第四章_动、植物细胞培养产酶

细胞大小 /um 倍增时间/h
营养要求
200～300 ﹥12 简单
1～10
0.3-6 简单
10～100 ﹥15 复杂
光照要求 对剪切力
大多数要求 敏感
不要求 大多数不敏感
不要求 非常敏感
主要产物
色素、药物、 醇、有机酸、氨 疫苗、激素、 香精、酶等 基酸、抗生素、 单克隆抗体、
核苷酸、酶等 酶等
动物细胞培养与微生物培养的不同点
因此，大规模细胞培养成功的必要条件是要有一 个设备精良的细胞库。在细胞库中的冷冻细胞不受污 染。
动物细胞培Байду номын сангаас基的配方十分复杂，并且还需补充血清
原料的质量控制和培养基的生产是大规模细胞培养的主 要问题
因为血清来源困难，质量不稳定，残留血清给产物提纯 带来困难等
目前，利用动物细胞培养的方法生产的有用产品 a.疫苗 b.激素 c.多肽生长因子 d.酶 e.单克隆抗体 f.非抗体免疫调节剂
愈伤组织诱导法
愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和 功能薄壁细胞团
诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀子割 得到小细胞团，也可以在无菌条件下，将愈伤 组织转移到液体培养基中，加入经过杀菌处理 的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成 为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈 钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定 体积的小细胞团或单细胞悬浮液。
核苷酸、酶等 酶等
三者之间的差异主要有：
植物细胞>动物细胞>微生物细胞。 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。 植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。
一、植物细胞培养的特点 1.提高产率 2.缩短周期 3.易于管理、减轻劳动强度 4.提高产品质量 5.其他
动物细胞培养：
• 悬浮培养方式
血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞核杂交瘤细胞
• 贴壁培养方式
淋巴组织以外的组织、器官中的细胞
悬浮培养
• 优点：
具有细胞生长环境均一；培养基中溶解氧和 营养成分的利用率高；采样分析较准确且重现 性好。
• 缺点：
剪切力敏感；不能耐受强烈的搅拌和通风； 营养的要求复杂；大多数具有锚定依赖性动物 细胞，不能采用悬浮培养方式进行培养。
B5L 100ml
MS2 10ml
B5M 10ml
MFe 10ml B5Fe 10ml
MB+ 10ml
B5V 10ml
5.7
5.5
• 培养基的配制
• 大量元素母液 • 微量元素母液 • 铁盐母液 • 微生物母液
三、工艺控制
• 温度的控制
一般控制在室温范围25℃.通常不低于20 ℃ ， 也不要高于25 ℃。
细胞种类 植物细胞 微生物细胞 动物细胞
细胞大小 /um 倍增时间/h
营养要求
200～300 ﹥12 简单
1～10
0.3-6 简单
10～100 ﹥15 复杂
光照要求 对剪切力
大多数要求 敏感
不要求 大多数不敏感
不要求 非常敏感
主要产物
色素、药物、 醇、有机酸、氨 疫苗、激素、 香精、酶等 基酸、抗生素、 单克隆抗体、
• pH的控制
一般控制在微酸性范围，即pH5.0-6.0
• 溶解氧的控制
溶解氧一般通过通风和搅拌来供给
• 光照控制
大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的 生产要求一定波长的光的照射，并对光照强度 和光照时间有一定的要求，而有些植物次级代 谢物的生物合成却受到光的抑制。
• 前体的添加
前体是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。
第四章 动、植物细胞培养产酶
动、植物细胞培养是通过特定技术获得优良 的动、植物细胞，在人工控制条件的反应器中 进行细胞培养，获得所需产物的过程。
与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞 具有各自不同的特性，需采用各自不同的 培养工艺。
动物细胞模式图
植物细胞结构
动物细胞
植物细胞
第一节 植物细胞培养产酶
• 几种常见的植物细胞培养基
MS培养基：应用于植物细胞、组织和原生质体培养 B5培养基：双子叶植物特别是木本植物的组织细胞培养 White培养基：适用于生根培养 KM-8P培养基：原生质体培养
组分 碳源 大量元素 微量元素 铁盐 维生素 pH值
• MS和B5培养基
MS
B5
蔗糖30g
蔗糖20g
MS1 100ml
动物细胞培养的工艺过程如下：将种质细胞用胰 蛋白酶消化处理，分散成悬浮液细胞；再将悬浮液细 胞接入适宜的培养液中，在人工控制条件的反应器中 进行细胞悬浮液或贴壁培养；培养完成后，收集培养 液，分离纯化得到所需产物。
（一）、培养基
1.天然培养基 2.合成培养基 3.无血清培养基
天然培养基包括
体液 组织提取液 市售各种血清 水解乳蛋白 胶原 鸡血浆，鸡胚浸出液
• 原生质体再生法
在原生质体制备过程中，为了防止原生质体被破坏， 一般要采用高渗溶液，以利于完整原生质体的释放。 配制高渗溶液的溶质称为渗透压稳定剂。常用稳定剂 有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等等。
水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织
酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破 碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。
1950年前后，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细 胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。
作为大规模细胞培养，Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾 细胞的悬浮培养。
随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到有许多基因产物 不能在原核细胞内表达，它们需要经过真核细胞所特有的翻译 后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一样 的功能和抗原性。使得动物细胞一跃成为一种重要的宿主细胞， 用以生成多种生物制品等。这些采用大规模细胞培养技术生产 贵重药品在临床诊断、治疗和预防等方面都有重要意义。
a.动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差； b.生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素； c.大多数动物细胞需附着在固体或半固体的表面生长； d.对营养要求严格； e.大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验。
