一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法
微生物发酵液中脂肽类生物表面活性剂的测定
图 1 样品 TLC 分析
为了进一步研究，又做了该样品的红外光谱分析，结果见图 2。在 FT-IR 谱图上， 3307cm-1 是由分子链间氢键引起的 NH 收缩振动，3070cm-1 是 NH 基团的分子内氢键引
起的 NH 伸缩谱带，1648cm-1、1539cm-1 分别为酰胺谱带Ⅰ和Ⅱ。这些特征吸收表明， 该表面活性剂分子的亲水基是一肽链。谱图上 2957cm-1～2856cm-1 和 1463cm-1～ 1387cm-1 的两处吸收是脂肪族碳链的 C-H 伸缩振动，1735cm-1 和 1203cm-1 是内酯的特 征吸收，表明该表面活性剂分子的疏水基是一脂肪酸半分子。因此，该表面活性剂分子 是一环脂肽类分子。
究，通讯地址：200237 上海市梅陇路 130 号华东理工大学化学系，E-mail: bzmu@。
1 材料与方法 1.1 菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis，中国科学院微生物研究所鉴定），本实验室分离并 保藏。
1.2 仪器
RE-52A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，PHS-3C pH 计（上海精密科学仪器有 限公司），DCA315 动态接触角分析系统（Thermo-Cahn Instruments, Inc. USA），氨基酸 自动分析仪（日立 835-50）。
肽分子中一般只含有一个谷氨酸残基或者谷氨酰胺残基，通过测定脂肽中的谷氨酸来定量脂肽。按
该方法实验测定了细菌 Bacillus Subtilis 发酵液。结果表明，发酵液中脂肽含量为 2.82×10-4 mol·L-1，
脂肽样品平均回收率为 94.1％，相对偏差为 1.28％。该方法取样量少，结果准确，简便易行。图 3
液。
1.4.6 发酵液中脂肽的测定
枯草芽孢杆菌分离及筛选鉴定实验方案
附表：培养基的配方
肉汤琼脂培养基
牛肉膏 ５克
蛋白胨 １０克
ｐＨ ６．５ 121℃灭菌 20min
四、淀粉水解 1、原理：
许多芽孢杆菌产生淀粉酶， 能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进 一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 2、 培养基及试剂： 培 养 基 ： 在 肉 汤 琼 脂 中 添 加 0.2% 的 可 溶 性 淀 粉 ， 分 装 于 三 角 瓶 。
0.1MPa(15lbf/in2)20min 灭菌备用。
2、培养基：半固体培养基 3、操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于
30 培养 3—7 天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺 线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌
三、乙酰甲基甲醇实验 1、 原理：
本实验是测定芽孢杆菌 （或其他细菌） 发酵葡萄糖的变化。 有些芽孢杆菌发酵葡萄糖 产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或 2,3-丁二醇。乙酰 甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰， 后者与蛋白胨中精氨酸所含 的胍基起作用，生成红色化合物，即表示 V.P.试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸
可溶性淀粉 ２克
琼脂 １５－克２０
蒸馏水 １００毫０升
ＨＨＪＳ－ＺＬ
枯草芽孢杆菌的鉴定实验
1. 形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等） ⑴单个菌体的形态 ⑵群体形态的观察
2. 革兰氏染色 3. 芽孢染色 4. 菌体大小测量 5．枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定：
一 过氧化氢酶测定 1、原理：过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧 2、试剂： 3—10%过氧化氢 培养基：肉汤琼脂培养基 3、操作步骤：将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上， 30 培养 1—2 天。取一干净载玻片，在
一株产脂肽类生物表面活性剂菌株的分离及代谢产物分析
