第五章 色谱理论
色谱分析的基本理论和方法
色谱分析的基本理论和方法色谱分析是一种通过物质在不同条件下在固定相和流动相之间的物理或化学作用而实现分离、富集和检测目标物质的分析方法，它是现代化学分析中最常用的方法之一。
色谱分析主要应用于化学合成、生物化学、医药研究、环境监测、食品安全等领域。
本文将从色谱分析的基本理论、方法和实现过程三个方面阐述色谱分析的原理和应用。
基本理论色谱分析基于物质在固定相和流动相中的物理或化学作用，实现物质之间的分离和富集。
在色谱分析中，固定相是一种具有在温度和压力下稳定的化学性质的物质，称为固定相。
流动相是一种可以移动并与固定相相互作用的溶液或气体。
色谱分析常用的固定相有硅胶、氢氧化铝、聚乙烯醇、聚四氟乙烯等，流动相则可以根据不同的具体情况选择有机溶剂、缓冲液或气体。
色谱分析的基本原理是物质在固定相和流动相中的行为存在差异，这种差异可以通过物质与固定相的相互作用特性来实现分离。
常见的固定相有分子筛、离子交换树脂和填料柱等，它们都拥有独特的分离机制。
当样品进入色谱柱，被保留在柱中，而流动相则将未被保留的样品带出柱外，实现物质之间的分离。
不同的物质在流动相和固定相之间的相互作用力量不同，它们在色谱柱中停留时间的长短也不同，这就是基于物质在固定相和流动相中化学或物理性质不同而实现的分离。
实现过程色谱分析实现过程包括前处理、分离、富集和检测四个阶段。
前处理是为了加速色谱分离和提高检测灵敏度，它一般包括样品的提取、洗脱、浓缩和纯化等步骤。
在提取中，可以利用溶剂把样品中的目标化合物转移到有机相中，去除其他杂质。
浓缩和纯化则是为了提高样品中目标化合物的浓度和纯度，这样可以增加检测灵敏度和准确度。
分离是色谱分析的核心，它是通过不同组分在色谱柱中的相互作用特性来实现物质之间的分离。
富集则是为了提高检测灵敏度和准确度，采用加强色谱性能、提高目标化合物在柱中保留时间的方法，比如固定相和流动相的配比调整、温度控制等。
最后，检测是为了确定分离的组分及其含量，这可以使用不同的检测器进行检测，如荧光检测器、紫外线检测器和电导检测器等。
色谱理论
• 4．相平衡参数 分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化 合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之 比。K＝ Cs/Cm 。 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也 与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念： 吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数 （或 称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配 系数来表示。 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓 度很低时（CS、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度 无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的 色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这 时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时 色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱 内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长， 后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混 合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物 中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
• 基本概念和理论 一、基本概念和术语 1．色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得 到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后， 检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬 时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件 如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物 或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的 曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态 分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰 (leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。
色谱理论基础
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色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔 板数：n，则三者的关系为：
n=L/H 色谱峰的方差 与柱长或保留时间的关系为：
H
2 L
L
t2 L
t
2 R
理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
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d2 f
d2 f
2.载气流速与柱效——最佳流速
载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主 要因素，流速，柱效。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的 主要因素，流速,柱效 。 H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影 响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度 对流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速 即为最佳流速。
