太子参分解代谢关键酶8′羟化酶基因的克隆及生物信息学分析

太子参分解代谢关键酶8′羟化酶基因的克隆及生物信息学分析ABA 8′羟化酶是脱落酸（abscisic acid，ABA）分解代谢中的关键酶基因之一。

采用同源检索的方法从太子参转录组数据库中获得7个ABA 8′羟化酶（abscisic acid 8′-hydroxylase）基因家族成员，对各家族成员进行转录分析组数据以及ABA 8′羟化酶关键基因ABA8ox1编码区（coding sequence，CDS）的克隆与生物信息学分析。

ABA8ox1基因CDS全长1 401 bp，编码480个氨基酸残基，等电点为8.55，相对分子质量为53 kDa，跨膜分析显示其为膜蛋白，1～21个氨基酸残基位于胞内，22～466个氨基酸残基位于胞外。

转录组数据分析及定量PCR技术共同证明ABA8ox1在块根的韧皮部及须根中有较高的表达。

多序列比对及聚类分析显示与其他植物CYP707A蛋白具有较高的同源性，且与模式植物拟南芥中ABA分解关键基因AtCYP707A1和AtCYP707A3聚为一类。

该研究为太子参块根膨大及对逆境胁迫响应的分子机制奠定基础。

标签：太子参；脱落酸；降解；ABA 8′羟化酶；表达分析[Abst ract] Abscisic acid 8′-hydroxylase was one of key enzymes genes in the metabolism of abscisic acid （ABA）. Seven menbers of abscisic acid 8′-hydroxylase were identified from Pseudostellaria heterophylla transcriptome sequencing results by using sequence homology. The expression profiles of these genes were analyzed by transcriptome data. The coding sequence of ABA8ox1 was cloned and analyzed by informational technology. The full-length cDNA of ABA8ox1 was 1 401 bp，with 480 encoded amino acids. The predicated isoelectric point （pI）and relative molecular mass （MW）were 8.55 and 53 kDa，respectively. Transmembrane structure analysis showed that there were 21 amino acids in-side and 445 amino acids out-side. High level of transcripts can detect in bark of root and fibrous root. Multi-alignment and phylogenetic analysis both show that ABA8ox1 had a high similarity with the CYP707As from other plants，especially with AtCYP707A1 and AtCYP707A3 in Arabidopsis thaliana. These results lay a foundation for molecular mechanism of tuberous root expanding and response to adversity stress.[Key words] Pseudostellariae Radix；abscisic acid；degradation；abscisic acid 8′-hydroxylase；expression analysisdoi：10.4268/cjcmm20161305自然界中许多植物具有膨大的根茎器官，在对不同环境的适应过程中具有重要作用[1]。

地黄[2]、麦冬[3]等地下膨大部分为块根，由不定根或侧根膨大形成；马铃薯[4]地下膨大部分为根茎，由匍匐茎顶端膨大形成。

植物的生长发育及形态建成受到植物内源激素系统的调控，通过控制不同激素的比例及水平来影响地上部茎叶及地下部根系的发育过程[5-6]。

研究表明，植物激素在植物块根（块茎）的发育过程中具有重要作用。

细胞分裂素（cytokinin，CTK）[7]、生长素（indole-3-acetic acid，IAA）[8]、乙烯（ethylene）[9]、脱落酸ABA[10]等激素先后被证明能促进植物块根（块茎）的膨大，而赤霉素（GA）[11]能抑制块根（块茎）的膨大。

脱落酸ABA含量随块根的发育进程呈逐渐上升趋势，可能同时具有促进和抑制作用，影响因素主要取决于ABA的浓度，作用部位与周围环境的相互作用[12]。

较高浓度的ABA有利于甘薯、地黄等植物块根的膨大[13-14]。

ABA能提高块根中淀粉合成酶的活性，增加淀粉合成，从而增加对蔗糖的需求[15]，调节中酸性磷酸化酶的活性促进蔗糖的吸收和卸载[16]，调节ATP酶的活性促进蔗糖的吸收和卸载，进而促进块根中可溶性碳水化合物的积累[17]。

脱落酸（ABA）的生物合成主要由C15直接途径及C40间接途径完成，其分解代谢以ABA 8′羟化酶为起始关键酶。

植物中脱落酸（ABA）的含量依赖于其合成途径及分解代谢路径共同作用，而且激素水平受到反馈调控机制的影响[18]。

王鹏飞等[2]证实了ABA 8′羟化酶在ABA大量合成时被激活，在ABA生物合成减弱时被抑制，对ABA的激素水平调控具有重要作用。

太子参Pseudostellariae Radix为传统中药，块根主要含有多糖、环肽、皂苷类化学成分，现代药理研究认为具有抗应激、抗疲劳以及增强免疫力的作用[19]，在临床上得到很好应用。

