腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务规范版
IL-31重组腺病毒载体的构建及鉴定
Ｑ Ｉ ２ ３ ｅ ｓ ｔ ｎｉｅ ｔ ｅ ｙＲ Ｂ 一 ９ Ａｃｎ ，ｈ ｎｉ ｄｂ Ｔ—Ｐ Ｒ ａｄｗ ｓ ｒ ｌ ． ｈ ｔ ｆ ｉ ｓｗｓａａｙｅ ｉ ｕｒｓｅｔ ｏｎｅ． ｅｕｔ Ｉ ｃｍ ｉａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｉ Ｃ ｎ ｅｔ ｎｂｏ Ｔ ｅｔｅ ｏ ｒ ａ ｌｚ ｗｔ ｆ ｏｅｃｎ ｕｔｒＲ ｓｌ ｎｒ ｏ ｂｎ ｎ ｅ ｔ ｉｒ ｖ ｕ ｎ ｄ ｈｌ ｃ ｓ ｅ
ｓ ｕ ｔ ａ ｍｉ ｎ ｅ ｏ ｉ ａ ｔａ ｅ ｏ ｉｕ ．ａ ｆａ ｍｅ ｔｏ ０ ｐ ｄｅｅ ｔｄ ｂ ｈ ｔｌ ｐｌｓ ｄ ａ ｄ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｄ ｎ ｖｒ ｓ ｒｇ ｎ ｆ５ ０ｂ ｔｃ ｅ ｙ ＲＴ —Ｐ ｎ ｇ ｓｅ ｙ ｅ ｚ ｍｅ ｗａ ｄ ｎ ｉ ａ ｔ ｈ ｔｉ ｃ ｕ ｅ ｅ ＣＲ ａ ｄ ｄｉｅ ｔ ｄ ｂ ｎ ｙ ｓ ｉ ｅ ｔ ｌｗｉ ｔ ａ ｎ ｌ ｄ ｄ ｃ ｈ
ｆｌ ｗｅ ｙ ｈ ｍｏｏ ｏ ｓｒｃｍｂｎ ｔｏ ｔ ｏ ｅｐａｍｉ Ａ ｏｌ ｄ ｂ ｏ ｌｇ ｕ ｅ ｏ ｉａｉｎ ｗｉ ｂ ｎ ｌｓ ｄ ｐ ｄＥａｙ一１ｉ ５１ ３．Ｒｅ ｏ ｉａ ｔａ ｅ ｏ ｉ ｓｗ ｓ ｏ ｔｉ ｄ ＂ｔｒｂ ｉｇｐ ｃ ａｅ ｎ ｏ ｈ ｓ ｎ ＢＪ ８ ｃ ｍｂｎ ｎ ｄ ｎ ｖｒ ａ ｂａｎｅ ａ ｅ ｅｎ ａ ｋ ｇ ｄ ｉ ｕ ｆ
【 关键词 】 Ｉ ３ 重组腺病毒 Ｌ一 １
构建
表达
Ｃ ｎｔ ｃｏ ｎ ｅｔｉ ｔ ｎｏ Ｉ ３ ｅ ｍｂ ａ ｔ ｄｎｖ ｌ ｌ ｍｉ． Ｕ Ｎ ｎ — ｉ ｇ ， Ｈ Ｎ ａ —ｅｆ， Ｈ Ｎ ｈｎ— ｏｓ ｕｔｎａｄｉ ｎｉｃ ｉ ｆＬ一 １ ｃ ｉ ｎ ｅｏｉ ａ ｄ Ｈ Ａ ＧＪ ｑ ｎ Ｚ Ａ ＧＨ ｉ ｆ ｒ ｉ ｄ ｆａ ｏ ｒｏ ｎ ａ ａ ｃ ｐｓ ａ ｏ ｎ Ｚ Ａ ＧＣｕ
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048）1、目的及适用范围该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。
2、主要仪器及试剂电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。
限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿3、操作步骤3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。
3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。
3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。
所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。
3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。
如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。
3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。
3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。
3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。
划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。
分装20μL/管，-80℃冻存。
3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。
提取质粒DNA。
推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！服务方（甲方）：___________________地址：____________________________邮编：____________________________电话：____________________________传真：____________________________e-mail：___________________________开户银行：_________________________帐号：____________________________委托方（乙方）：___________________地址：____________________________邮编：____________________________电话：____________________________传真：____________________________甲乙双方根据《中华人民2．载体构建流程报告。
3．病毒重组及鉴定报告。
4．病毒颗粒数检测报告。
5．病毒滴度检测报告。
6．病毒纯度hplc检测报告。
第六条付款方式1．乙方在合同签订当日应当支付合同费用的1/3，即人民币_________。
2．甲方向乙方提交第六条所列的成果当天，乙方支付合同费用的1/3，即人民币_________。
3．甲方向乙方提交第六条所列的报告当天，乙方最后支付合同费用剩余的款项，即人民币_________。
第七条违约责任1．甲方如不按时向乙方提交第六条所列的成果，每拖延一天，应向乙方偿付合同金额千分之三的违约金。
2．合同履行期间，乙方不得自行解除本合同，否则乙方总额向甲方支付违约金。
第八条争议解决方法乙方对产品质量有任何异议，在货到后一周内及时与甲方联系，甲方将复核产品的质量状况，并给予乙方明确的答复。
腺病毒疫苗制作流程
腺病毒疫苗制作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!腺病毒疫苗是一种以腺病毒为载体的基因工程疫苗，其制作流程主要包括以下几个步骤：1. 腺病毒载体的构建。
微型腺病毒载体的扩增和纯化研究（论文）