区域宽度──色谱过程的动力学因素。
色谱分离中的四种情况如图所示：
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讨论：
色谱分离中的四种情况：
① 柱效较高，△K(分配系数)较大，完全分离。 ② △K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③柱效较低，△K较大，但分离的不好。 ④ △K小，柱效低，分离效果更差。
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分离度的表达式：
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例题2：
在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和 12.8s，计算分离度（柱长 1m，n=3600）。要达到完全 分离，即R=1.5，所需要的柱长。 解： t 4 12.2
Wb1 4
R1
3600 t R 2 4 12.8 Wb 2 4 0.8533 n 3600
色谱理论概述及相关术语
g. 相对保留值r2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。
t'r 2 Vr'2 r2 ,1 ' ' t r 1 Vr 1 注意：r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动
相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！ 具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值 ，此时以 表示：
入检测器时，输入信号不变
，此时的响应值是背景信号 ，在色谱图上称为基线。 2）峰高：色谱峰顶点与基线 的距离。
3）保留值(Retention value, R) a. 死时间(Dead time, t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时
的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，
色谱过程及工作原理
分离原理：使混合物中各组分在两相 间进行分配，其中一相是不动的称为 固定相，另一相是携带混合物流过此 固定相的流体，称为流动相。当流动 相中所含混合物经过此固定相时，就 会与固定相发生作用。由于各组分在 性质和结构上的差异，与固定相发生 作用的大小强弱也有差异，因此在同 一推动力的作用下，不同组分在固定 相中的滞留时间有长有短，从而按先 后不同的次序从固定相中流出。流出 的物质用相 应的检测器进行检测。这种利用物质 在两相间分配原理而使混合物中各组 分分离，进而同时进行分析的技术称 为色谱分析法，或色谱法（又称色层 法，层析法）。
k
cV 组分在固定相中的质量 ms s s 组分在流动相中的质量 mm cmVm
其中VmV0，Vs为固定相体积。 分配比 k 的求算： 1）组分滞留因子： 2）又， us 3）因此，
Rs u mm 组分线速度 1 s 流动相线速度 u mm ms 1 k
色谱基本理论
色谱基本理论第一节色谱图及基本参数一、谱图：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵标为信号强度(mv)，横坐标为保留时间(min)。
二、关术语：色谱峰(Peak)：色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线。
峰底(Peak Base)：峰的起点与终点之间连接的直线。
峰高h(Peak Height)：峰最大值到峰底的距离。
峰(底)宽W(Peak Width)：峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离.就是从色谱峰两侧的转折点(拐点)作切线，在基线上的截距叫峰底宽；简称峰宽；峰高一半处色谱峰的宽度叫半峰宽。
由于色谱峰顶呈圆孤形，色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半半(高)峰宽W1/2(Peak Width at Half Height)：通过峰高的中点作平行于峰的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离。
峰面积(Peak Area)：峰与峰底之间的面积，又称响应值。
标准偏差(σ)(Standard Error)：峰高的0.607倍处所对应峰宽的一半。
拖尾峰(Tailing Peak)：后沿较前沿平缓的不对称峰。
前伸峰(Leading Peak)：前沿较后沿平缓的不对称峰。
鬼峰(Ghost Peak)：不是试样所产生的峰，亦称假峰。
基线(Baseline)：在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号的曲线。
基线飘移(Baseline Drift)：基线随时间定向的缓慢变化。
基线噪声(N) (Baseline Noise)；由各种因素所引起的基线波动。
谱带扩展（Band Broadening）：由于纵向扩散，传质阻力等因素的影响，使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。
三、保留值的基本参数保留时间(t R)(Retention time)：组分从进样到出现峰最大值所需的时间。
死时间(t M)(Dead time)：不被固定相滞留的组分从进样到出现峰最大值所需的时间调整保留时间(t’R )：t R’= t R-t M，即扣除了死时间的保留时间。
色谱理论基础知识
气相色谱实验技术
气相色谱仪
载气系统
分离系统
检测和 记录系统
进样系统
温控系统
（一）载气系统
载气系统
{
气源 净化干燥管 载气流速控制装臵 检测器
常用载气：氮气、氦气、氢气及氩气 载气选择依据
固体吸附剂应用
吸附剂 活性碳 石墨化炭 黑 硅胶 氧化铝 分子筛 主要成 分 C C Tmax 性质 度 300 500 非极性 非极性 氢键型 弱极性 极性 分离对象 永久气体，非极性烃 永久气体，高沸点化合 物 永久气体，非极性烃， 气体硫化物 烃，有机异构体 永久气体，惰性气体
SiO2· 2 400 XH O Al2O3 硅铝酸 盐 400 400
毛细管柱
毛细管柱又叫空心柱：
涂壁空心柱：将固定液均匀地涂在内径0.10.5毫米的毛细管内壁而成。 多孔层空心柱（PLOT）：在管壁涂渍一层多 孔吸附剂颗粒，不涂固定液，实际上毛细 管气固色谱柱。
毛细管柱的优点：