摘 要 :采用多次富集培养 、血平板筛选方法 ,从新疆克拉玛依油田油水样中分离得到产生物表面活性剂菌株 L1 。 该菌株与已培养的土壤芽孢杆菌 ( B revibacill us ag ri) 的 16S rDNA 序列同源性达到 99 % ;其代谢产物具有降低表面张 力的作用 ,可以将发酵液表面张力从最初的 691 56 mN ·m - 1 降到 291 36 mN ·m - 1 ;菌株代谢产物经薄层层析分析初步 鉴定为脂肽类生物表面活性剂 ,红外光谱定性该生物表面活性剂属于环脂肽类表面活性剂 。
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2010 ,Vol. 27 No. 2 化 学 与 生 物 工 程
Chemistry & Bioengineering
一株产脂肽类生物表面活性剂菌株的 分离及代谢产物分析
罗剑波1 ,吴卫霞2 ,张 凡3 ,佘跃惠1 (11 长江大学化学与环境工程学院 ,湖北 荆州 434023 ; 21 新疆吐哈油田公司温米采油厂采油工程室 ,新疆 鄯善 838202 ;
脂肽分子是由亲水的肽链 (7～10 个氨基酸组成 的肽链) 和亲油的脂肪酸链 (β2羟基脂肪酸链或β2胺基 脂肪酸链) 两部分组成的 , 其中脂肪酸链上的羟基或 胺基与肽链氨基酸上的羧基结合形成内酯键或酰胺 键 ,使肽链闭合形成环状脂肽[3] 。由于其特殊的结构 , 脂肽表现出多种生理特性[4 ,5] : 帮助微生物细胞粘附 于烃类物质表面进行解烃代谢 ; 降低表面张力 ,促进 微生物吸收和代谢疏水性物质 , 以利于微生物在水不 溶性物质中生存 ; 与化学表面活性剂相比 ,更易于降 解 ;在极端条件下仍能保持其活性[6～8] 。因此 ,脂肽被 广泛地应用到石油开采等工业领域中 。
实验题目枯草芽孢杆菌的分离
实验题目枯草芽孢杆菌的分离、纯化和鉴定一、实验目的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛存在于土壤、植物根际体表等，其好氧、嗜温，极易分离与培养。
由于枯草芽孢杆菌生长快，具有广谱抗菌活性和很强的抗逆能力，并且对人畜无毒，不污染环境，因此已作为一种理想的生防菌广泛应用于多种植物病害的防治且备受关注。
本实验通过温度筛选法和选择性培养基筛选法分离枯草芽孢杆菌，并针对其生理生化特征进行纯化和鉴定及16S rDNA基因序列进行分析。
二、实验原理枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆倒柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
枯草芽孢杆菌的分离方法：（1）温度筛选法：枯草芽孢杆菌能产生芽孢，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟，利用枯草芽孢杆菌的这一特性，可利用高温水浴使不能产生芽孢的细菌失去活性，得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
（2）选择性培养基筛选法：枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、碳酸钙等5种原料构成,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培养有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化，当培养基的配方为无水葡萄糖3.50g/L、蛋白胨0.83g/L、酵母膏0.50g/L、磷酸二氢钾0.35g/L和碳酸钙0.25g/L,温度(34±2)℃时,培养16h即可达到生长峰值。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法研究
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的益生菌，具有广泛的应用前景。
为了进一步研究枯草芽孢杆菌的特性和应用价值，需要进行有效的分离和鉴定方法的研究。
本文将介绍一种常用的枯草芽孢杆菌分离与鉴定方法，以供参考。
一、枯草芽孢杆菌的分离方法1. 采集样品：选择环境中富含枯草芽孢杆菌的样品，如土壤、植物根际土壤等。
使用无菌采样器具采集样品，并尽量避免外界污染。
2. 处理样品：将采集得到的样品（如土壤）样品称重，加入适量的无菌生理盐水中，进行悬浮液的制备。
通过振荡或搅拌等方式使样品充分悬浮。
3. 稀释样品：将制备好的样品悬浮液进行适度的稀释，以获得合适的菌落形成数量。
常用的方法是制备10^-1至10^-6的稀释液，通过分别取不同稀释液进行接种。
4. 铺平培养：将适量的稀释液取出，均匀地涂布在菌落计数板上或含有适宜培养基的琼脂培养基平板上。
用冷热板或菌液器辅助涂布，注意避免产生气泡。
5. 培养条件：将铺平的培养板放入恒温培养箱，温度设定为适宜的生长温度，一般为30-37摄氏度，培养时间一般为24-48小时。