文章编号:0427-7104(2001D 05-0525-05微型腺病毒载体的扩增和纯化研究邰艳红1 2 王飞1 王琪1 卢大儒1 郑尊2 薛京伦1(1.复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室 上海200433;2.第二军医大学基础部细胞生物学教研室 上海200433D 摘要:微型腺病毒(mAd D 是去除所有编码基因 仅保留两侧反向末端重复序列(ITR D 及包装信号(I D 的新型腺病毒载体.它具有包装容量大 免疫原性小等优点.在大量扩增时 需与缺失E 1区及包装信号的辅助腺病毒共转染入包装细胞(293细胞D 内 S 1超离心纯化 将二者分开.再通过琼脂糖覆盖挑斑~在包装细胞内大量扩增~S 1超离心纯化等步骤 最终得到较为纯净的mAd .但因mAd 结构不稳定 易与辅助病毒发生同源重组 在S 1超离心时不能完全与辅助病毒分开 导致外源基因表达逐步下降.关键词:微型腺病毒;扩增;纯化中图分类号:G 39;R 554文献标识码:A腺病毒(AdenoviruS Ad D 因其滴度高~易于制备~转染效率高等优点 现已成为仅次于反转录病毒载体的应用最广泛的一类病毒载体[1].然而 由于腺病毒基因本身转录的病毒蛋白会诱导宿主产生细胞免疫及体液免疫 最终导致外源基因不能长期稳定地表达 且造成二次注射失败[2];目前常用的腺病毒载体(AdV D 包装容量小(约8kb D 不能容纳大片断外源基因.为了提供腺病毒载体的包装容量 降低腺病毒载体的免疫原性 提高外源基因的表达时间及可重复注射的目的 腺病毒载体的结构一直在不断的被改进[3*5].我们尝试构建去除所有病毒编码基因 仅保留两侧反向末端重复序列(ITR D 及包装信号(I D 共500bp 左右的微型腺病毒载体(mini -Ad mAd D 介导凝血F X 基因及绿色荧光蛋白报告基因(GFP D 进行大量扩增~纯化~离体及活体表达检测.由于微型腺病毒缺失所有结构蛋白基因 仅保留复制及包装所必需的顺式结构 在其大量扩增时 就必须与辅助腺病毒(E 1区缺失D 一同转入包装细胞(含腺病毒的E 1区片断D 为其提供复制及包装所需的蛋白.因此 在大量扩增2种病毒混合液后 mAd 的分离纯化是一个关键问题.本文就微型腺病毒载体的大量扩增及纯化作了初步的尝试 为其下一步的外源基因表达打下基础.1材料和方法1.1细胞系及腺病毒混合液293细胞为含有Ad 5的E 1区并持续表达E 1A 及E 1B 功能蛋白的人胚肾细胞系 由加拿大哥伦比亚大学A .Ama1Sitano 赠送;含凝血F X 基因及GFP 报告基因的微型腺病毒(mAdcFIX ;mAd D 和含B -ga1报告基因的辅助腺病毒(Ad~B D 由美国Baxter 公司张维维博士构建 由本实验室负责扩增及纯化.RSF 细胞(兔成纤维细胞系D 购自美国AT 公司.1.2mad 和adHB 混合斑(6D 的制备将高糖DMEM +10%F S (体积分数D 加入在6孔板培养的293细胞中至细胞50%铺满 改用含2%525第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究 收稿日期:2000-12-07基金项目:国家 863'项目(863-Z 20-02-01D ;国家自然科学基金(39880019D ;国家教育部优秀青年教师基金;教育部博士点基金(98024620D ;霍英东基金;全国优秀博士论文基金;教育部跨世纪人才基金资助作者简介:邰艳红(1970 D 女 医学硕士.625复旦学报(自然科学版D第40卷FCS的高糖DMEM培养基加入20pL mAd及AdHB混合液转染6h后倒去培养液.将加热的12g/L 琼脂糖与加温的2>DMEM液等量混匀调温至42C取2mL混合液轻轻地加入培养孔中室温冷却凝培养箱中.在转染第3天~第5天如法覆盖.第5~7天挑取含mAdcFIX与AdHB的混合病结后转至CO2毒颗粒的半透明空斑20个分别加入0.5mL Tris-HCl(0.01mol/mL pH=8.1D中反复吹打经37C和-80C(各5min D中冻融3次~3000r/min(4C10min D离心后留上清得到20个初次重组腺病毒斑的粗提液.用上述粗提液分别转染293细胞用琼脂糖覆盖~挑半透明感染空斑20个3次冻融和离心得到1 mL含混合腺病毒颗粒的粗提液.各取300pL粗提液转染293细胞.当观察到部分细胞有CPE反应(细胞毒性效应D时收集含混合腺病毒的293细胞用荧光显微镜和X-gal染色鉴定并筛选出荧光反应强~X-gal染色阳性率适中的克隆.1.3mad的大量扩增将首代鉴定的mAd粗提液感染在6孔板中培养的293细胞用含2%(体积分数D小牛血清的DMEM培养待90%的293细胞出现CPE反应时收集细胞~离心(3000r/min4C10min D;取沉淀细胞用0.01mol/L Tris-HCl(pH8.1D复悬(在约5>106细胞中加入0.3mL Tris-HCl液D经37C和-80 C(各5min D中冻融3次;冻融液离心取上清液为mAd粗提液.以同样方法大量扩增病毒粗提液-20 C保存;待收集培养的293-mAd细胞达150瓶(以100mL的培养瓶计算D一同超离心纯化.在每次收集病毒粗提液后取0.1mL感染105贴壁生长的RSF细胞6h后在492nm波长激发光下用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达同时做X-gal染色.确保mAd的转染和包装良好.1.4mad的CSCI超离心纯化[3]共进行连续2次CsCl梯度超离心,在11.5mL的CsCl超离心管中依次加入0.5mL的1.5g/mL CsCl 2.5mL的1.35g/mL CsCl和2.5mL的1.25g/mL CsCl在CsCl液面上缓慢加入mAd及AdHB 5.5mL用石蜡油封顶并配平.离心条件为8150kg(S 41离心机STS型转头D1h.离心后抽取1.35 g/mL和1.25g/mL CsCl之间的单一病毒带.将抽取的病毒液与1.35g/mL CsCl按1:5混匀加入11. 5mL离心管内离心条件为8150kg18h.2条病毒带分别位于距管底2.7cm 3.5cm处.分别抽取至透析盒中用PBS透析3次(每次透析液3000mL D第4次透析液采用10%(体积分数D甘油-PBS每次2 ~3h;纯化产物分装于-20C暂时保存备用.1.5二种病毒的浓度测定取纯化的腺病毒颗粒5pL加120~125pL第4次透析液(PBS+10%(体积分数D甘油D混匀以第4次透析液为空白对照紫外分光光度计(波长260nm D比色根据D(260D值计算Ad颗粒数(mL-1D,即D(260D>稀释倍数>1012.1.6mad的纯度检测将2种病毒纯化液分别加入到70%融合的培养RSF细胞的6孔板内(102particles/cell D6h后在492nm激发光下以荧光显微镜观察一孔细胞的GFP表达另一孔细胞用4%(体积分数D多聚甲醛固定10min X-gal染色4h后再在荧光显微镜下观察GFP的表达同时在普通光学显微镜下观察B-gal的表达情况计算表达报告基因的细胞所占比例.2结果2.1GFP表达的稳定性检测在进行mAd大量扩增的过程中为了使得到的mAd始终保持较高活力我们对每一代扩增的病毒粗提液都进行报告基因GFP的表达检测发现GFP的表达很不稳定其中第1代mAd中GFP表达的细胞约占100%而到第5代降为60%到7代以后降到30%以下(图1所示D.图1mAd 扩增后RSF 细胞GFP 的表达情况Fig .1The expreSSion of GFP in RSF cellS after mAd S amplification .A .