毛细管内没有固体填料，气阻比填充柱小的多， 可以采用较长的柱管和较小的内径，以及较高的 载气流速，既没有涡流扩散，又减小了纵向扩散 造成的谱带展宽。较薄的液膜又在一定程度上抵 消了由于载气流速增大引起的传质阻力增大。
液相传质阻力
固定液粘度及液膜厚度越小 液相传质阻力越小
4) 流动相线速度对板高的影响
四 分离度
定义：
tr2, tr1: 组分2和组分1的保留时间 W2, W1: 组分2和组分1的峰底宽度
R=1.5 完全分离
五 基本色谱分离方程式
对于难分离相邻两组分：
第五章高效液相色谱法
9
基本理论
热力学理论：塔板理论——平衡理论 热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论—— 范第姆特 动力学理论：速率理论 ——范第姆特 方程 色谱图的基本参数：与气相色谱法类 似
10
各类高效液相色谱法的分离原理及选 择
液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
3
高效液相色谱法的类型
根据固定相的不同 液-固色谱 液-液色谱 根据分离机理的不同 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
4
分配色谱：分离组分在两相中的分配系数不 同 吸附色谱：固定相对分离组分的吸附能力不 同 离子交换色谱：不同离子与固定相上的相反 电荷离子间作用力大小不同 体积排阻色谱：根据样品分子尺寸的不同按 分子大小分开 亲和色谱：不同基体上键合多种不同特性的 配位体作固定相，用具有不同pH的缓冲溶液 做流动相，依据生物分子与基体上键联的配 位体之间存在的特异性亲和作用力不同
30
流动相
1. 流动相特性
(1)液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂 液相色谱的流动相又称为：淋洗液， 液相色谱的流动相又称为 。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分 流动相组成改变，极性改变， 分离状况； 分离状况； (2)亲水性固定液常采用疏水性流动相 ， 即流 亲水性固定液常采用疏水性流动相， 亲水性固定液常采用疏水性流动相 动相的极性小于固定相的极性， 动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色 谱法，极性柱也称正相柱。 谱法，极性柱也称正相柱。 (3)若流动相的极性大于固定液的极性 ， 则称 若流动相的极性大于固定液的极性， 若流动相的极性大于固定液的极性 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分 31 在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
色谱法基本理论PPT课件
02 色谱法的基本原理
分离原理
分离原理
色谱法的基本原理是利用不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡来实现分离。当流动 相经过固定相时，与固定相发生相互作用，使得不同物质在固定相和流动相之间的分配平 衡不同，从而实现分离。
开发新型色谱技术
研究和发展新型色谱技术，如微流控芯片色谱、超临界流体色谱等， 以适应不同类型和规模的样品分析。
联用技术结合
将色谱法与其他分析技术（如质谱、光谱等）联用，可以实现更复杂 样品的高效分离和鉴定。
自动化和智能化发展
通过自动化和智能化技术的引入，实现色谱分析的远程控制、实时监 测和数据分析，提高分析效率和准确性。
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分配平衡
色谱法中的分配平衡是指物质在固定相和流动相之间的分布情况。物质在两相之间的分配 平衡受到多种因素的影响，如物质的性质、温度、压力等。
相互作用
物质在固定相和流动相之间的相互作用是影响分配平衡的重要因素。不同的物质与固定相 和流动相之间的相互作用力不同，因此表现出不同的分配平衡，从而实现分离。
固定相和流动相
保留机制
01
保留机制
保留机制是指物质在色谱法中通过固定相的保留作用而滞留在固定相中
的过程。物质的保留机制主要取决于物质与固定相之间的相互作用力和
性质差异。
02
竞争吸附
在色谱法中，多种物质会竞争吸附到固定相上，形成竞争吸附现象。竞
争吸附会影响物质的保留时间和分离效果，因此在选择固定相和流动相
时需要考虑竞争吸附的影响。
色谱法可用于研究化学反应动力学，通过分析反应中间产物和产物， 揭示反应机理和速率常数。
第五章 色谱分析法基本理论
例：关于保留因子的计算习题：
在某色谱柱上A组分流出需要10min，组分B流出需要 20min，而不溶于固定相的物质C流出需要2.0min，分 别计算：A、B组分在柱中的保留因子。
色谱分离前提→各组分分配系数不等
t
B R
tM (1 K B
Vs ) Vm
t
A R
tM
固定相——除了固体，还可以是液体 流动相——液体、气体、超临界流体等 色谱柱——各种材质和尺寸 被分离组分——不再仅局限于有色物质
5—1 概述
三、分类 1、按两相分子的聚集状态分
流动相 液体 液体 气体 气体
超临界流体
固定相 固体 液体 固体 液体
类型 液-固色谱 液相色谱 液-液色谱 气-固色谱 气相色谱 气-液色谱
是指相邻两峰峰顶间距离与两峰基线宽度平均值的比值（衡 量色谱分离条件优劣的参数）；涉及色谱过程热力学因素和 动力学因素。
R 2(tR2 tR1 ) 1.177(tR2 tR1 )
W1 W2
W1 2 (1) W1 2 (2)
设色谱峰为正常峰（峰形对称且满足正态分布），
且W1 W2 =4 若R = 0，峰间距 tR = 0，两峰完全重合； R = 1，tR = 4，两峰分离度可达98％； R = 1. 5，tR = 6，两峰离度可达99.7％；可视为完 全分离
超临界 流体色谱
5—1 概述
三、分类
2、按固定相的固定方式分
柱色谱
填充柱色谱 毛细管柱色谱 微填充柱色谱
纸色谱(PC)：滤纸作固定液的载体 平面色谱 薄层色谱(TLC)：固定相涂布于玻璃板或者铝箔板上
薄膜色谱(TFC)：高分子固定相制成薄膜
5—1 概述
三、分类
第五章 色谱分析法概论
i/s
。
在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，
将它们的相对保留值作业重要参数，称选择因子，用符号表示，
即
t t
' R2 ' R1
式中tR (2)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。 可作为衡量固定相选择性的指标。 越大，越容易分离。=1，分离不能实现。
Vs K p csVs k' K q cmVm Vm
前转移。对一根长为 L 的色谱柱，溶质平衡的次数应为：
L n H
n 称为理论塔板数 n 越大或 H 越小,柱效率越高,分离能力越强.
