20041211_细菌鉴定中常用的生理生化反应

实验原理－－有机酸盐及氨盐利用试验
柠檬酸盐利用试验
柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸 钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来 源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳 源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠 檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时 培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝 色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养 基上不生长，培养基不变色。
实验步骤
靛基质(吲哚)试验
将被检菌接种到 胰蛋白胨水培养基 中，37℃培养24h～ 48h后，沿试管壁滴 加数滴吲哚试剂于 培养物液面，观察 结果。 出现红色者为阳 性，出现黄色者为 阴性。
实验步骤
硫化氢试验：
将大肠杆菌和变 形杆菌以接种针 穿刺接种到醋酸 铅或柠檬酸铁氨 培养基中，37℃ 培养24h，观察 结果，若有黑色 出现者为阳性。
细菌鉴定中常用的生理生化反应
陈金春,林琳， 郑重，陈晶瑜，王亚武 清华大学微生物实验室,100084
实验目的和内容
a. 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定 中常用的生理生化反应的测定方法； b. 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分 解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样 性； c. 了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及 其代谢产物在鉴别细菌中的意义；
实验仪器,材料和用具
实验仪器
37℃恒温培养箱、20℃恒温培养箱（室温代替）。
微生物材料
大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四 种菌种的斜面各1支。
试剂
甲基红试剂、V．P试剂、吲哚试剂、格里斯试剂 (硝酸盐利用试验)、卢戈氏碘液(淀粉水解试验)
实验仪器,材料和用具
实验用具
试管：每份每个试验2根试验，1根对照， 8个试验共27根。 无菌乎皿：每份2个 杜氏小管：每份6个。 接种环、酒精灯、试管架、记号笔。
实验原理
细菌生化试验
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基 质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或 少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试 验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其 代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌 的生化反应。
实验原理－－细菌生化试验
糖(醇)类发酵试验
不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵 糖(醇)的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不 ( ) 相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的 产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先 加入溴甲酚紫[pH5．2(黄色)一6．8(紫色)]，当发 酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产 生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证 明。
实验步骤
淀粉水解试验
将配制好的淀粉培养基冷却到50℃左右，以无菌 操作制成平板。 用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边， 再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。置 37℃温箱培养24h。 将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于 平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平 板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已 被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力 的大小。
实验仪器,材料和用具
培养基
葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基：每份各6支试管，每 支5～10mi培养基，灭菌。用于糖类发酵试验。 葡萄糖蛋白胨水培养基：每份3支试管，每支5～10mi培养 基，灭菌。用于甲基红和V．P试验。 胰蛋白水培养基：每份3支每支5～10mi培养基，灭菌。用 于吲哚试验。 柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基；每份3支，每支5～ 10ml培养基，灭菌。用于硫化氢试验。 营养明胶培养基：每份3支，每支．5～10ml培养基、灭菌。 用于明胶液化试验。 淀粉培养基：每份2个平皿，每平皿约20ml培养基，灭菌后 倒入平皿。用于淀粉水解试验。 柠檬酸钠培养基：每份3支，每支5一lOml培养基，灭菌， 做斜面。用于柠檬酸盐利用试验。
Байду номын сангаас
实验原理－－细菌生化试验
甲基红(Methylred)试验(该试验简称MR试验)
很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮 酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸 等，使培养基的pH降低到4．2以下，这时若加 甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色 范围是pH4．4(红色)～pH6．2(黄色)。若某些 细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但 很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基 的pH仍在6．2以上，故此时加入甲基红指示剂， 呈现黄色。
实验原理－－大分子物质代谢实验
靛基质(吲哚)试验
某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色 氨酸，产生靛基质(吲哚)，靛基质与对二甲基 氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质(红色化合 物)。
硫化氢试验
某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨 酸等)，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐 或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫 化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。
实验步骤
糖(醇)类发酵试验
编号 在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌 名和组号，下同。 接种 取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌， 另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同 样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普 通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。 将已接种好的培养基置37℃温箱中培养24h。 观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培 养基的pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄 色)，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸 色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管(杜氏小管)中 有气体。气体占整个倒置小玻管的10％以上。若被检细 菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。
实验步骤
甲基红试验(MR试验)
将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白 胨水培养基中，37℃培养 48h，加甲基红指示剂 数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色 者为阴性。
伏一普二氏试验(V．P．试验)
将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中， 37℃培养48h，取出，加入40％KOH 5～10滴， 然后再加入等量的5％α一萘酚溶液，用力振荡， 再放入37℃温箱中保温15～30min，以加快反应 速度。若培养物呈现红色，为伏—普反应阳性。
实验原理－－大分子物质代谢实验
明胶液化实验
某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝 固能力，呈现液体状态，是为阳性。
淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不 做）
细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生 的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或 进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸 收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变 化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。
实验步骤
明胶液化试验
取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接 种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置20℃ 培养5～7天。观察明胶培养基液化情况。若被检 细菌20℃不易生长，可放37℃培养，但在此温度 下明胶培养基呈液状，故观察结果时，应将明胶 培养基轻轻放入4℃冰箱30min，此时明胶又凝固。 若放置于冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试 验细菌液化，是为阳性。
实验步骤
柠檬酸盐利用试验
取少量被检菌接种 到柠檬酸盐培养基 上，37℃培养24h后， 观察结果。培养基 变深蓝色者为阳性。 培养基不变色，则 继续培养7天，培养 基仍不变色者为阴 性。
实验结果
糖发酵实验
结果与讨论
记录上述各试验结果； 在吲哚试验和硫化氢试验中细菌各分解 何种氨基酸?
谢谢大家！