第一代;.第五代;C .第七代;D .未感染腺病毒的RSF 细胞.GFP 位于核周(-)2.2mad 的超离心纯化及浓度测定通过连续2次CSCl 梯度超离心 最终在1.35g /mL 和1.25g /mL CSCl 之间得到2条界限不明显的病毒宽带 分别抽取2条病毒带(上方为浮密度小的mAd 距管底3.5cm 下方为浮密度大的Ad~B 距管底2.7cm 测D (26O) 计算病毒颗粒含量 mAd 为2.3>1O 11mL -1;Ad~B 为4.5>1O 11mL -1.2.3mad 的纯度检测感染mAd 组的RSF 细胞在荧光显微镜下可见表达GFP 的细胞占83% X -gal 染色后仅见极少蓝染细胞;感染Ad~B 组RSF 细胞在荧光显微镜下可见GFP 表达占23% X -gal 染色后蓝染细胞占97%(图2所示) 而未感染腺病毒的对照组未见荧光及蓝染(未显示).图2mAd 的纯度检测Fig .2The detection of mAd S purity .A .感染mAd 的RSF 细胞GFP 表达(-);.感染mAd 的RSF 细胞的GFP 表达(Y )及X -gal 染色(-);C .感染Ad~B 的RSF 细胞后GFP 表达(-);D .感染Ad~B 的RSF 细胞的GFP 表达(Y )及X -gal 染色(-)3讨论本实验通过大量扩增~CSCl 超离心纯化 成功地得到了颗粒含量较高且较为纯净的mAd 纯化液.其携带的报告基因GFP 的表达检测证明 mAd 介导外源基因可以在离体培养细胞内较高水平地表达 但同时也发现 mAd 感染的细胞中偶尔也可检测出B -gal 的表达 即mAd 中掺杂有约1%的Ad~B .这种现象应从微型腺病毒载体系统本身的结构分析(图3 此图为本室自制):(1)mAd 缺失所有结构基因 仅保留725第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究500bp 左右的顺式结构,它与野生型腺病毒的结构差异性最大,因此其结构的稳定性也最差,因此,Ad~B 的包装能力远大于mAd ,造成Ad~B 的优先包装(3D .(2D 由于mAd 的结构特点,在复制及包装时,必需有Ad~B 与其共转染293细胞(内含E 1区片断D 为其提供反式补偿.(3D mAd 与Ad~B 及293细胞内E 1区之间存在一定的同源序列.在一定条件下可发生同源重组而产生新的病毒(3,7D .由于以上三种原因,使扩增mAd 过程中产生大量重组病毒,其长度介于mAd 与Ad~B 之间.这样就导致mAd 携带的报告基因的逐步丢失,随扩增代数的增加,GFP 表达下降.而且在CSCI 超离心纯化时2种病毒带界限不清或形成宽带,造成分离的困难.因此在大量制备mAd 时,应注意仅保留扩增的前几代病毒,尽量减少同源重组的机会.尽管目前仅有几个实验室在进行微型腺病毒的研究,腺病毒的同源重组问题仍然引起了极大的关注,并尝试了各种解决的方法.除尝试不同的CSCI 超离心条件外,ParkS 等[8~11]在辅助型腺病毒的包装信号两侧插入IoXP 位点后,与mAd 共转染入293Cre (持续表达Cre 重组酶的293细胞D 细胞中扩增,这样可以通过同源重组将IoXP 位点之间的包装信号缺失,并保证辅助型腺病毒结构的稳定性,有效减少了辅助病毒与mAd 及包装细胞之间的同源重组,同时也降低了辅助病毒的包装效率,氯化铯梯度超离心后,辅助病毒的污染率明显降低.但并未从根本上将2种病毒完全分开.因此,要完全将2种病毒分开,从而得到高纯度的mAd ,除进一步摸索最佳的实验条件外,最根本的手段是进一步改进微型腺病毒载体系统本身的结构,增加其结构稳定性,最大限度地降低同源重组的发生.图3介导F X 的微型腺病毒载体系统简图Fig .3The SimpIe deScription of mAd vector Which mediateS factor XCA :CMV 人actin 启动子9EF :人延长因子启动子参考文献:[1]候云德.分子病毒学[M ].北京:学苑出版社,1990.151-180.[2]Piedra P A ,Poveda G A ,RamSey B .Incidence and prevaIence of neutraIizing antibodieS to commonadenoviruSeS in chiIdren With cyStic fibroSiS :ImpIication for gene therapy With adenoviruS vectorS [J ].PeClCtllCS ,1998,lol(6D :1013-1019.[3]AIemany R ,Dai Yi -fan ,Yan Chun -Iou ,et Cl .CompIementation of heIper -dependent adenoviraI vector :Size effectS and titer fIuctuationS [J ].J vllol meth ,1997,68:147-159.[4]Moorhead J M ,CIayton G ~,Smith R L .A repIication -incompetent adenoviruS vector With thepreterminaI protein gene deIeted efficientIy tranSduceS mouSe earS [J ].J vllol ,1999,73(2D :1046-1053.825复旦学报(自然科学版D 第40卷[5]Morsy M A*Gu M C*Motzel S*et al.An adenoviral vector deleted for all viral coding seguences resultsin enhanced safety and extended expression of a leptin transgene[J].P1oc Natl Acac Sci*1998*95:7866-7871.[6]Kochanek S*Clemens P R*Mitani K*et al.Anew adenoviral vector:Replacement of all viral codingseguences with28kb independently expressing both full-length dystrophin and B-galactosidase[J].P1oc Natl Acac Sci*1996*93:5731-5736.[7]Lochmuller~*Jani A*~uaro J*et al.Emergence of early region1-containing replication-competentadenovirus in stocks of replication defective adenovirus recombinants(A E1A E3)during multiple passages in293cells[J].Pum Gene the1*1994*5:1485-1491.