塔板理论指出：
第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数 n 大于50时，
可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n 值一般很大， 如气相色谱柱的 n 约为103 -106 ，因而这时的流出曲线可 趋近于正态分布曲线。 第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系 数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良 好的分离。 第三，n 与半峰宽及峰底宽的关系式为：
根据流动相的 物态可分为
{
气相色谱(GC)
气-液色谱(GLC)
液-固色谱(LSC)
液相色谱(LC)
液-液色谱(LLC)
填充柱色谱
按固定相的固 定方式分类
柱色谱
毛细管柱色谱 纸色谱
平板色谱
薄层色谱
平板色谱
吸附色谱 根据分离机理 可分为
分配色谱
离子交换色谱 排阻色谱
色谱法的特点和应用
1.分离效能高 2.灵敏度高 可检测10-11~10-13g,适于痕量分析. 色谱分析需试样量极少(g或ng).
四、保留值
1.保留值的定义
第五章 色彩的显色系统表示法
度特征。
第二节 颜色的三属性
非彩色明度示意图 同色相明度示意图
第二节 颜色的三属性
紫 蓝 青 绿 黄橙 红
可见光谱明度示意图
第二节 颜色的三属性
❖ 明度不等于亮度。根据光度学的概念，亮度是 可以用光度计测量的、与人视觉无关的客观数值， 而明度则是颜色的亮度在人们视觉上的反映，明 度是从感觉上来说明颜色性质的。
无光泽版
图册：
图册：
孟塞尔系统的特点：
• 表色完全，编排合理 • 具有和CIE标准色度系统的换算关系 • 孟塞尔图册制作精良，便于携带、
保存与查阅。
主要作用：分类和标定物体表面色
孟塞尔系统
美国国家标准学会和颜料、油墨、 印刷等材料测试协会用其为标准
英国标准学会用其来标定颜料
中国颜色体系及日本颜色标准将其作为参考
彩色的明度值： 在颜色立体中 以离开基底平 面的高度代表， 即同一水平面 上的所有颜色 的明度值相等 且等于该水平 面中央轴上非 彩色(灰色)的 明度值。
二．孟塞尔彩度(Chroma,记为C)
在孟塞尔色立体中， 颜色的饱和度以离开中 央轴的距离来表示，称 为孟塞尔彩度；
表示这一颜色与相同明 度值的非彩色之间的差 别程度，以符号C来表 示。
各色调的最大彩度值不等
三．孟塞尔色调(Hue,记为H)
孟塞尔色调是以围 绕色立体中央轴的角 位置来代表的，以符 号H表示。
孟塞尔色立体水平剖 面上以中央轴为中心， 将圆周等分为10个部 分，排列着10种基本 色调组成色调环。
色调环上的10种基 本色调中，有五个 主要色调：
红(R)
5RP 5P
黄、蓝这六种原色有不同程度类似性的颜色。
色谱法理论知识
(4)应用范围广 气相色谱可用于沸点低于400℃的各种
有机或无机试样的分析；而液相色谱则用于高沸点、
热不稳定、生物试样的分离分析。
(5)不足之处 被分离组分的定性较为困难。
谢谢
色谱法是一种分离分析技术，它是基于的分配系数，
当两个做相对运动时，混合物各组分在两相间进行 反复多次的分配。这样就使得那些分配系数只有微 小差别的组分，在移动速率上产生差别，从而得到 分离。根据色谱流出曲线给出的各种信息，可对各 组分进行分析和测定。
