核酸化学2

教案20010～2011学年第二学期课程名称生物化学院（部）医学院教研室(实验室) 生物化学与分子生物学授课班级09级药学理论主讲教师刘广超职称教授使用教材《生物化学》（6版）吴梧桐主编人民卫生出版社生物化学实验指导》石渊渊主编河南大学出版社河南大学教务处制二○○八年二月教学过程四 DNA与基因组织一、DNA与基因基因是一段含有特定遗传信息的核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。

基因分为结构基因和调节基因结构基因（structural gene）：有实际表达产物, 为特定的RNA和多肽编码的基因调节基因或调节顺序（regulatory sequence）：DNA分子中只起调节功能的非转录和非翻译序列●基因组(genome): 某生物体所含全部基因的总和●基因组学（genomics）：研究生物体的基因组的大小、组织和基因组成的学科★可见：基因是实体, 其物质基础是DNA(或RNA); 基因是遗传信息传递和性状分化发育的依据；基因(类型)是可分的。

二、原核生物基因组的特点1. 除调节序列和信号序列外, DNA的大部分为结构基因，每个基因出现频率低。

2. 功能相关的基因常串联在一起, 并转录在同一mRNA中（多顺反子）。

3. 有基因重叠现象。

三、真核生物基因组的特点1. DNA分子中有重复序列单拷贝序列：在整个DNA中只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因。

中度重复序列：在DNA中可重复几十次到几千次。

高度重复序列：或称简单序列DNA，可重复几百万次高度重复序列一般富含A-T对或G-C对。

富含A-T对的在密度梯度离心时在离心管中形成的区带比主体DNA更靠近管口，富含G-C对的更靠近管底，故称为卫星DNA（satellite DNA）2. 有断裂基因（split gene）由于基因中内含子的存在内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现的居间序列。

外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。

内含子(intron)指大多数真核结构基因中的居间序列(intervening sequence)或不编码序列。

它们可以转录，但在基因转录后，由这些居间序列转录的部分经加工被从初级转录本中准确除去，才产生有功能的RNA。

内含子常比外显子长，且占基因的更大比例。

真核基因所含内含子的数目、位置和长度不尽相同，如鸡卵清蛋白基因的外显子被7个内含子隔开(图)，鸡卵伴清蛋白基因有17个内含子，α-珠蛋白基因有2个内含子，胶原蛋白基因含50多个内含子等。

例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferon gene)无内含子。

内含子的功能－－－－●可能含有调节信号，调控基因的表达；●将基因分割成“可交换的单位”，有利于重新组合出新的基因五RNA的结构与功能——RNA分子是含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链。

一、RNA的结构（一）RNA分子主要碱基：A、U、G、C（二）连接方式：3′,5′－磷酸二酯键（三）单链:自身回折,局部双螺旋(与A-型DNA 结构相似)（有些病毒为双链RNA）（四）RNA的高级结构特点1. RNA是单链分子，因此，在RNA分子中并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基总数。

2. RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构, 不能形成双螺旋的部分则形成突环。

这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。

3. 在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。

G 除了可以和C 配对外，也可以和U配对。

G-U配对形成的氢键较弱。

同类型的RNA, 其二级结构有明显差异。

4. tRNA中除了常见的碱基外, 还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分。

二、RNA的类型（一）tRNA （transfer RNA）1.概况（1）含量：占细胞内RNA总量的约15%。

（2）种类：50 ~ 60种，有些真核生物可达100多种（运载同一氨基酸的几种tRNA 称为同工tRNA ）。

（3）分子量：23 000～28 000，4S（4）功能：蛋白质合成中的氨基酸运载工具；另外，在蛋白质合成的起始、反转录合成DNA 及其他代谢和基因表达调节中也起重要作用。

2.一级结构1965年Holley 等测定了酵母丙氨酸tRNA一级结构（1）组成：以76个核苷酸为标准，通常由73 ~ 93个核苷酸组成。

（2）修饰碱基（稀有碱基）：较多，可达碱基总数的10%~15％。

（3）3′端皆为CpCpAOH; 5′端多为pG , 也有为pC 的。

（4）有一些保守序列，与其特殊的结构与功能有关。

3. tRNA的二级结构——三叶草模型tRNA的二级结构都呈“三叶草” 形状，在结构上具有某些共同之处，一般可将其分为四臂四环：包括氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、T C区和可变区。

除了氨基酸接受区外，其余每个区均含有一个突环和一个臂。

tRNA的三叶草型二级结构主要特征：四环四臂1、分子中由A-U、G-C碱基对构成的双螺旋区称臂，不能配对的部分称环，tRNA一般由四环四臂组成。

2、5’-端1~7位与近3’-端的67~72位形成7bp的反平行双链称氨基酸臂，3’端有共同的-CCA-OH 结构，其羟基可与该tRNA所能携带的氨基酸形成共价键。