[8]Parks R J*Chen L*Anton M*et al.A helper-dependent adenovirus vector system:Removal of helpervirus by Cre-mediated excision of the viral packaging singal[J].P1oc Natl Acac Sci*1996*93:13565-13570.[9]Schiedner G*Morral N*Parks R J*et al.Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirusvector results in improved in UiUo gene expression[J].Natu1e Genet*1998*18:180-183.[10]~aecker S E*~ansell~*Stedman~*et al.Ln UiUo expression of full-length human dystrophin fromadenoviral vectors deleted of all viral genes[J].Pum Gene The1*1996*7:1907-1914.[11]Lieber A*Chen Y~*Kay M A.Adenoviral preterminal protein stabilizes mini-adenoviral genomes inUit1o and in UiUo[J].Natu1e Bioltechnology*1997*15:1383-1387.[12]Lieber A*Steinwaerder D S*Carlson C A*et al.Integrating adenovirus-adeno-associated virus hybridvectors devoid of all viral gene[J].J V i1ol*1999*73(11):9314-9324.[13]Steinwaerder D S*Carlson C A*Lieber A.Generation of adenovirus vectors devoid of all viral genesby recombination between inverted repeats[J].J V i1ol*1999*73(11):9303-9313.Preliminary Study of Mini-AdenoVirus SystemTAl yan-h on g1*2*WAN G Fei1*WAN G Oi1*LU da-r u1*ZHEN G Zu n2*XUE ji n g-l u n1(1.State K ey L a b o1ato1y o f Genetic nginee1ing*Ln S titute o f Genetic S*School o f L i f e Science S*F ucanU niUe1S ity*Shanghai200433*C hina; 2.D e p a1tment o f C yto b iology*Seconc M ilita1yM ecical U niUe1S ity*Shanghai200433*C hina)Abstract:Mini-Adenovirus(mAd)is a novel adenoviral vector that contains only the viral inverted terminal repeat seguences(I T R)*packaging signal and ci S-acting elements reguired for viral DNA replication and packaging.MAd vector has larger capacity and lower immunogenicity*which showed its proprietary prospect in the field of gene therapy.F or amplification of mAd vector*the cells must be co-transfected with mAd and helper Ad that deleted E1region and packaging signal for packaging cells.T hrough plague assay*amplification and propagation*the density of purified mAd was2.3>1011mL-1.~owever*mAd genome was found unstable and with1%contamination of helper Ad.T he amplification and purification of mAd were discussed.Keywords:Mini-Adenovirus;amplification;purification 925第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究微型腺病毒载体的扩增和纯化研究作者：邰艳红， 王飞， 王琪， 卢大儒， 郑尊， 薛京伦作者单位：邰艳红(复旦大学生命科学学院遗传学研究所;第二军医大学基础部细胞生物学教研室)，王飞,王琪,卢大儒,薛京伦(复旦大学生命科学学院遗传学研究所)， 郑尊(第二军医大学基础部细胞生物学教研室)刊名：复旦学报(自然科学版)英文刊名：JOURNAL OF FUDAN UNIVERSITY年，卷(期)：2001,40(5)1.候云德分子病毒学 19902.Piedra P A;Poveda G A;Ramsey B Incidence and prevalenc e of neutralizing antibodies to common adenoviruses in children with cystic fibrosis:Implication for gene therapy with adenovirus vectors [外文期刊] 1998(06)3.Alemany R;Dai Yi-fan;Yan Chun-lou Complementation of helper-dependent adenoviral vector: Size effects and titer fluctuations 19974.Moorhead J M;Clayton G H;Smith R L A replication-incompetent adenovirus vector with the preterminal protein gene deleted efficiently transduc es