1.按两相物理状态分类 气相色谱 气-固色谱 气-液色谱
液相色谱 液-固色谱 液-液色谱 3.按分离机理分类 (1)吸附色谱 (2)分配色谱 (3)其他色谱：离子 交换色谱、凝胶色 谱、离子对色谱、 配合色谱、亲和色 谱等
色谱法 分类
2.按固定相的固定方式分类 (1)柱色谱 (2)薄层色谱 (3)纸色谱
色谱法特点
(1)分离效率高 可用分离复杂混合物，如有机同系物、 异构体等。 (2)灵敏度高 可以检测出10-11~10-13g物质质量。 (3)分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一 个试样分析。
色谱法色谱法分类色谱法特点色谱研究的最新动态和进展色谱法基本原理色谱法基本原理色谱法是一种分离分析技术它是基于混合物中各组分在互不相溶的两相中具有不同的分配系数当两个做相对运动时混合物各组分在两相间进行反复多次的分配
色谱法
色谱法基本原理
色谱法分类 色谱法特点 色谱研究的最 新动态和进展
色谱法基本原理
第五章习题及答案
第五章 习题及答案1. 色谱柱主要有哪几种？各有什么特点？各适用于何种类型物质的分析？答：气相色谱，液相色谱，薄层色谱，超临界色谱和高效毛细管电色谱。
气相色谱适用于沸点低于400℃的各种有机或无机气体的分离分析。
液相色谱适用于高沸点、热稳定性差及具有生理活性物质的分离分析。
薄层色谱是简单的经典色谱方法。
超临界色谱主要用于分离高沸点大分子试样。
高效毛细管电色谱适合从无机离子到生物大分子，从荷电粒子到中性分子的分离分析。
2. 速率理论阐明了什么问题？速率方程式中的各项分别表示什么意义？答：速率理论将塔板理论中的塔板高度概念与组分在两相中的扩散和传质联系起来，指出分离过程中峰展宽的原因是由于有限的传质速率和传质阻力的存在所引起的动力学效应的影响所致。
u C u BA H ⋅++=A ：涡流扩散项；uB：分子扩散项；u C ⋅：传质阻力项。
3. 根据速率理论，可从哪几个方面来提高柱效？答：减小固定相颗粒粒度，选择摩尔质量小的气体作载气，降低传质阻力。
4. 色谱分离过程中的热力学因素和动力学因素分别由那两个参数表现出来？两个色谱峰的保留时间相差较大，就一定分离完全了吗？ 答：保留时间和峰宽；不一定。
5. 某物质色谱峰的保留时间为65 s ， 半峰宽为5.5 s 。
若柱长为3 m ， 则该柱子的理论塔板数为多少？ 答：774)5.55.6(54.5)(54.5222/1=⨯==Y t n R6. 计算当两组分的分配系数比为1.05时，柱的有效塔板高度为0.1 mm 时，需要多长的色谱柱才能将两组分完全分离？ 答：先求7. 某试样中，难分离物质对应的调整保留时间分别为40 s 和45 s ， 填充柱的塔板高度近似为1 mm 。
假设两者的峰底宽度相等，若要完全分离（R=1.5），柱长应为多少？答：8. 某一气相色谱柱，速率方程中A 、B 、和C 的值分别是0.08 cm ， 0.36 cm 2·s -1和4.3×10-2 s ，计算最佳线速度和最小塔板高度。
色谱法的理论与实践
分配色谱（partition ~） 利用分配系数旳差别.
空间（分子）排阻色谱（steric exclusion ~）或称凝胶色谱法（gel ~） 利用被测物分子大小不同而造成旳渗透系 数差别.
