植物原生质体培养方法
植物原生质体培养(PPT)
杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
植物原生质体培养及细胞融合
柱花草
第二节 植物细胞融合（体细胞杂交）
体细胞杂交（Somatic cell hybridization）：
通过物理或化学的方法使原 生质体融合，通过培养获得 具有双亲遗传物质的后代。 也叫做原生质体融合 （protoplast fusion）。
诱导融合有：物理方法和化学方法
1、物理方法
利用离心、振动、电刺激等物理方法促使原生质体融合。
电融合（Electrofusion）： 1）微电极控制仪：两个微电极尖端，同时与两个靠近的原生
质体表面接触，用5～12μA电波1～5ms（毫秒）。原生质 体发生暂时收缩，引起了原生质膜状态暂时变化，从点连到 面再到形成球形融合体约需要20～30min。
2、原生质体培养的意义
① 比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸 酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采 用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
② 便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物 界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本 科植物，高光效植物，高抗植物）
离（细胞失水），原生质体收缩成球状； ②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。
液 泡
使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对 单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。
植物原生质体培养
第六章：植物原生质体培养请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、基因工程育种、植物组织培养、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。
）自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得成功后，2012年6月16日18时许中国的载人航天飞船“神舟九号”发射成功，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在内蒙古主着陆场安全着陆，这次发射验证了空间交会对接技术，首次实现地面向在轨飞行器进行人员和物资的往返运输与补给，我国的载人航天工程的“空间实验室”工程有望实现。
2002年12月30日凌晨“神舟”四号发射升天，一起带入太空的还有一批特殊的乘客——100粒牡丹花种子。
有着“牡丹城”之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育种，是洛阳城“牡丹战略”的一个重要组成部分。
经过太空环境的各种重粒子、强辐射等作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，也许牡丹花开的会更大更鲜艳。
“神舟四号”共搭载了几百种的植物种子、组织胚胎试管苗、生物菌种等。
此外，太空环境还是一个微重力环境。
中科院（上海生命科学研究院植物生理生态研究所和中科院上海生物化学细胞生物学研究所）的科研人员，分别将精心培育了10年的不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合实验（由于重力沉降现象消失，不同的细胞更容易融合，提高融合率和细胞存活力），以期获得新品种。
这就是这则新闻提到的动植物细胞举行的“太空婚礼”。
自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同时，也推动了物种的进化。
但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。
因此，人们就想方设法，从其它的途径寻找突破口。
细胞融合技术为克服这一障碍提供了一条新的途径。
而植物细胞是有细胞壁包裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。
6.1 原生质体的概念和研究进展6.1.1原生质体的概念原生质体(protoplast)：我们把除去细胞壁、裸露的、有生活力的原生质团或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，称为原生质体。
实验五植物原生质体的分离和培养
实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。
实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。
植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。
分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。
其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。
原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。
酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。
游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。
实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。
2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。
⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。