mouse ears[外文期刊] 1999(02)5.Morsy M A;Gu M C;Motzel S An adenovi ral vector deleted for all viral coding sequences resultsin enhanced safety and extended expression of a leptin transgene[外文期刊] 1998(14)6.Kochanek S;Clemens P R;Mitani K Anew adenoviral vect or:Replacement of all viral coding sequences with 28 kb independently expressing both full-length dystrophin and β-galactosidase 19967.Lochmuller H;Jani A;Huaro J Emergence of early regio n 1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication defec tive adenovirus recombinants (△E1+△E3) during multiple passages in 293 cells 1994(05)8.Parks R J;Chen L;Anton M A helper-dependent ade novirus vector system:Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging singal[外文期刊] 19969.Schiedner G;Morral N;Parks R J Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirus vector results in improved in v i vo gene expression 199810.Haecker S E;Hansell H;Stedman H In vivo express ion of full-length human dystrophin from adenoviral vectors deleted of all viral genes 1996(07)11.Lieber A;Chen Y H;Kay M A Adenoviral preterminal protein sta bilizes mini-adenoviral genomes in vitro and in vivo[外文期刊] 199712.Lieber A;Steinwaerder D S;Carlson C A Integrating a denovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of all viral gene 1999(11)13.Steinwaerder D S;Carlson C A;Lieber A Generation of adenovirus vectors devoid of all viral genes by recombination between inverted repeats[外文期刊] 1999(11)引用本文格式：邰艳红.王飞.王琪.卢大儒.郑尊.薛京伦微型腺病毒载体的扩增和纯化研究[期刊论文]-复旦学报(自然科学版) 2001(5)。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
腺病毒载体工艺平台介绍
腺病毒载体工艺平台介绍腺病毒载体是一种常用的基因传递工具，被广泛应用于基因治疗和基因工程研究领域。
为了应对不同研究需求和提高载体表达效率，许多研究人员和企业建立了腺病毒载体工艺平台，以帮助加速基因传递和基因治疗的研究进展。
腺病毒载体工艺平台是一种综合的研究和生产系统，主要包括以下几个方面：1. 载体构建：利用分子生物学技术，将感兴趣的基因序列插入腺病毒基因组的合适位点。
在载体构建过程中，可以根据需要选择不同的载体类型、启动子、响应元件等，以调控基因的表达水平和时机。
2. 载体包装：通过与辅助质粒（helper plasmid）共转染细胞，使细胞内形成完整的腺病毒基因组，并通过细胞内重组事件来复制和包装腺病毒颗粒。
载体包装的过程中，通常需要参考文献中的方法和优化步骤，以获得高效的包装效率。
3. 病毒扩增：将包装好的腺病毒载体接种到适宜的宿主细胞中，通过培养和扩增过程，使腺病毒繁殖并增加至足够的浓度。
扩增过程中要注意控制细胞的生长状态、感染剂量和细胞培养条件，以获得高产量和活性的腺病毒。
4. 病毒纯化：通过离心、超滤和柱层析等技术手段，从扩增培养物中纯化腺病毒颗粒。
纯化过程中，可以采用单步或多步骤的方法来去除杂质、浓缩和提纯腺病毒。
5. 固定化：对腺病毒进行固定化处理，可用于获得更稳定、可储存和长期使用的腺病毒制剂。
常用的固定化方法包括酶解固定化、化学固定化、冻干固定化等。
6. 质量检测：对纯化的腺病毒产品进行质量鉴定，包括病毒滴度测定、细胞感染测定、基因表达水平测定等。
同时，还可以进行病毒颗粒观察、基因序列测定、重组蛋白表达等验证实验。
腺病毒载体工艺平台的建立有助于提高基因治疗和基因工程研究的效率和可靠性。
通过系统、规范和高效的工艺流程，可以大幅度减少研究人员在载体构建、病毒包装和纯化等环节上的工作量，同时提高腺病毒的产量和纯度。
这为基因治疗的临床应用以及基因工程研究提供了可靠的技术支持。
腺病毒载体工艺平台是基因治疗和基因工程研究中不可或缺的一部分。
个人技术服务合同仅供参考
个人技术服务合同仅供参考20____个人技术服务合同个人技术服务合同范本随着人们对法律的了解日益加深，越来越多的人通过合同来调和民事关系，签订合同能够较为有效的约束违约行为。
那么合同要怎么拟定？想必这让大家都很苦恼吧，以下是我为大家收集的个人技术服务合同范本，欢迎大家共享。
个人技术服务合同范本1甲方:乙方:现有工程,甲方因施工现场项目管理人员阅历不足,特托付乙方对甲方的现场管理人员进行技术支持和指导。
本工程(协议书)本着公允、公正、诚恳守信、协议双方自愿的原则,详细约定内容如下:一、工程名称:二、工程施工地点:三、工程专业:中水工程四、技术支持范围:中间计量、现场签证、工程变更、试验、工程资料(包含平安资料,不包含施工方案) 五、合同签订时间:x年月日合同截止时间:六、合同金额:小写:1x0 元。
大写:壹拾贰万元整。
七、合同形式:固定价格合同,合同价格固定不变。
(此价格只包含合同范围内的工作,若增加项目需另收取费用) 八、甲方的权利和义务:1、按合同约定的付款式支付乙方的技术服务费用;2、向乙方供应技术服务时所须要的车辆及相关人员,并负责将乙方送回乙方指定地点; 3、乙方技术服务时(施工现场)向乙方供应午餐和晚餐及人员住宿; 4、乙方若无重大过错不得终止合同的履行,乙方若拒绝履行应履行的义务,甲方有终止合同履行的权利。
