植物原生质体培养方法

植物原生质体培养方法

1 植物原生质体培养的简史

植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。

植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。

2 原生质体培养方法

2. 1 液体培养法

2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture)

这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。但这种方法也常使原生质体分布不均匀, 发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育, 尤其是难以定点观察单个原生质体的命运。王吉吉之等认为液体浅层培养在培养过程中, 应经常轻轻晃动培养基, 以增强通气, 促进愈伤组织形成。

2. 1. 2 微滴培养(D rop let culture)

微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法, 它克服了后者局部密度过高和原生质体粘聚的缺点。此方法是将0. 1m l 或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部, 封口后进行培养。为避免微滴蒸发, 可将培养器皿置于湿润的环境中, 或在微滴上覆盖矿物油。此法适用于融合体及单个原生质体培养, 尤其适用于较多组合的实验。为了比较黄瓜两个品系在不同的植板密度以及在不同的激素水平下原生质体生长情况, Z. K. Punja 等选用了此方法获得很好的效果; 同样, S. V essabutr 等培养百脉根时也比较了不同预处理、不同酶液组合对原生质体培养的影响。

2. 2 固体培养—— 琼脂糖平板法(A grose beadmethed)

固体培养作为凝固剂的物质可以是琼脂、琼脂糖或Gellan gum , 近来很多实验证明, 琼脂糖尤其是低熔点的琼脂糖是一种良好的培养基凝固剂, 并且具有促进原生质体细胞分裂的作用。琼脂糖平板法是将原生质体纯化后悬浮在液体培养基中, 然后与热融并冷却到45℃的琼脂糖按一定比例混合, 轻轻摇动使原生质体均匀分布, 凝固后封口培养。由于原生质体彼此分开并固定了位置, 就避免了细胞间有害代谢产物的影响, 既便于定点观察, 又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程。Z. K. Punja 等证明琼脂平板法比微滴培养及液体浅层培养具有更高的植板率; 甘霖等也得出同样结论。但此种方法对操作技术要求比较严格, 尤其是温度一定要适宜; 添加低渗透压的培养基和转移再生愈伤组织也比较繁琐, 而且培养的原生质体极易褐变死亡。

2. 3 液体2固体结合培养

2. 3. 1 双层培养法(A grose2liquid doublelayer)

这种方法即在培养皿的底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基,

再在其上进行原生质体的液体浅层培养, 这是目前广泛应用的培养方法之一, 有利于固体培养基中的营养成分(或细胞有用代谢物) 缓慢地向液体培养基中释放, 以补充培养物对营养的消耗, 同时培养物所产生的有害物质也可被固体培养基吸收。在固体培养物中加入吸附剂如PV P、活性碳, 则更有利于培养物的生长。刘培等比较4 种不同培养方法对紫草原生质体的影响, 发现双层培养法最有利于紫草细胞生长,并成功进行了单细胞克隆的筛选。

由双层培养法引伸的看护培养(N urse culture) 又叫饲喂层培养(The feeder layer technique) 是将原生质体与其同种或不同种的植物细胞共同培养以提高其培养效率的一种方法, 主要适用于低密度原生质体培养, 融合细胞的筛选和原生质体培养不易成功的植物,如禾本科、豆科植物的原生质体。此方法是将看护细胞包埋于琼脂或琼脂糖的培养基中, 在上面铺上聚脂纤维或硝酸微孔滤膜, 再将靶原生质体的液体培养液置于其上进行培养。

2. 3. 2 琼脂岛培养法(A grose island culture)

此方法由Sh illito 等于1983 年开创的“念球培养法”衍生改进而来, 也是目前广泛使用的有效的原生质体培养方法。此方法是将悬浮于液体培养基中原生质体与琼脂糖混合, 用滴管将混合液滴于器皿底部, 待其凝固后再滴加适量液体培养基(多少一般以刚刚浸没琼脂小岛为标准)。用这种方法可以在摇床上旋转以增强通气状况,并通过定时更换液体培养基以及调整液体培养基的渗透压促进其进一步的生长和发育。这种方法由于改变了培养物的通气和营养环境, 从而促进了原生质体的分裂及细胞团的形成。此种方法的缺点是更换液体培养基过频时很容易造成污染, 更换培养基的不同间隔天数对原生质体生长发育也有很大的影响。

3 提高原生质体培养质量的一些常见方法

1) 选择适当的外植体 一般选取生长活跃的部位如分生组织、子叶、茎端等或者有胚性愈伤组织。

2) 预处理 酶解的原生质体如果预先质壁分离,植板率将有所提高, 其原因在于质壁分离时, 原生质体的收缩封闭了胞间连丝, 避免了细胞内容物的流失。

3) 褐变的防止 原生质体早期阶段的培养是遭受机械或生理损伤的植物细胞完成其自身修复的过程,因此原生质体耐受损伤及自身修复能力的大小是决定其能否培养成功的主要因素, 所以, 原生质体培养过程中常出现的现象之一即培养物发生褐变。一般采用的方法是在培养过程中加入抗氧化剂如V c、A SA 和GSH等或吸附剂PV P 及活性碳或不断更换新的培养基。

4) 不断发展新的培养方法 原生质体培养方法层出不穷, 以上介绍的只是几种常用的方法, 近年来, 不同的研究工作者用了不同的方法, 也产生了很好的效果, 如陈喜文等的海藻酸钠包埋培养, 李名扬等的琼脂糖薄层培养。

4 结束语

原生质体培养方法作为关键的一环, 已愈来愈引起人们广泛的重视, 其总体思路主要围绕以下几个方面展开: 1) 避免原生质体在培养过程中受到机械或化学伤害; 2) 使原生质体处于最佳的营养吸收状态; 3) 多种培养方法相结合。

目前, 原生质体培养方法日臻完善, 为其广泛用于遗传转化、作物改良、生长分化及高产次生代谢物细胞株的筛选打下了坚实的基础。