三、试剂1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏⽔。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。
第八章植物原生质体培养
一、原生质体的分离 二、原生质体的纯化 三、原生质体的培养方法 四、影响原生质体培养的因素 五、原生质体再生
原生质体： 原生质体：指脱去植物细胞壁 后裸露的、有生活力的原生质团。 后裸露的、有生活力的原生质团。 和植物正常细胞相比，除了没有细 和植物正常细胞相比， 胞壁外，具有活细胞的一切特征。 胞壁外，具有活细胞的一切特征。
封口后，离心， 封口后，离心，原生质体漂浮在上面
用吸管收集原生质体液面， 用吸管收集原生质体液面，放入液体培养基 或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次 或甘露醇悬浮洗涤原生质体 次
将原生质体悬浮在液体培养基中备用
漂浮法的优点： 漂浮法的优点：原生质体纯度高。 缺点：原生质体收率低。 缺点：
3、不连续梯度法 、
（2）酶分离法 ）
两步法： 两步法：
果胶酶处理材料
优点：
所获得的原生质 体均匀一致、 体均匀一致、质 量好； 量好；
游离出单细胞
纤维素酶处理单细胞
缺点：
操作复杂， 操作复杂，已被 淘汰。 淘汰。
分离出原生质体
一步法
外植体
酶液配制：注意纤维素酶、 酶液配制：注意纤维素酶、果胶酶和渗 透压稳定剂（甘露醇）的配比及pH 透压稳定剂（甘露醇）的配比及 酶液离心 过滤灭菌后-20℃ 过滤灭菌后 ℃保存 外植体放入酶液， 外植体放入酶液，真空泵抽引渗透处理 26℃摇床振荡2-8小时 ℃摇床振荡 小时
3、原生质体的分离方法 、
首先对外植体进行预处理，有两种方法： 首先对外植体进行预处理，有两种方法：
低温处理：外植体放在4℃下，黑暗中1-2天。 外植体放在 ℃ 黑暗中 天 等渗溶液处理：外植体放在等渗溶液中数小时。 外植体放在等渗溶液中数小时。
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!植物原生质体培养的技术流程一、准备工作阶段1. 确定植物材料：选择适合进行原生质体培养的植物材料，如幼嫩的叶片、茎尖、根尖等。
原生质体培养方法和再生植株的遗传与变异
压，否则细胞团不会继续生长。待 小愈伤组织长至1 -2mm时，应及时
转移至固体培养基使其进一步生长
4.植株再生
原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗 （器官发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再 诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同
供体细胞的分化程度：同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，其 生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的细 胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性
柑橘：叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈伤 组织来源的原生质体才能再生
起始培养密度与培养基
–起始培养密度：适宜密度为1-5×105/ml –培养基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生 –培养基营养成分完全性：越丰富越好
仙客来原生质体的再生
香蕉原生质体再生—Assani等2006 看护培养
Sugarbeet （糖 甜菜）callus and protoplast regeneration
影响原生质体培养的主要因素
基因型
– 番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组 织再生能力受2个显性基因决定(Koornneef等1987)。Cheng和 Veilleux(1991)对芙薯(S. phureja)原生质体培养能力进行遗传 分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受2个独立位点的显性 基因控制(Cheng等1991)
• 变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的 变异有关
• 原生质体再生植株变异可为体细胞遗传学研究和 品种改良提供有益的材料
• 从原生质体培养再生植株已选育一些新品种（体细
胞突变育种）
植物原生质体提取培养1
实验原理：植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。
高Ca高pH法和电融合法：PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。
[实验内容] 1．原生质体分离2．原生质体融合3．原生质体及融合体的培养材料用品：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养。
培养时间约1周。
实验步骤：1．溶液及培养基的配制(1)酶液(2)PEG融合液(3)13％CPW洗液1％纤维素酶1％果胶酶0.7mol/L甘露醇0.7mmol/LKH2PO410mmol/LCaCl2·2H2O pH6.8—7.040% PEG (MW 1500-6000)0.3 mol/L葡萄糖3.5mmol/L CaCl2·2H2O0.7mm0l/L KH2PO427．2 mg／L KH2PO4101.0 mg／L KNO31480．0 mg／L CaCl2·2H2O246．0 mg／L MgSO40．16 mg／L KI0．025 mg／L CuSO413％ W／V甘露醇pH 6.0(4)20％蔗糖溶液(5)黄瓜种子萌发与生根培养基（固体）：1/2MS（注：MS无机成份减半，蔗糖0.2%,琼脂0.7%）(6)黄瓜原生质体形成愈伤组织培养基(固体和液体)：MS+0.05mg/L NAA+1mg/L BA(MS成份见 )(7)黄瓜原生质体愈伤组织分化培养基(固体)：MS+5mg/L NAA(8) 无菌蒸馏水(9) 0.1% HgCl2注：以上（1）-（4）溶液均要用孔径0.2μm滤膜过滤以除去细菌。