2024/9/29
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离子互换色谱（ion exchange ~）
2024/9/29
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二、色谱法旳分类
▪ 按流动相与固定相旳分子汇集状态分类 按流动相旳分子汇集状态分类 GC， LC，超临界流体色谱（SFC） 按固定相旳汇集状态分类 气相色谱法（气-固，气-液） 液相色谱法（液-固，液-液）
按操作形式分类 柱色谱，平面色谱，逆流分配
2024/9/29
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▪按色谱过程旳分离机制分类
拖尾峰（tailing peak）
前延峰（leading peak）
2024/9/2910来自峰形参数：掌握
对称因子（symmetry factor，fs）
fs =(A+B)/2A； 或用：
拖尾因子（tailing factor，T）来衡量
T=W0.05h/2d1
T=0.95～1.05(正常峰) T＜0.95(前延峰) T﹥1.05(拖尾峰)
2024/9/29
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要点： 1.色谱理论 2.色谱分类措施 3.主要术语概念：
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2024/9/29
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毛细管电色谱（capillary electro- ~） 依托色谱与电场两种作用力，利用分配
系数和电泳速度差别而分离。 毛细管电泳 （capillary electrophoresis）
以高压电场为驱动力，根据样品组分旳 淌度和分配系数而分离。 手性色谱（chiral chromatography）
色谱基本理论
K cs cm
分配系数与组分浓度大小无关，其色谱峰呈正态分布----线性色谱。
分配系数由组分和固定相的热力学性质决定，随柱温而变化，与两相体积
无非关线。性色谱体系的K 不是常数，K 随浓度而变化。
在液相色谱法中，还取决于流动相的性质。
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第一章 输入标题 一、相平衡参数
在流动相中分子传质阻力引起离散的步长取决于扩散达到固定相表面建立热力学平衡所需扩散的平均深度路pm即令l分子在色谱柱中向前移动一步所需的时间为pm用来描写传质过程阻力的大小pm在整个色谱柱内由于流动相传质阻力造成的分子集sr流动相的移动速度为u若分子集合在色谱柱固定相中的停留时间为tsm在流动相中的停留时间为trm保留值时间组分分子集合在色谱柱内总停留时间在固定相内停留时间tsm在流动相内停留时间trm分子完成深度dpm的扩散与所需要的时间pm之比就是分子集合相对于流动相移动速度为usr固定相中的传质阻力流动相固定相刚达分配平衡流动相固定相分配平衡后的瞬间由于在固定相中的扩散传质扩散系数为d分子在色谱柱中向前移动一步所需的时间为分子传质阻力引起离散的步长取决于扩散达到两相表面建立热力学平衡所需扩散的平均深度路径d在整个色谱柱内由于流动相传质阻力造成的分子集合的总离散应为流动相低线速有利于达到高柱效
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第一章 输入标一题 、色谱流出曲线和有关概念
3．色谱峰是流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰为对称形正态分布曲线。
不正常色谱峰有两种：拖尾峰和前延峰
色谱峰的对称与否：对称因子（拖尾因子）。
对称因子在0.95～1.05之间的色谱峰为对称峰； 小于0.95者为前延峰 大于1.05者为拖尾峰
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第五章色谱原理5.1色谱的原理和分类5.1.1色谱色基本原理色谱技术是一种重要的分离和分析技术，其用于物质的分离始于二十世纪初。
1903年，俄国植物学家Tswett向填充碳酸钙的柱中注入植物色素的石油醚冲洗，发现柱中出现数条相互分离的色带，色谱法的命名就是由此发现开始的。
随后色谱技术得到不断发展。
Martin于1952年因创立气－液色谱分离方法而荣获诺贝尔奖。
气相色谱的出现极大地鼓舞了世界各地的科学工作者，激发了人们对分析色谱技术进行放大，使之用于制备目的和工业生产的研究兴趣。
资料表明，在50和60年代，分析和生产规模的气相色谱分离技术的研究十分活跃。
到了70年代，尤其是在美国制糖工业采用酶法转化技术生产高果葡糖浆以后，液相色谱技术就变成了一个热门的研究领域。
色谱在英文中只有一个名词Chromatography），但在中文中却有色谱和层析的名称。
