核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(RuBPCase)检测试剂盒(RuBP比色法)

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)检测试剂盒(RuBP比色法)简介：

植物光合作用的中，C3途径是所有植物共有的光合碳同化途径，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，Rubisco或RuBPCo或RuBPCase)是一种酶(EC4.1.1.39)，又称1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，分子量约为53kD，由8个大亚基和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，该酶活力的大小反应了植物光合能力的强弱，RUBP羧化酶是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量占叶绿体可溶蛋白50-60%。在植物叶片发育过程中，此酶活性呈规律性的变化。

Leagene核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)检测试剂盒(RuBP比色法)检测原理是在Rubisco催化核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)，1分子后者与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，后者通过3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-1,3-二磷酸，并使NADH氧化。因此1分子CO2被固定，伴随2分子NADH氧化，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，通过分光光度比色法(分光光度计)测定340处吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性水平。该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性，25T规格的试剂盒可检测23-24个样本。

组成：

编号名称TE0449

25T

Storage

试剂(A):Rubisco Lysis buffer250ml4℃试剂(B):Rubisco Assay buffer15ml4℃试剂(C):ATP Solution3ml-20℃试剂(D):CP Solution 1.5ml-20℃试剂(E):CPK Solution1ml-20℃试剂(F):PGK Solution1ml-20℃试剂(G):GAPD Solution1ml-20℃试剂(H):NADH1支-20℃试剂(I):碱性基液3ml RT 使用说明书1份

自备材料：

1、研钵或匀浆器

2、离心管

3、低温离心机

4、恒温箱或水浴锅

5、比色杯

6、分光光度计

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品：

①植物样品：取植物组织清洗干净，切碎，按植物组织：Rubisco Lysis buffer按一定比例，加入预冷的Rubisco Lysis buffer，冰浴情况下充分匀浆或研磨。经纱布或滤纸过滤，留取滤液，，离心，留取上清液即为核酮糖1,5-二磷酸羧化酶粗提液。短期4℃保存，长期-20℃冻存待用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于核酮糖1,5-二磷酸羧化酶的检测。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用Rubisco Lysis buffer进行适当匀浆，离心，取上清液，冻存，用于核酮糖1,5-二磷酸羧化酶的检测。

④高活性样品：如果样品中含有较高活性的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶，可以使用Rubisco Lysis buffer进行恰当的稀释。

2、配制NADH工作液：取出NADH，恢复至室温后溶解于1.1ml ddH2O，混匀，预冷

备用。-20℃保存2月有效。注意：该NADH工作液为过量。

3、配制Rubisco Assay buffer工作液：取出Rubisco Assay buffer、ATP Solution、CP

Solution、CPK Solution、PGK Solution、GAPD Solution、NADH工作液、ddH2O，恢复至室温，按Rubisco Assay buffer：ATP Solution：CP Solution：CPK Solution：PGK Solution：GAPD Solution：NADH工作液：ddH2O混匀，即为Rubisco Assay buffer工作液。最好即配即用，4℃预冷备用，-保存1月有效。

4、配制RuBP Solution：取出RuBP，恢复至室温后溶解于ddH2O，混匀，预冷备用。

RuBP一旦配制成溶液，不稳定，尽快使用。-20℃保存1月有效。

5、Rubisco加样：按照下表设置对照管(备选，一般可以不设对照管)、测定管，溶液应按

照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。

加入物质(ml)对照管(备选)测定管

ddH2O0.04—

Rubisco Assay buffer工作液 1.08 1.08

碱性基液0.080.08

待测样品0.040.04

6、Rubisco测定：混匀，迅速置于分光光度计中，比色杯光径1.0cm，测定吸光度，记为

A测定0；加入RuBP Solution0.04ml至比色杯中，立即计时，每隔30s测定一次吸光度，共测3min，其中至1min时吸光度记为A测定1。如果怀疑待测样品(酶提取液)中存在3-磷酸甘油酸(PGA)，以不加RuBP Solution只加ddH2O为对照，按上表加入物质后混匀，迅速置于分光光度计中，比色杯光径1.0cm，测定吸光度，记为A对照0；加入RuBP Solution0.04ml至比色杯中，立即计时，每隔30s测定一次吸光度，共测3min，其中至1min时340nm处吸光度记为A对照1。

注意：该反应系统是利用速率变化，求得相应OD的变化，进而推算出NADH的消耗速率，再进一步推算出核酮糖1,5-二磷酸羧化酶的量。因此加入RuBP Solution立即计时很重要，每次检测指标不宜过多，否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。

计算：

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性：在碱性条件下，每结合1分子CO2伴随2分子NADH 氧化。组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100% Rubisco(μmol/ml·min)=ΔA×N×10/(6.22×2×d×Δt)

式中：ΔA=(A测定0−A测定1)-(A对照0−A对照1)，即ΔA为反应最初1min内吸光度变化的绝对值(减去对照管最初1min的变化量)。另外，不做对照时，ΔA=A测定0−A测定1，其余同上。

N=酶液稀释倍数

6.22=每μmol NADH在340nm处的吸光系数

2=每结合1分子CO2伴随2分子NADH氧化

d=比色杯光程(cm)=1

Δt=测定时间1min=1

上述公式可简化为：Rubisco(μmol/ml·min)=ΔA×N×10/(6.22×2)

注意事项：

1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，但应考虑根据酶标仪的最大检

测体积。