3、第10～25位形成3~4bp的臂和8~14b的环，由于环上有二氢尿嘧啶（D), 故称为D 环, 相应的臂称为D臂。

4、第27~43位有5bp的反密码子臂和7b的反密码子环，其中34~36位是与mRNA相互作用的反密码子。

5、第44~48位为可变环，80％的tRNA由4~5b组成，20％的tRNA由13~21b组成。

6、第49~65位为5bp的TψC臂和7b的TψC环，因环中有TψC序列而得名。

7、tRNA分子中含有多少不等的修饰碱基，某些位置上的核苷酸在不同的tRNA分子中很少变化, 称不变核苷酸。

4.tRNA的三级结构在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型。

(单链突环互相靠近形成的环间碱基对是三级结构稳定的重要因素)tRNA三维结构与其功能密切相关位点：●tRNA的倒L结构与核糖体上的空穴相符；●TψC环中GTψC与核糖体中5S rRNA相应区段有碱基互补关系；●L型分子表面化学基团排列的维妙化，与一些酶（氨基酰-tRNA合成酶）和蛋白质与tRNA分子的相互识别有关。

（二）rRNA (ribosomal RNA)1.核糖体的化学组成rRNA：60%；蛋白质：40%原核生物核糖体70S 包括30S小亚基和50S大亚基真核生物核糖体80S 包括40S小亚基和60S大亚基2. 功能：蛋白质合成场所3. rRNA结构: rRNA占细胞RNA总量的80%左右（1）一级结构：与tRNA不同，rRNA的修饰（如甲基化）多发生在核糖上，故含有修饰核苷而非修饰碱基（2）二级结构：茎环结构大肠杆菌16SrRNA有一半核苷酸形成链内碱基配对，整个分子约有60个螺旋。

未配对部分形成突环，一些分子内长距离的碱基互补使相隔很远的部分配对，形成复杂的多环多臂结构。

4.rRNA的功能（1）rRNA除作为核糖体的骨架外,还分别与mRNA和tRNA作用，催化肽键的形成，促使蛋白质合成的正确进行。

（2）在有足够量的Mg2+存在下分离到的16S rRNA处于紧密状态，其空间结构与30S亚基的形状和大小非常相似（3）16S rRNA（1 542b的序列已确定）1535~1539b的CCUCC与mRNA的相应序列（mRNA 的5’端SD序列）有互补关系（4）大肠杆菌23S rRNA 2904b的序列亦已确定（5）23S rRNA的形状与50S 亚基相似，再次说明RNA自身折叠形成的构象决定了核糖体亚基的形态（6）真核生物的18S rRNA除多一些臂和环结构外，空间结构与16S rRNA十分相似（7）已经证明23S rRNA的特定区域在蛋白质合成时对肽键形成有催化作用。

（8）真核生物28S rRNA空间结构与大肠杆菌23S rRNA相似（9）5S rRNA 60％以上的碱基形成分子内碱基对，己发现有一特定序列与tRNA分子上的GTψCG互补核酸的理化性质、变性和复性及其应用一、核酸的一般理化性质DNA是线性高分子，因此粘度极大，而RNA分子远小于DNA，粘度也小得多。

DNA分子在机械力的作用下易发生断裂，为基因组提取带来一定困难。

核酸是两性电解质，因为它既有酸性的磷酸基，又有碱基，故可在电场中泳动。

通常因磷酸基酸性较强，核酸常显示酸性。

由于碱基成分的紫外吸收特征，DNA和RNA溶液均具有260nm紫外吸收峰，这是DNA和RNA定量最常用的方法。

二、D NA的变性1．定义：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。

1．本质：氢键断裂（二级结构破坏）2．如何监测DNA是否发生变性监测DNA是否发生变性的最常用的指标是DNA在紫外区260nm波长处的吸光值(A260)变化。

当核苷酸的摩尔数相同时，A260值大小有如下关系：单核苷酸>单链DNA>双链DNA∴DNA变性，双链发生解链过程中，DNA的A260增加，并与解链程度有一定的比例关系。

这种关系称为DNA的增色效应(hyperchromic effect)。

实验室最常用的使DNA分子变性的方法之一是加热。

如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。

从曲线中可以看出，DNA的变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的温度范围内完成的，在这一范围的中点称为DNA的解链温度(melting temperature，Tm)，用Tm表示。

Tm代表50％DNA分子解链时的温度。

一种DNA分子的Tm值的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm值越高。

DNA的Tm值可以根据其G+C含量计算，计算公式为：Tm=69.3+0.41(％C+C)，小于200bp的寡核苷酸的Tm的计算公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T)。

三、DNA的复性与分子杂交变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。

复性可用低色效应来衡量。

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程也称为退火(annealing)。

DNA的复性速度受到温度的影响，复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性。

如加热后，将其迅速冷却至4︒C以下，则几乎不可能发生复性。

这一特性被用来保持DNA的变性状态，一般认为，比Tm低25︒C的温度是DNA复性的最佳条件。

如果把不同的DNA链放在同一溶液中作变性处理，或把单链DNA与RNA放在一起，只要有某些区域(当然也可以是链的大部分)有成立碱基配对的可能，复性后它们（不同的DNA，DNA与RNA以及RNA）之间就可形成局部的双链。