5、甲方担当合同价款的税金,并以现金的形式支付给乙方;6、供应乙方临时运用的办公室、办公桌、打印机、台式电脑一台、资料编制软件一套、打印用的纸张及施工中有关文具用品、试验仪器和试验化学药品。
7、协作乙方办理施工许可证和开工前的全部手续九、乙方的权利和义务:1、负责工程从开工进场到竣工资料移交且工程结算完成的全过程技术服务。
主要内容为施工过程中的计量申报、现场签证、工程变更、竣工结算、施工过程中的试验检测及资料编制(包含平安资料)。
2、不得无故中断或终止技术服务,工程未竣工验收结算、资料移交之前,不得终止技术服务。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理
重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微⼩病毒科（parvoviridae）家族的成员之⼀，是⼀类⽆法⾃主复制、⽆被膜的⼆⼗⾯体微⼩病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。
研究中采⽤的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在⾮致病的野⽣型AAV基础上改造⽽成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性⾼、宿主细胞范围⼴（对分裂细胞和⾮分裂细胞均具有感染能⼒）、扩散能⼒强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之⼀。
AAV基因组结构悬浮框：包装纯化及滴度检测--侵染细胞过程-- rAAV载体优势—rAAV⾎清型选择—应⽤案例rAAV包装纯化及滴度检测AAV包装过程中，包装质粒负责编码⽬的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作⽤），辅助质粒包含AAV包装所需的cap（编码病毒⾐壳蛋⽩）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒Helper质粒。
三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。
和元⽣物腺相关病毒的⽣产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采⽤三质粒系统在293T细胞中进⾏包装。
所获得的病毒颗粒经过超速离⼼纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进⾏滴定。
另外，我们也可以根据使⽤者要求，提供蛋⽩染⾊检测⾐壳蛋⽩的完整性以及内毒素含量等。
⼀般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml，完全可以满⾜各类整体实验的使⽤要求。
AAV包装流程图滴度检测⽅法：定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。
滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。
基因治疗的使用方法简介与操作流程详解
基因治疗的使用方法简介与操作流程详解基因治疗是一种新型的治疗方法，它利用基因工程技术将正常基因导入患者体内，修复或替换病变基因，从而达到治疗疾病的目的。
本文将介绍基因治疗的使用方法以及详细的操作流程。
1. 基因治疗的使用方法基因治疗可以分为体外基因治疗和体内基因治疗两种方法。
体外基因治疗是将患者的细胞取出后，通过体外培养将目标基因导入细胞中，再将处理后的细胞重新注入患者体内。
这种方法常用于癌症治疗，如CAR-T细胞治疗等。
体内基因治疗是将基因药物直接注射或输注到患者体内，使其通过血液循环进入到靶细胞中。
这种方法常用于遗传性疾病的治疗，如囊性纤维化、血友病等。
2. 基因治疗的操作流程（1）目标基因的筛选：根据患者的病情和基因突变的类型，从基因库中筛选出能够修复或替代病变基因的目标基因。
（2）载体构建：选择合适的载体，将目标基因插入载体中，生成重组载体。
常用的载体包括病毒载体（如腺病毒、腺相关病毒）和非病毒载体（如脂质体、高分子聚合物）。
（3）载体纯化和扩增：将重组载体转染到宿主细胞中，利用细胞培养技术进行载体的纯化和扩增，得到足够量的载体。
（4）基因药物的制备：将得到的载体与适当的辅助剂（如输送剂、保护剂）混合，经过纯化和过滤处理，制备成基因药物。
（5）患者的治疗计划和预处理：根据目标疾病的特点和患者的病情，制定个体化的治疗计划。
在实施基因治疗之前，患者可能需要接受一系列的预处理，如化疗、放疗或免疫抑制剂的使用。
（6）基因药物的输送：将制备好的基因药物通过静脉注射或局部注射的方式输送到患者体内。
在进行输送时，需要严格控制输送剂的剂量和输送速度，确保基因药物能够有效到达到靶细胞中。
（7）基因治疗效果的监测和评估：在基因治疗后，需要对患者的疗效进行监测和评估，以确保治疗的有效性和安全性。
常用的监测方法包括基因表达水平的检测、临床症状的观察和影像学检查等。
（8）随访和复查：基因治疗后，患者需要进行定期的随访和复查，以了解治疗效果的持续性和潜在的不良反应。
腺病毒载体的构建
腺病毒载体的构建第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达⽔平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定⾼表达。
SOCS2⾼表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因⼦和脂质代谢基因表达发⽣了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过⼀种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续⾼表达。
细胞导⼊外源基因是⽬前常⽤的⽅法，但是保证外源基因的⾼效表达需要合适的表达系统。
⽬前常⽤的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导⼊外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把⽬标基因导⼊靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把⽬标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本⾝对脂肪细胞的感染率⼜⽐较低。