原生质体培养的方法
原生质体培养的方法
哇塞，原生质体培养可是一项超级重要的生物技术呢！它就像是打开生命奥秘大门的一把神奇钥匙。
那原生质体培养到底是怎么做的呢？首先要准备好材料，比如植物的细胞或者微生物什么的。
然后就是关键的步骤啦！要把细胞壁去掉，这可不容易哦，得非常小心才行。
就像拆礼物一样，得轻手轻脚的，不然就会把里面的“宝贝”弄坏啦。
去掉细胞壁后，把这些原生质体放在合适的培养基里，让它们能好好生长。
这里要注意培养基的成分和环境条件都得严格控制好，温度啊、湿度啊都不能马虎。
还要注意无菌操作，可不能让杂菌跑进去捣乱呀！
在这个过程中，安全性和稳定性可是至关重要的呀！就像走钢丝一样，得稳稳当当的。
如果不小心出了岔子，那可就前功尽弃啦。
所以整个操作都要非常严谨，不能有丝毫的马虎。
而且要随时观察原生质体的状态，稍有不对就得赶紧调整。
原生质体培养的应用场景那可多了去啦！比如说可以用来进行基因工程，就像给植物或者微生物来个大变身，让它们拥有更厉害的本领。
还可以用来进行新品种的培育，这多牛啊！它的优势也是显而易见的呀，能够更直接地对细胞进行操作，效率更高。
就拿植物新品种培育来说吧，通过原生质体培养，成功培育出了好多抗病虫害、产量高的优良品种呢！农民伯伯们种上这些品种，那可真是大丰收啊，一个个都笑得合不拢嘴。
这就是原生质体培养的实际应用效果，实实在在地给人们带来了好处呀！
原生质体培养真的是一项超级厉害的技术呀！它为我们打开了无数的可能，让我们能够更好地探索生命的奥秘，为人类的发展做出巨大的贡献。
我相信，在未来，它一定会发挥更大的作用，让我们的生活变得更加美好！。
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程
内容:
植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术,主要用于快速培养和大量繁殖目的植物的原生质体。
其技术流程主要包括以下几个步骤:
1. 选择培养原料。
选择健康、无病害的植株作为原生质体的供体,常选择嫩茎、嫩叶等组织。
2. 消毒和预处理。
使用烧瓶或培养皿,在无菌操作台进行表面消毒,然后剪切或撕取原生质体,进行预培养。
3. 建立原生质体悬浮培养系统。
将预培养的原生质体转移到含有培养基的烧瓶或培养皿中,保持液面悬浮状态培养。
4. 原生质体增殖。
在光照培养箱中培养,原生质体进行分裂增殖。
适时传代培养。
5. 原生质体发育。
当原生质体增殖到一定数量后,改变培养基成分,促进原生质体发育为细胞组织块体。
6. 组织块体生长。
继续培养,组织块体继续生长,并通过组织分化形成完整植株。
7. 移栽和驯化。
将组织块体或小植株移植到培养基中生根定植,然后
逐渐转移到土壤中,进行环境驯化,最后完全转入盆栽或野外栽培。
通过上述技术流程,可以实现大量快速培养目标植物的原生质体,并最终获得完整的植株,实现规模化种植。
植物原生质体培养技术
植物原生质体培养技术原生质体含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
植物原生质体培养的意义在真核生物中将遗传物质由一个个体传给另一个个体的传统方法是有性杂交。
但是有时候会存在有性不亲和。
如果通过细胞融合的手段就可以为远缘杂交提供一种可能性。
高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。
原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。
一原生质体的分离1 材料来源植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。
由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。
植株的年龄和生长条件是十分重要的。
来源：①无菌苗②温室培养的苗培养条件：低光照强度（1000lx）、短日照、温度为20～25℃、相对湿度为60%～80% 、以及充足的氮肥供应。
2 前处理要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗入到叶片细胞间隙中。
为此，要做到：撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶液中。
或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好。
或用金刚砂摩擦叶的下表皮。
3提取方法机械法优点：能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大酶解法纤维素酶类（Cellulase）、果胶酶类（Pectolyase）半纤维素酶类（Hemicellulase）、崩溃酶、蜗牛酶注意事项：⑴酶溶剂及其渗透压酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。
渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等浓度范围450～800mmol/L⑵酶处理：酶浓度酶解时间酶解温度二原生质体的纯化材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤压叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。
此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必须除去。
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。
常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。
根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。
原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。