动物细胞生长十分缓慢，并易为大多数微生物污 染物所破坏。支原体对动物细胞培养的威胁最大，因 为其感染力强且不易检出。
为载体的比表面积大，单位体积培养液的细胞产 率高；由于微载体悬浮在培养液中，使其具有悬浮培 养的优点，即细胞生长环境均一、营养成分利用率高、 重现性好等。
固定化细胞培养
三、动物细胞培养的工艺条件及控制
动物细胞培养首先要准备好优质的种质细胞。用 于动物细胞培养的种质细胞主要有体细胞和杂交瘤细 胞两大类。体细胞的获得方法是从动物体内取出部分 组织，在一定条件下用胰蛋白酶消化处理，然后分离 得到；杂交瘤细胞则要首先分离肿瘤细胞核免疫淋巴 细胞，再在一定条件下将肿瘤细胞核免疫淋巴细胞进 行细胞融合，然后筛选得到。
合成培养基的主要成份有： 氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐、激素、
生长因子等
无血清培养基
目前，大多数动物细胞的体外培养，都不同程 度地依赖血清等天然培养基。无血清培养基的 研制是细胞工程中的一个重要课题。
小鼠组织块 ，用胰蛋白酶处理后变成单个细胞， 24h后（贴壁生长）的成纤维细胞
（二）、培养条件的影响与控制 1.温度：一般控制在36.5℃. 2.pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。 3.渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 4.溶解氧：根据情况随时调节。
外植体首先要选择无病虫害、生长旺盛、生长有规 则的植株，如果植物细胞是用于生产次级代谢物，则 需从产生该次级代谢物的组织部位中切取一部分组织， 经过清洗，除去表面的灰尘污物。
植物细胞的获取
直接分离法 愈伤组织诱导法 原生质体再生法
直接分离法
机械捣碎法
是先叶片等外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分 离细胞 优点：细胞未经酶处理，不会伤害细胞；不需要经过质 壁分离，有利于进行生理和生化研究 缺点：受到机械的作用，细胞结构受到伤害
第二节 动物细胞培养产酶
由于动物细胞体外培养具有明显的表达产物 的优点，为传统微生物发酵所无法取代，因此， 生物技术中许多有价值的生物制品，需要借助 于动物细胞培养而获得，这种需求极大地促进 了动物细胞培养技术的发展。
早在1907年，美国的Harrison在世界上首次将蛙的神经组织 在试管内培养成功，建立起动物组织体外培养的第一块基石。
1902年，德国植物学家G.Haberlandt就预言植物细 胞培养的可能性。
1937年前后，法国和美国科学家分别成功的进行了 胡萝卜和烟草的组织培养。
1966年Klein指出，能利用植物细胞培养物代替收 集或栽培植株来生产生化制品。
近年来通过植物细胞培养产酶的研究已经取得可喜进展
植物、动物、微生物细胞的特性比较
一、动物细胞培养的特点 1.细胞生长速度慢（需添加抗生素） 2.细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感 3.反应过程成本高，产品价格贵 4.细胞具有锚地依赖性 5.原代细胞一般繁殖50代
二、动物细胞培养方式
细胞培养是指离体细胞在无菌培养条件下的 分裂、生长，在整个培养过程中细胞不出现分化， 不再形成组织。
四、植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
1.大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用 70%乙醇消毒20s，再用0.1%氯化汞消毒10min，然后无菌 水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D 和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux， 12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代 一次。
细胞培养的目的及其在研究工作中意义： 目的是获得细胞产物 1.能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动。 2.便于使用各种不同的研究技术对细胞进行研究。 3.易于附加物理、化学、生物药物等实验因素。 4.能同时提供大量生物性状相似的实验材料。
植物、动物、微生物细胞的特性比较
细胞种类 植物细胞 微生物细胞 动物细胞
细胞株是通过选择或克隆化培养，从原 代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、 生化特性或特异标记的细胞群。
细胞系是由原先组成原代培养物的所有 细胞类型组成。
培养动物细胞的步骤
1.无菌取出目的细胞所在的组织用培养液漂洗干净； 2.用无菌刀割掉多余部分并切成小组织块； 3.小组织块置于解离液中离散细胞； 4.低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移到培养瓶中。
2.大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无 菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA的液体 MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d 光照条件下震荡培养12d，使愈伤组织分散成为小细胞团或 单细胞。
然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含 有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中， 25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。
二、培养基
应用最广的是MS培养基和LS培养基
MS培养基是1962年由Murashinge和 Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培 养基是在其基础上演变而来的。
• 培养基的特点
1、植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐 2、植物细胞需要多种维生素和植物生长激素 3、植物细胞要求的氮源一般为无机氮源 4、植物细胞一般以蔗糖为碳源。一般为2-5%
动物细胞的体外培养的条件 动物细胞的体外培养，模拟体内的条件，
• 刺激剂的应用
刺激剂是可以促进植物细胞中的物质代谢朝着某 些代谢物生命的 方向进行，从而强化次级代谢物的生 物合成，提高某些次级代谢物的产率。
四、工艺流程
①外植体 ②细胞的获取 ③细胞培养 ④分离纯化 ⑤产物
外植体的选择与处理：
从植株取出，用于植物组织培养的植物组织（包括 根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。
贴壁培养
• 滚瓶培养系统 系统结构简单、投资较少、技术成熟、
重现性好，现在仍然在使用该方法；劳 动强度大、细胞生长的表面积小、体积 产率较低。
贴壁培养
• 微载体系统
是由葡聚糖凝胶等聚合物制成直径为50-250微米、 与培养液的密度差不多的微球，动物细胞依附在微球 体的表面，通过连续搅拌悬浮于培养中，呈单层细胞 生长繁殖的培养系统。