色谱的主要装置如图所示;图色谱的主要装置图色谱实际是色谱分离精度高，设备简单，操作方便，根据各种原理进行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析与检测，而且应用于生物物质的制备分离和纯化，成为生物下游加工过程最重要的纯化技术之一。
5.1．2色谱的分类1)流动相与固定相色谱法根据流动相的相状态分气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法，而固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。
2)固定相的形状根据固定相或色谱装置形状的不同，液相色谱法又分为纸色谱法（Paper chromatography）、薄层色谱法（Thin－layer chromatography）和柱色谱法（Column chromatography）。
纸色谱法和薄层色谱法多用于分析目的，而柱色谱易于放大，适用于分离大量制备分离，是主要的色谱分离手段。
3)分离操作方式色谱法根据分离操作方式的不同可分为间隙色谱和连续色谱两大类。
间隙色谱技术通过合理选择固定相介质和冲洗剂可以得到广泛应用。
但是，在工业应用中更希望采用连续分离操作，尤其是分离过程必须与其他连续单元操作（如连续生化反应器）同时进行时更是如此。
5.1.3色谱的主要检测器色谱峰的确定完全考检测器,所以检测器的好坏对色谱技术是十分重要的。
气相色谱的检测器主要有以下几种：（1）氢火焰检测器（2）热导检测器（3）离子检测器这些检测器的主要功能如表所示表气相色谱检测器液相色谱的主要检测器有紫外检测器、视差折光检测器、蒸发散射光检测器、等其主要功能如表所示。
表液相色谱检测器的主要功能5.1．4 生物分离制备液相色谱的类型和特点气相色谱主要用于挥发性成分的分析。
在生物产品的分离纯化中主要采用的液相色谱。
液相色谱中有些主要是用于分析如反相色谱。
液相色谱方法的主要特点是：分离效率高，选择性好，适用于各种多元组分复杂混合物的分离；应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成产物，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等，可以说几乎包括了所有类型物质。
表1 适用于大规模生物分子分离纯化的主要色谱方法其实上表只是给出了目前常用的生物产品用液相色谱。
还有许多新的液相色谱。
如分子印迹层析技术，。
5.1．5 液相色谱介质和操作形式液相色谱介质主要是颗粒状、膜状和一体柱形式。
颗粒状介质，包括球星颗粒、无定型颗粒等。
膜状介质是将膜用作介质，一体柱介质又称为连续床或连续棒，即介质单体材料在柱中直接聚合，形成多孔状网，达到吸附分离的目的。
液相色谱的固定相目前主要是颗粒状介质，但颗粒状介质存在内扩散阻力和颗粒分布不均匀的问题，近几年开始研究连续床或大孔灌柱色谱的方法来解决这个问题。
这些会在后面章节中详细讨论。
目前颗粒状介质主要是考填充的方式填在柱子中。
5．2．色谱理论5．2．1概论色谱理论是研究色谱过程中分子运动的规律，探讨微观分子运动与色谱分离的内在联系。
色谱学理论研究的三个主要问题是[1]：色谱过程的热力学研究，它是发展高选择性柱的理论基础；色谱过程的动力学研究，它是发展高效能色谱柱与高效能色谱方法的理论基础；色谱分离条件的选择和优化，它是多元混合物分离的理论基础。
5．2.2吸附平衡热力学描述吸附平衡的模型有多种形式，早期经验模型如：亨利（Henry）模型，佛罗因得利希(Freundlich)模型，兰格谬尔(Langmuir)模型和BET （Brunauer-Emmett-Teller ）模型。
最近发展起来的吸附模型有质量作用模型，空间质量作用模型等。
溶质在吸附剂上的吸附平衡关系是指吸附达到平衡时，吸附剂的平衡吸附质浓度q 与液相游离溶质浓度c 之间的关系。
一般q 是c 和温度的函数，既(,)q f c T =（1）但一般吸附过程是在一定的温度下进行，此时q 只是c 的函数，q 与c 的关系曲线称为吸附等温线（adsorption isotherm ）。
当q 与c 之间呈线性函数关系，mcq =（2）时，称为亨利（Henry ）型吸附平衡，其中m 是分配系数。
该式一般在低浓度范围内成立。
当溶质浓度较高时，吸附平衡常呈非线性，该式不再成立，经常利用佛罗因得利希（Freundlich ）经验方程描述平衡行为，既：n kc q 1=（3）其中k 和n 为常数，一般1<n<10。
当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时，n 可能大于10，此时游离浓度对吸附浓度影响很小，接近于不可逆吸附，吸附等温线为矩形（rectangular isotherm ，q=常数）。
例如固定化单克隆抗体的免疫亲和吸附剂的吸附等温式中一般n>10，可用矩形吸附平衡关系近似。
5．2.2.1 Langmuir 模型Langmuir 模型是描述吸附过程最简单和最常用的模型，也是第一个有一定理论基础的吸附模型。