然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。
使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。
二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。
培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。
培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。
原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。
对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。
对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。
接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。
培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。
一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。
保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。
三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。
根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。
转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。
转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。
选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。
分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。
此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。
植物原生质体培养及细胞融合
2．染色观察
• 取一滴0.02％的FDA液与一滴原生质体悬 浮液在载玻片上混匀，25E室温染色5～ 10min。用荧光显微镜观察，激发光波长 330～500nm，活的原生质体产生黄绿色 荧光。用计数器计算存活百分率。
(二)酚藏花红染色法
• 酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性 染料，溶于水显红色并带黄色荧光，其 最大激发和射波长分别为527nm和588nm 。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈 红色，无活性的原生质体因无吸收能力 而五色。
(三)不连续梯度离心法
• 在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll 溶液，构成不同的浓度梯度，在上部滴 人1～2ml酶一原生质体混合液，在150g 下离心5min，不同比重的原生质体漂浮 在不同的浓度梯度的界面上，用吸管收 集原生质体，悬浮洗涤备用。该方法的 优点是获得的原生质体大小均匀致，纯 度高；缺点是操作繁杂，原生质体的收 率低。
(五)分离方法 • 1．机械分离法 • 但由于该方法获得的原生质体产量低， 不能满足实验需要，而且液泡化程度低 的细胞不能采用该方法，因此，机械分 离法没有得到广泛应用。 • 2．酶分离法
• 1960年，德国诺丁汉大学的Cocking首先利用 纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体 ，而且收率高、完整性好、活力强。经过数十 年的不断完善，目前酶分离法已成为植物原生 质体分离最有效的方法。 • 酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先 用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用 纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。其优 点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但 由于操作繁杂，目前已逐渐被淘汰。 • 一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶 溅处理材料，一步获得原生质体。因操作简便 ，目前几乎均采用该方法。
实验九 植物原生质体的分离和培养
实验九植物原生质体的分离和培养实验目的掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。
实验原理原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。
植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。
分离愿生厦籀萨采用酶解法。
其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。
原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。
酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。
游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。
实验用品一、材料1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。
2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。