6. 菌落取样：在菌落形成后，使用无菌物质（如铂丝、无菌酒精灯火焰炙烧的铁丝等）挑选出单个菌落，并将其转移到新的琼脂平板上。
重复此操作，直到获得纯种的枯草芽孢杆菌。
二、枯草芽孢杆菌的鉴定方法1. 形态学观察：采用显微镜观察培养得到的枯草芽孢杆菌菌落和孢子的形态特征。
枯草芽孢杆菌形成的菌落通常为凹陷型或突起型，孢子则呈椭圆形，具有芽胞的特征。
2. 细胞染色：将培养得到的枯草芽孢杆菌菌落取出，进行细胞染色。
常用的方法是使用革兰氏染色和孢子染色。
革兰氏染色可用于观察细菌细胞的染色性质和形态特征，孢子染色则可用于观察细菌芽胞的形态特征。
3. 生理生化特征检测：通过生理和生化实验，检测枯草芽孢杆菌的一些代谢特征。
包括对碳源的利用情况、产酶的能力、乳酸发酵能力等。
常用方法包括碳源利用试验、酶活性测试、氧化还原试验等。
一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化
一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化一、引言枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成细菌，广泛存在于土壤、水体、植物表面等环境中。
枯草芽孢杆菌具有良好的免疫调节、抗菌、促生长等生物学特性，被广泛应用于农业、食品、医药等领域。
针对不同用途的需求，分离鉴定枯草芽孢杆菌并优化其发酵条件，能够提高其生物活性和产量，为其在实际应用中发挥更好的效果。
二、枯草芽孢杆菌的分离鉴定1.样品采集与处理首先，从自然环境、农田土壤或其他植物表面等样品中采集含有枯草芽孢杆菌的样品。
将样品带回实验室后，进行分离和处理，避免混杂其他细菌或真菌。
2.菌株分离将处理后的样品进行稀释，接种于富含培养基中，利用传统分离方法（如平板分离法、稀释平板法等）进行分离。
通过观察不同菌落形态和颜色，筛选出枯草芽孢杆菌单菌株。
3.生理生化鉴定对分离到的枯草芽孢杆菌进行生理生化鉴定，包括形态学观察、生长特性、氧化还原反应、产酶活性等。
利用生化试剂盒进行相关检测，确定菌株的生物学特性。
4.分子鉴定通过16SrRNA序列分析或蛋白质质谱鉴定等分子生物学方法，确认所分离到的枯草芽孢杆菌的属种分类，并与数据库中的已知菌株进行比对验证。
5.枯草芽孢杆菌存取将鉴定完成的枯草芽孢杆菌单菌株保存在甘油保存流质中，存放在-80°C低温冰箱中备用。
1.发酵基质的选择选择适宜的发酵基质对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有重要影响。
常用的基质包括葡萄糖、大豆粉、玉米粉等，可以根据具体需求进行配比调整。
2.发酵菌种培养条件通过扩种培养，将枯草芽孢杆菌预培养至指数生长期，然后接种至发酵罐中，保持较高的菌液浓度，有利于产酶和生长。
3.发酵条件的控制在发酵过程中，通过控制温度、pH值、通气速率、发酵时间等因素，调节菌体生长、产酶效率和产物生成速率。
通常，较适宜的发酵条件为温度37°C-42°C，pH值6.0-8.0，通气速率1.0-2.0L/min。
枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用
枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用李天芝;于新友;沈志强【摘要】参照GenBank中登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因,设计1对引物,扩增片段大小为460 bp的基因片段,该方法对枯草芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,对枯草芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立枯草芽孢杆菌PCR检测方法,且该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】4页(P24-27)【关键词】枯草芽孢杆菌;16S rRNA基因;PCR;方法【作者】李天芝;于新友;沈志强【作者单位】山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600【正文语种】中文【中图分类】S852.61+6;S816.7枯草芽孢杆菌是一种可形成芽孢的好氧革兰氏阳性菌，该菌具有生长条件简单、耐温度变化、快速复活、快速生长和较强分泌酶等特点[1]。
枯草芽孢杆菌是农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，在自然界中分布广泛，易于分离培养，对人畜无毒无害，能产生脂肽类、氨基酸和磷脂类等多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性，可改善动物肠道菌群结构，增强免疫力，促进生长发育，提高生产性能的作用[2-3]。
