L乙酸钠溶液6.0ml，研磨成匀

浆。匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积，

此为Ａ液

吸取Ａ液0.1ml于另一试管中，加

PH8.8Tris缓冲液4.9ml稀释，此为稀释

Ａ液（1:50），供此比活性用

（２）除杂蛋白在Ａ液中加入正丁醇 2.0ml，用玻璃棒充分搅拌2min，室温放置20min，用滤纸过滤