现今，太子参药材以人工栽培为主，在生产种植中块根能否正常膨大发育直接决定药材的品质和产量[20]。

袁婧等[21]探索了太子参块根发育的规律，发现块根在生长过程中先膨大后伸长，最后在生长105 d时获得最大生物量。

但是，在太子参块根细胞中激素（尤其是ABA）的积累及调控的分子机制尚未见报道。

为了解析脱落酸（ABA）在太子参块根膨大过程中的作用机制，本研究采用生物信息学的方法从太子参转录组数据库中鉴定ABA 8′羟化酶家族成员，分析其在太子参不同组织中的表达模式，以期寻找脱落酸分解代谢的关键基因。

1 材料1.1 样品供试材料采自贵州施秉种质圃，鉴定人为贵阳中医学院江维克教授。

采集太子参的茎、叶、块根、须根，将块根分为皮部和木质部，分别用液氮处理后置-80 ℃冰箱中保存，备用。

1.2 试剂基因克隆所需Taq DNA聚合酶、质粒载体pMD19-T、反转录酶M-MLV、RNAiso Plus试剂盒、DNase Ⅰ及DL 2 000 DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司。

凝胶回收试剂盒购自Omega公司，大肠杆菌Escherichia coli 菌株DH5α购自上海生工生物工程有限公司。

其余试剂为进口或国产分析纯。

2 方法2.1 太子参总RNA的提取及cDNA第一链的合成取适量太子参新鲜组织置于预冷的研钵中，加液氮迅速研磨成粉末状。

参照RNAiso Plus抽提试剂盒说明书提取太子参总RNA后，加50 μL DEPC水溶解RNA，运用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性、微量核酸测定仪检测其浓度和纯度。

以RNA为模板、OligoT11（50 μmol·L-1）为引物，利用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链。

2.2 脱落酸ABA-8′羟化酶基因的检索及全长的克隆从NCBI数据库中下载模式植物拟南芥、水稻等的ABA-8′羟化酶基因家族成员，通过构建本地Blast 的方式，从太子参转录组数据库中获得ABA-8′羟化酶基因，e为1e-30，获得的候选基因经NCBI及pfam[22]数据库比对分析后确定为ABA-8′羟化酶基因。

利用转录组数据库对ABA-8′羟化酶基因进行转录分析，筛选在太子参块根表达量较高的基因进行克隆及功能验证。

根据太子参转录组数据库中得到的ABA-8′羟化酶基因全长cDNA序列信息，设计全长cDNA引物，ABA8ox1-F：5′-ATGGTGATCATATTTGTAGCTTTG-3′，ABA8ox1-R：5′-CTATTGACTTTTGCTAAATAATTTA-3′，下划线标记为起始密码子与终止密码子。

以太子参块根cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，循环30次；72 ℃10 min。

目的片段与TaKaRa公司的pMD19-T载体相连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，送到南京金斯瑞公司测序。

2.3 脱落酸ABA-8′羟化酶基因的生物信息学分析测序结果经Genetyx软件去除载体序列，与预测基因进行序列比对。

使用ORF Finder（http：///gorf/orfig.cgi）查找开放阅读框。

采用Pfam数据库（http：///）进行结构域的预测分析，利用ExPASy数据库（http：///compute_pi/）计算蛋白质的相对分子质量与理论等电点，TargetP1.1 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析亚细胞定位，HMM Server V2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜结构域的分析。

2.4 聚类分析本研究从NCBI数据库中分别下载拟南芥Arabidopsis thaliana 的4个ABA8′羟化酶基因，AtCYP707A1（AEE84162），AtCYP707A2（AEC08210），AtCYP707A3（AED95234），AtCYP707A4（AEE76215）；水稻Oryza sativa的3个ABA8′羟化酶基因，Os08g36860（BAF23935），Os09g28390（BAF25280），Os02g47470（BAF34848）；玉米Zea mays的4个ABA8′羟化酶基因，GRMZM2G065928（ACF78881），GRMZM2G179147（ACN25205），GRMZM2G126505（ACN28537），GRMZM2G002142（ACN34951）；蓖麻Ricinus communis的4个ABA8′羟化酶基因，RCOM_1407690（EEF38770），RCOM_0813450（EEF43689），RCOM_0814150（EEF43729），RCOM_1590410（EEF52401）；杨树Populus trichocarpa的5个ABA8′羟化酶基因，POPTR_0004s14820（EEE73891），POPTR_0009s10450（EEE77492），POPTR_0004s24360（EEE87380），PtCYP707A4（EEE87808），PtCYP707A5（EEF08493）；菜豆Phaseolus vulgaris L.的3个ABA8′羟化酶基因，PvCYP707A1（ABC86558），PvCYP707A2（ABC86559），PvCYP707A3（ABC86560）以及高粱Sorghum bicolor的3个ABA8′羟化酶基因，Sb02g026600（EER99010），Sb04g030660（EES05 661），Sb07g022990（EES15128）。