二、器材超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。
三、试剂1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏水。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。
6. 酶液A纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2％果胶酶(13ectinase，Serva) 1 %(若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。
植物原生质体培养
植物原生质体培养一、目的要求掌握用培养皿进行原生质体的液体浅层培养。
二、基本原理原生质体就是具有细胞质膜而没有细胞壁的植物细胞，具有全能性。
原生质体经过培养后再生出细胞壁就可进行正常的分裂生长与分化。
三、材料、试剂与主要仪器1．仪器与设备培养皿(6cm、9cm)、封口膜、温箱、培养箱、1mL定量移液器、枪头、滴管(近滴头端加入少许脱脂棉)、三角瓶、血球细胞计数器、移液管、洗耳球、无菌滤纸、漏斗、滤器、滤膜、针管(30mL)，光学显微镜、酸度计或pH试纸、电子天平等。
2．试剂（1）原生质体液体培养基MS+2,4-D1mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+葡萄糖0.4mol/L，pH 5.8,灭菌。
（2）酚红（0.1%）：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL，瓶装保存，备用。
3．材料制备好的菠菜原生质体。
四、实验步骤1．原生质体纯化将菠菜原生质体沉淀重新悬浮于10mL原生质体纯化液中，500rpm 下离心10min，原生质体会在蔗糖溶液的顶部形成一条绿带，用无菌吸管或移液管将原生质体转入另一离心管中。
2．原生质体清洗用原生质体洗涤液（CPW液）重新悬浮原生质体沉淀，1000rpm下离心5min，使原生质体沉淀在试管底，重复清洗一次。
之后加适量原生质体液体培养基悬浮原生质体。
3．活力检查凡具活力的原生质体均呈圆球形，在显微镜下可以观察到明显的胞质环流运动。
在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流运动。
可取一滴原生质体悬浮液放在载玻片上，加一滴0.1%的酚红染液，凡有活力的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即染成红色。
4．密度调整用血球计数板于显微镜下计数，用液体培养基调整使原生质体浓度至105～106个/mL。
5．分装培养将调整密度后的原生质体悬浮液分装到直径6cm的培养皿中，每皿4mL，于28℃下培养，第1d是暗培养，第2～3d光照度为300Lx，以后移至光照度1500～2000Lx 条件下培养。
植物原生质体培养及细胞融合过程
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
植物原生质体培养的关键技术
植物原生质体培养的关键技术植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术，它可以用于植物的无性繁殖、基因工程以及育种等研究领域。
下面介绍一些关键的技术步骤和要点。
原生质体的分离和培养1. 原生质体分离：首先从植物中取得组织样本，如叶片、茎段或花器官等，并在无菌条件下进行处理。
通过切细组织样本，加入酶解液，进行酶解反应，最终获得原生质体。
2. 培养基准备：制备培养基，包括基础培养基和添加物质。
基础培养基提供必要的营养物质和能量，而添加物质则供给原生质体特殊的生长因子和激素。
培养基应在无菌条件下配制，用于培养原生质体。
3. 原生质体培养：将分离得到的原生质体放置在培养基上，以适当的温度和光照条件下培养。
培养过程中要定期观察和检查原生质体的生长状态，以及调整培养基的成分和浓度。
原生质体培养的关键因素1. 无菌技术：无菌条件下进行原生质体培养是确保培养过程成功的关键。
在分离、培养和观察过程中，都要保持严格的无菌操作，避免细菌或真菌的污染。
2. 营养物质和激素：培养基中必须提供适当的营养物质和激素，以满足原生质体的生长需求。
营养物质包括碳源、氮源、矿质盐等，而激素会促进细胞分裂和分化。
3. 光照和温度：适当的光照和温度条件对原生质体的生长和发育至关重要。
光照可以提供足够的能量，而温度则影响酶活性和代谢速率。
原生质体培养的应用1. 无性繁殖：通过原生质体培养，可以实现无性繁殖，快速繁殖大量相同的植株。
这对于育种和植物繁殖的研究非常有用。
2. 基因工程：原生质体培养可用于植物的基因工程研究，如基因表达、基因转导和功能验证等。
这为研究植物基因功能和遗传改良提供了有力手段。
3. 药物及次生代谢产物生产：某些植物的次生代谢产物对药物研发具有重要意义。
通过原生质体培养，可以大规模生产这些药物及代谢产物。
结论植物原生质体培养是一项技术复杂但应用广泛的植物组织培养技术。
通过合理控制培养条件和关注关键步骤，可以成功地进行原生质体培养，并应用于植物研究、育种和基因工程等领域。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物原生质体培养方法
1 植物原生质体培养的简史
植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。
原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。
其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。
早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。
直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。
M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。
悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。