它最初源于气体吸附过程,从动力学角度推导出来的,基于以下假设:(1)分子只在固体表面的固定位点吸附;(2)每个吸附位点只能吸附一个分子,吸附分子在固体表面形成单分子层;(3)所有吸附位点的能量相等;(4)吸附分子之间没有相互作用。
基于 Langmuir 单分子层吸附理论，可推导Langmuir 型平衡方程。
m d q cq k c=+ (4)或： cK cK q q b b m +=1 (5)其中，q m 为饱和吸附容量，K d 为吸附平衡的解离常数，K b 为结合常数（=1/K d ）当n 个溶质分子在一个活性点上发生吸附时，可得上式的一般形式：1nm b nb q Kc q K c=+(6) 对于n 个组分的单分子层吸附，又变成另一种形式：1m bj i nbj jj q K c q K c =+∑(7)5．2.2.2 BET 方程如果假设在吸附剂表面吸附的单分子层分子的附着力比吸附质分子之间的内聚力大得多，并在吸附剂表面产生化学吸附形成络合物，可假定分子层在表面不能自由移动。
Brunaur 、Emmett 和Teller 提出的BET 模型认为，被吸附的分子不能在吸附剂表面自由移动，吸附层是不移动的理想均匀表面。
其吸附可以是多层吸附，层与层之间的作用力是范德华力，各层水平方向的分子之间不存在互相作用力，即在第一层吸附层上面，可以吸附第二层，第三层，不等到上一层吸附饱和就可以进行下一层的吸附。
各吸附层之间存在着动态平衡，即每一层形成的吸附速率和解吸速率相等。
单分子层可由向空的表面吸附或双层分子层解吸产生，吸附速率与吸附有效面积的大小和分子碰击表面的频率有关。
恒温下基于气体动力学理论，得出多层物理吸附等温方程为[2]：00()1(1)m q bPq PP P b P =⎡⎤-+-⎢⎥⎣⎦(8)式中：b 为与吸附热有关的常数； q 表示平衡压力为P 时的吸附容量； q m 饱和吸附容量；P 0为实验温度下溶质的饱和蒸汽压。
5．2.2．3质量作用模型生化分离中经常用色谱法分离纯化生物大分子如蛋白质、多肽。
此时如果用Langmuir 模型来描述吸附平衡，由于模型简单，未能考虑到溶液反离子等因素的影响，往往得不到好的结果。
下面以蛋白质的离子交换为例，介绍近年来常用的质量作用模型和空间质量作用模型。
质量作用模型（Stoichiometric Displacement Model,简称为SDM ）是建立在质量作用定律基础上的非机理模型[3]，常用来描述生物大分子如蛋白质在吸附剂上的吸附平衡。
该模型假设离子交换是吸附过程的唯一机理，离子交换过程用满足质量作用定律的化学计量“反应”来描述，这样，在吸附过程中维持固定相电中性。
蛋白质分子通过与反离子竞争吸附结合到离子交换配基上。
模型假设如下：（1）系统为理想体系，各组分的活度系数为1；（2）与蛋白质分子结合的伴离子(co －ion)分成两类：当蛋白质在离子交换介质上吸附时，第一类伴离子从蛋白质释放出来，而第二类伴离子始终与蛋白质分子相结合。
由此假设，蛋白质可看成中性的盐，在水溶液中电离成多价离子；（３）在恒定的PH 下，蛋白质的性质，如带电荷数、电荷分布、分子结构和大小等，在整个吸附过程不发生变化；（４）固定相均一，孔道形状和尺寸均匀，且孔道直径足够大，不存在尺寸排阻作用；（５）不考虑蛋白质与离子交换剂之间的疏水作用。
离子交换平衡方程如下（以阴离子交换剂为例）：n r m n m r n PB m Y m A n Y PB n m B -++⋅+⋅↔⋅+⋅+⋅⋅m 为特征电荷，即蛋白质吸附时，能替换下来的单价反离子数。
如果P 是碱基数小于１0的寡糖核苷酸，m 等于分子所带的净电荷数；但对于生物大分子，由于其复杂的三维构像是带电残基形成特殊分布，特征电荷数小于其所带的净电荷数。
另外，在静电作用下，蛋白质从流动相向固定转移过程中，由于蛋白质在分子热运动下发生旋转取向，使蛋白质与固定相结合的自由能最小；在一定的操作条件下，如恒定的pH 和盐离子浓度下，可能有多个蛋白质取向存在，蛋白质的取向与吸附蛋白浓度有关。
因此m 代表竞争吸附的平均作用，它的实验值不一定是一个整数。
吸附平衡常数定义为：'[][][][][]n n m mnm r n mr m n Y PB A B K PB Y A -=+=(9) 在吸附过程中，第一类伴离子从蛋白质上释放，即：+-+⋅+↔B m PB PB m rm r上述方程的平衡常数为：]PB []PB [K m r m r ''+-=(10)（9）式、（10）式相结合，可的离子交换的总平衡常数'''/()n K K K =为：[][][][]n n mm r m n mr n Y PB A K PB Y A --=(11)离子交换剂的交换容量q Y 为蛋白质和反离子所占的吸附位之和，即：[][]Y m r n q m Y PB n Y A =+(12)把（12）式代入（11）得：/1/[][][][]m nn m m r r n Y m r Y PB n A PB K q m Y PB --⎛⎫= ⎪-⎝⎭(13)与langmuir 模型相比，SDM 模型更合理的模拟了蛋白质离子交换平衡。