⽽腺病毒滴度⾼，适合外源基因⼤量表达，并且可插⼊较⼤的⽬的⽚段，对细胞类型限制较⼩，可感染⾮分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作⽐较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采⽤pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中⾼效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取⾃6周龄昆⽩⼩⿏，⼩⿏购⾃第四军医⼤；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌⾁发育实验室赠送；⼈胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中⼼。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋⽩Marker购⾃Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购⾃NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购⾃Takara公司；穿梭质粒⼩提试剂盒购⾃Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购⾃Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购⾃天根公司；OptiMem优化培养液购⾃Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购⾃Invitrogen公司。
医学：重组腺病毒载体的构建
02
重组腺病毒载体的构建涉及多个步骤，包括选择合适的腺 病毒血清型、设计外源基因的插入位点、构建重组质粒、 转染腺病毒生产细胞等。这些步骤需要精确的操作和严格 的质量控制，以确保重组腺病毒载体的安全性和有效性。
03
重组腺病毒载体的构建过程中，需要注意选择适当的腺病 毒血清型，以确保与宿主细胞的良好亲和力和低免疫原性 。同时，需要对外源基因进行适当的修饰和优化，以提高 其在重组腺病毒载体中的表达效率和稳定性。
医学重组腺病毒载体的构建
目录
• 重组腺病毒载体概述 • 重组腺病毒载体的构建过程 • 重组腺病毒载体的应用研究 • 重组腺病毒载体的安全性及挑战 • 参考文献
01 重组腺病毒载体概述
腺病毒的特点
01
02
03
宿主范围广
腺病毒对多种细胞类型具 有感染能力，包括人体细 胞。
基因容量大
腺病毒载体可以携带较大 的基因片段，适合用于基 因治疗和疫苗研发。
02 重组腺病毒载体的构建过 程
目的基因的获取与。
目的基因的处理
对目的基因进行限制性酶切、修饰、 纯化等处理，以便于后续的克隆和鉴 定。
载体的选择与处理
载体的选择
根据实验需求选择适合的载体，如腺病毒载体、质粒载体等。
载体的处理
重组腺病毒载体的构建过程简介
选择合适的腺病毒血清型
根据应用需求选择对特定细胞类型感染力强、 免疫原性弱的腺病毒血清型。
构建重组质粒
将目的基因插入腺病毒载体的转移质粒中， 形成重组质粒。
转染与筛选
将重组质粒转染进包装细胞，筛选出能够产 生重组腺病毒的细胞克隆。
病毒扩增与纯化
在筛选出的细胞克隆中扩增重组腺病毒，并 进行纯化和浓缩。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 6.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactop yranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒载体构建ppt课件
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
基因组外游离状态下表整达理版，课整件合突变致癌可能性小。
9
几种病毒载体的区别
整理版课件
10
整理版课件
11
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
整理版课件
5
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
整理版课件
重组系统由2种质粒 构成：一、包含全
部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
6
二、小的穿梭质粒，其带有
目的基因的表达盒以及表达
盒两侧的与大质粒上的目的
基因拟插入部位同源序列
（左右臂）
整理版课件
7
整理版课件
包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
整理版课件
4
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
•腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒 症状、呼吸系统不适等。
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告一、研究背景和意义腺病毒是一种广泛存在于哺乳动物中的DNA病毒，能够感染多种类型的细胞，具有高效的基因转导能力和良好的安全性。
因此，腺病毒已经成为了重要的基因转导载体，被广泛应用于基因治疗、基因工程和生物学研究等领域。
其中，重组腺病毒作为基因转导载体具有如下的优点：（1）能够稳定地表达外源基因：腺病毒具有较高的基因转导率，可以长时间稳定地表达外源基因，从而实现目标蛋白的大量表达。
（2）病毒颗粒结构复杂：腺病毒颗粒结构复杂，能够有效地包装外源基因，从而保证表达的效率和精度。
（3）有良好的生物安全性：腺病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组中，从而减少对宿主基因组的影响，有良好的生物安全性。
本研究主要针对重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定展开，主要研究内容包括以下几个方面：1. 进一步优化pAd-CD载体的构建，提高其基因转导效率。
2. 针对pAd-CD载体的具体应用领域，开展针对性的效果评价和分析。
3. 探索pAd-CD载体在基因治疗、基因工程和生物学研究等方面的应用潜力。
本研究的开展能够拓展腺病毒在基因转导载体方面的应用范围，对基因治疗、生物学研究等领域具有一定的应用前景。
二、主要研究内容和研究方案1. 重组腺病毒载体pAd-CD的构建（1）提取并纯化腺病毒：采用经典的离心法等分离技术，从已知类型的腺病毒细胞株中提取并纯化腺病毒。
（2）选择并设计适合的pAd-CD载体：根据研究方向选择并设计适合的重组腺病毒载体。
（3）克隆外源基因：将目标基因与pAd-CD载体进行克隆，形成包含外源基因的载体。
（4）包装重组腺病毒：使用适当的技术和装置，将载体转化为重组腺病毒并包装成病毒颗粒。
2. 重组腺病毒载体pAd-CD的鉴定（1）DNA测序鉴定：使用合适的方法对构建出的pAd-CD载体进行测序鉴定。