同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。
2 原生质体培养方法
2. 1 液体培养法
2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture)
这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。
这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。
用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。
但这种方法也常使原生质体分布不均匀, 发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育, 尤其是难以定点观察单个原生质体的命运。
王吉吉之等认为液体浅层培养在培养过程中, 应经常轻轻晃动培养基, 以增强通气, 促进愈伤组织形成。
2. 1. 2 微滴培养(D rop let culture)
微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法, 它克服了后者局部密度过高和原生质体粘聚的缺点。
此方法是将0. 1m l 或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部, 封口后进行培养。
为避免微滴蒸发, 可将培养器皿置于湿润的环境中, 或在微滴上覆盖矿物油。
此法适用于融合体及单个原生质体培养, 尤其适用于较多组合的实验。
为了比较黄瓜两个品系在不同的植板密度以及在不同的激素水平下原生质体生长情况, Z. K. Punja 等选用了此方法获得很好的效果; 同样, S. V essabutr 等培养百脉根时也比较了不同预处理、不同酶液组合对原生质体培养的影响。
2. 2 固体培养—— 琼脂糖平板法(A grose beadmethed)
固体培养作为凝固剂的物质可以是琼脂、琼脂糖或Gellan gum , 近来很多实验证明, 琼脂糖尤其是低熔点的琼脂糖是一种良好的培养基凝固剂, 并且具有促进原生质体细胞分裂的作用。
琼脂糖平板法是将原生质体纯化后悬浮在液体培养基中, 然后与热融并冷却到45℃的琼脂糖按一定比例混合, 轻轻摇动使原生质体均匀分布, 凝固后封口培养。
由于原生质体彼此分开并固定了位置, 就避免了细胞间有害代谢产物的影响, 既便于定点观察, 又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程。
Z. K. Punja 等证明琼脂平板法比微滴培养及液体浅层培养具有更高的植板率; 甘霖等也得出同样结论。
但此种方法对操作技术要求比较严格, 尤其是温度一定要适宜; 添加低渗透压的培养基和转移再生愈伤组织也比较繁琐, 而且培养的原生质体极易褐变死亡。
2. 3 液体2固体结合培养
2. 3. 1 双层培养法(A grose2liquid doublelayer)
这种方法即在培养皿的底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基,
再在其上进行原生质体的液体浅层培养, 这是目前广泛应用的培养方法之一, 有利于固体培养基中的营养成分(或细胞有用代谢物) 缓慢地向液体培养基中释放, 以补充培养物对营养的消耗, 同时培养物所产生的有害物质也可被固体培养基吸收。
在固体培养物中加入吸附剂如PV P、活性碳, 则更有利于培养物的生长。
刘培等比较4 种不同培养方法对紫草原生质体的影响, 发现双层培养法最有利于紫草细胞生长,并成功进行了单细胞克隆的筛选。
由双层培养法引伸的看护培养(N urse culture) 又叫饲喂层培养(The feeder layer technique) 是将原生质体与其同种或不同种的植物细胞共同培养以提高其培养效率的一种方法, 主要适用于低密度原生质体培养, 融合细胞的筛选和原生质体培养不易成功的植物,如禾本科、豆科植物的原生质体。
此方法是将看护细胞包埋于琼脂或琼脂糖的培养基中, 在上面铺上聚脂纤维或硝酸微孔滤膜, 再将靶原生质体的液体培养液置于其上进行培养。
2. 3. 2 琼脂岛培养法(A grose island culture)
此方法由Sh illito 等于1983 年开创的“念球培养法”衍生改进而来, 也是目前广泛使用的有效的原生质体培养方法。
此方法是将悬浮于液体培养基中原生质体与琼脂糖混合, 用滴管将混合液滴于器皿底部, 待其凝固后再滴加适量液体培养基(多少一般以刚刚浸没琼脂小岛为标准)。
用这种方法可以在摇床上旋转以增强通气状况,并通过定时更换液体培养基以及调整液体培养基的渗透压促进其进一步的生长和发育。
这种方法由于改变了培养物的通气和营养环境, 从而促进了原生质体的分裂及细胞团的形成。
此种方法的缺点是更换液体培养基过频时很容易造成污染, 更换培养基的不同间隔天数对原生质体生长发育也有很大的影响。
3 提高原生质体培养质量的一些常见方法
1) 选择适当的外植体 一般选取生长活跃的部位如分生组织、子叶、茎端等或者有胚性愈伤组织。
2) 预处理 酶解的原生质体如果预先质壁分离,植板率将有所提高, 其原因在于质壁分离时, 原生质体的收缩封闭了胞间连丝, 避免了细胞内容物的流失。
3) 褐变的防止 原生质体早期阶段的培养是遭受机械或生理损伤的植物细胞完成其自身修复的过程,因此原生质体耐受损伤及自身修复能力的大小是决定其能否培养成功的主要因素, 所以, 原生质体培养过程中常出现的现象之一即培养物发生褐变。
一般采用的方法是在培养过程中加入抗氧化剂如V c、A SA 和GSH等或吸附剂PV P 及活性碳或不断更换新的培养基。
4) 不断发展新的培养方法 原生质体培养方法层出不穷, 以上介绍的只是几种常用的方法, 近年来, 不同的研究工作者用了不同的方法, 也产生了很好的效果, 如陈喜文等的海藻酸钠包埋培养, 李名扬等的琼脂糖薄层培养。
4 结束语
原生质体培养方法作为关键的一环, 已愈来愈引起人们广泛的重视, 其总体思路主要围绕以下几个方面展开: 1) 避免原生质体在培养过程中受到机械或化学伤害; 2) 使原生质体处于最佳的营养吸收状态; 3) 多种培养方法相结合。
目前, 原生质体培养方法日臻完善, 为其广泛用于遗传转化、作物改良、生长分化及高产次生代谢物细胞株的筛选打下了坚实的基础。