15 噬菌体展示技术的原理

载体的酶切
库的连接反应 抗体库的构建 筛选
包括数轮 识别-洗脱-复制 的过程
• 活性克隆制备 质粒DNA，VH 和VL基因重新 克隆于通用载 体，利用通用 引物测序。 • PCR直接测序
电穿孔导入 a) ELISA 加入AMP 抗性 检测 b) 特异型检测 先构建轻链， c) 序列测定 再构建重链 d) 亲和性测定 加入辅助噬菌体 e) 活性测定 加入卡那霉素 PEG-NaCl收集
选择方法：
淘选（Panning)
而不是 筛选（Screening)
Solid phase selection with immunotubes
Immunotube coated with
coated with
antigen
steptavidin and
biotinylated antigen
B
B
B
受体—配体 信息传递 诘抗剂 抑制剂
噬菌体抗体库的构建
Antibody IgG structure
Antibody IgG structure
Antibody IgG structure
VL
Fab
C VH C H1
L
(Fab’)2 Hinge
Fc
CH2 CH3
Membrane Extension
4. 肿瘤药物导航载体： 用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库 中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为 抗癌药物的定向输送工具 。一个成功的 实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具 有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取 出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下 来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的 特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联。结果显示，此偶联物 具有更强的抑制肿瘤的效果.
不可估
二、噬菌体展示技术的应用现状
1. 抗体： 抗狂犬病毒的单链抗体， 抗 HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此 抗体可专一性杀死被HIV-1感染并 表达有gp120的淋巴细胞, 中和响 尾蛇毒素的单链抗， 等等。
2. 疫苗： 展示在噬菌体表面的HIV-1 的 gp120-V3 环 可象天然抗原一样引起 显著的免疫应答, 等等。
一、噬菌体展示技术的原理
基因型 表达型 融合蛋白
PIII
Lead
Hv
Link
Lv
PIII
PⅢ 菌毛蛋白 3～5个拷贝
PⅧ 主要衣壳蛋白 2700～3000个拷贝
噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形 式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌 体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一 起。
检测
分泌型ScFv的产生
测序
单克隆抗体 杂交瘤技术
宿主细胞: 筛选范围 : 时间: 操作: 免疫: 人源抗体: 费用: 生产量: 基因获取: 杂交瘤 ~103 几个月 繁杂 必须 高 有限 再克隆
噬菌体抗体 展示技术
细菌 107109 几周 相对简单 可避免 + 低 无限 直接
应用前景:
有限
9. 蛋白质组学： 噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质 合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其 有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文 库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是 利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万 种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术 正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示 cDNA 文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找 与过敏症有关的蛋白质。
• •
• • 表面展示系统 • • •
噬菌体（M13, T7, T4, ) 病毒（反转录病毒，杆状病毒） 细菌（葡萄球菌，E. Coli) 酵母 体外共价连接（蛋白—DNA, 蛋白—RNA)
应用范围：
• • • • •
抗体
诊断 被动免疫 蛋白质结构分析 药物导航 蛋白质纯化
•
• • • • • 多肽 • • • • 蛋白质—蛋白质 蛋白质—DNA 蛋白质—其他 诊断 基因表达控制 中和活力 药物及药物导航 酶及底物
淘选系统
固相 完整细胞 组织，器官 常规法 正负法 竞争法
淘选方法
• 噬菌体展示技术最关键的优势有三：
• 第一，淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能； • 第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的 情况下，通过感染细菌得到富集； • 第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬 菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽 或蛋白质的序列分析既快速又简便。
Antibody IgG structure
VL C VH C H1 L
CH2 CH3
Fv
V H
VL C
L
C H1
CH2 CH3
VL
VL
Fv
scFv
VH
VH
Single Chain Fragment variable
噬菌体展示ScFv抗体操作示例
Pwk.baidu.comR产物的酶切（先平连再消化）
电穿孔转化 感受态 E.Coli TG1 细胞的制备
3. 多肽类药物： 如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分 离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和 蛇毒 α-bungarotoxin；从CX7C 多肽库中 掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合， 并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管 促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤 血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个 噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8 肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促 生素的活性；等等。
B
v
v
B B B
Solution phase selection with biotinylated antigen
antigen biotin
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
Wash to remove unbound phage particles.
Elute bound phage
Amplify eluted phage Repeat selection Analyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
感染 和扩增
E.coli
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噬菌体展示技术的原理
噬菌体展示的基本概念
将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋 白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体 噬菌体的基因组中。直接将可见的表达型与其基因型联系在 一起,利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白
质或多肽挑选出来。
多年来 , 噬菌体展示技术被用于 抗体的制备 、 多肽及蛋 白质和酶的制备 。特别是近几年来 , 该技术被作为一种新工 具用于多肽和蛋白质药物的发现与研制、蛋白质与蛋白质的 相互作用及蛋白质与DNA相互作用的研究、蛋白质结构和功 能的研究以及基因治疗药物的定向传递等多方面 的研究。
5. 酶： 例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类， 等等 6. 底物与抑制剂： 主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7. 信息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体， 如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一 个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促 生素、 α-bungarotoxin， 和一些大蛋白分子 中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。 从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与 受体结合的高亲和力的多肽, 因此用完整细 胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。 在不知道任何有关的受体和配体信息的情况 下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特 异与靶组织结合的多肽和蛋白。
8. DNA结合蛋白： 锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物， 这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白 区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌 体展示技术也可以用于创造一个大的、具有 识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用 这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小 鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒 的基因，或干扰病毒感染生活周期。