（2）病毒包装率检测：测定包装率，评估重组腺病毒的制备质量。
（2）病毒的基因转导效率检测：采用不同的检测方法检测病毒的基因转导效率，分析重组腺病毒的基因转导效率及其影响因素。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 3技术概况 3AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4构建重组AdEasyTM转移载体 5细菌内AdEasyTM重组子的产生 5共转化的一般原则 5共转化方法 5预期结果 5AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 6 细胞铺板 6磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 8QBI-293A细胞培养 8QBI-293A细胞的初始培养 8QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8QBI-293A细胞的冻存 8QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 感染QBI-293A细胞 9病毒空斑形成 9琼脂糖覆盖被感染细胞 9MOI测定 10腺病毒感染力测定 10X-Gal染色 11重组腺病毒的筛选和纯化 11挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 病毒空斑挑选和小量扩增 12Western杂交 13Southern杂交和点杂交 13病毒裂解产物PCR 14免疫测定 14功能测定 14病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 不连续密度梯度离心 17连续密度梯度离心 17病毒溶液去盐和浓集 17病毒滴度测定 18nm (VP/ml) 19空斑测定法 2050%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 22QBI-293A细胞培养 22感染力测定 22转移载体克隆 23在BJ5183细胞中共转化和重组 24转染QBI-293A细胞 25筛选和测定 25在QBI-293A细胞中表达 26重组腺病毒的扩增 26纯化 26病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM D ulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务规范版
Construction of recombinant adenovirus vector, amplification and purification
合同编号：XX-2020-01
甲方：___________________________乙方：___________________________ 签订日期：____ 年 ____ 月 ____ 日
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务规范版
前言：合同是民事主体之间设立、变更、终止民事法律关系的协议。
依法成立的合同，受法律保护。
本文档根据服务合同内容要求和特点展开说明，具有实践指导意义，便于学习和使用，本文档下载后内容可按需编辑修改及打印。
服务方（甲方）：___________________
地址：____________________________
邮编：____________________________
电话：____________________________
传真：____________________________
e-mail：___________________________
开户银行：_________________________
帐号：____________________________ 委托方（乙方）：___________________
地址：____________________________
邮编：____________________________
电话：____________________________
传真：____________________________
甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。
第一条病毒名称
甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_________腺病毒，腺病毒滴度_________pfu/ml。
第二条费用及价格（人民币）
1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买；
2．合同总价_________元，（大写）_________。
第三条乙方责任
1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。
2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、出售或租借给他人使用。
3．保证乙方应用甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品进行的研究符合现行的法律法规，不得应用甲方腺病毒产品进行有损于人类安全或其它非法目的'的研究。
4．所有在研究过程中经本产品及其一切复制、衍生产品处理过之动物、植物、蛋类以及乳制品等均应妥善处理，决不可食用或出售。
5．乙方及乙方的课题组在发表文章中注明该重组腺病毒购自甲方，并将已发表文章复印一份给甲方。
6．甲方的腺病毒产品是由人5型腺病毒改造而来，在特殊情况下仍可能具有一定的致病性，乙方必须遵守国家安全使用腺病毒原则。
任何违反该原则而引起的实验人员或其他人员的健康问题，甲方概不承担法律责任。
7．若乙方不再应用本产品须将其销毁或返还甲方。
8．乙方承诺在使用本产品的过程中不会做出任何有损于甲方的言论或行为。
9．乙方对其提供技术服务的病毒不得转卖、转送及商业化用途。
10．乙方在收到甲方提供的腺病毒制品后，应立即将其分成小份装于无菌的病毒冻存管中并低温保存于-20℃，避免反复冻融而导致病毒滴度下降。
由于使用不当引起的质量问题由乙方承担。
第四条甲方责任
1．甲方所提供之腺病毒产品需经过严格的质量控制，其所携带的基因经过测序确证无误。
2．甲方的腺病毒产品通过快递公司送达乙方。
3．如果乙方对产品质量有任何异议，请在货到后一周内及时与甲方联系，甲方将复核产品的质量状况，并给予乙方满意的答复。
第五条甲方应在_________年_________月_________日前完成技术服务工作，并向乙方提交下列成果及其报告：1．成果：重组腺病毒，分别为_________。
-------- Designed By JinTai College ---------。