近年来，国内外对于枯草芽孢杆菌在饲料加工方面的应用有大量相关报道。
猪饲料中添加一定量的枯草芽孢杆菌，能增强仔猪免疫力、提高生长性能[4]。
蛋鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌，即能增加种鸡的产蛋量和合格率，还能提高蛋的受精率、孵化率和健雏率[5]。
肉鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌能改善其肠黏膜的抗氧化和免疫功能，从而提高肉鸡的生长性能[6]。
枯草芽孢杆菌添加到奶牛饲料中，能显著提高奶牛产奶性能（P＜0.05）[7]。
枯草芽孢杆菌添加到兔饲料中，能显著促进幼兔肠道免疫系统发育[8]。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定枯草芽孢杆菌是一种常见的芽孢杆菌，广泛分布于土壤、水体等环境中。
该菌具有极强的抗逆性，可以在高温、低温、酸碱等各种恶劣环境下存活和繁殖。
此外，枯草芽孢杆菌还具有很高的代谢活性和生物学特性，被广泛应用于食品、医药、化工等领域。
枯草芽孢杆菌的分离和鉴定是研究其生物学特性和应用价值的重要步骤。
下面介绍一种常规的分离和鉴定方法。
1. 选择适宜的培养基和培养条件枯草芽孢杆菌是一种厌氧菌，通常需要选择富含营养物质和适宜的pH、温度等培养条件的培养基来进行分离和培养。
常用的培养基包括厌氧培养基、肉汤培养基、营养琼脂培养基等。
在选用培养基时，需根据研究对象和实验要求进行选择。
2. 样品处理和接种将样品收集到无菌容器中，并在避光下尽快送到实验室进行处理。
将样品加入适量的生理盐水或其他缓冲液中，进行适当的稀释后，从中取出一定量的液体或固体，接种到培养基上。
3. 培养和观察将接种好的培养基放置在适当的环境中进行培养，观察菌落的生长情况、形态特征等。
枯草芽孢杆菌通常在48小时内开始生长，生长后的菌落大小通常为1-3mm，形态呈不规则的肉眼可见点状或细菌丝状，表面为平滑或粗糙，颜色从白色到灰色等不等。
根据菌落的形态特征和大小、颜色等可初步判断是否为枯草芽孢杆菌。
4. 鉴定针对初步判断为枯草芽孢杆菌的菌株，需进行进一步的鉴定和鉴别。
常用的鉴定方法包括生理生化检测、生化反应检测、DNA序列分析等。
其中，生物化学检测可通过对菌落的形态、营养物质的利用情况、代谢产物等进行分析来进行鉴定。
在实验设计过程中，应该根据样品来源、实验需求来设计相应的检测方式，保证分离和鉴定的可靠性和准确性。
综上所述，枯草芽孢杆菌的分离与鉴定是菌类学研究和应用中的重要步骤。
只有凭借可靠的实验方法和技术流程，才能保证研究成果的准确性和可靠性。
高效液相色谱-电喷雾质谱法分离和鉴别枯草芽孢杆菌产生的脂肽类化合物
一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺[发明专利]
![一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/fd70312b974bcf84b9d528ea81c758f5f61f2920.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.11.05C N 104130318A (21)申请号 201410382361.7(22)申请日 2014.08.06C07K 14/32(2006.01)C07K 1/34(2006.01)(71)申请人山东仙普爱瑞科技股份有限公司地址261500 山东省潍坊市高密市柏城工业园1460号(72)发明人郭海岩 刘刚 王茂超 王兴业张淑兰 王亮 郭莎莎 王雅静王红军(74)专利代理机构济南舜源专利事务所有限公司 37205代理人尉金洪(54)发明名称一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺(57)摘要本发明涉及一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，属于生物技术领域，以枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过对发酵液的离心、膜分离、喷雾干燥处理制备抗菌肽成品，采用两个连续离心机离心，再经过分级膜分离，可最大限度去除菌体和杂蛋白，得到活性较高的抗菌肽，利用了抗菌肽的耐热性，通过喷雾干燥技术，使抗菌肽快速干燥，提高了抗菌肽制备效率，且麦芽糊精作为辅料具有溶解性好、稳定性高、不宜吸潮变质、含有丰富微量元素和矿物质等优点，本发明分离纯化抗菌肽活性高，成本低廉，工艺简单，后期处理损耗较低。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书8页 附图1页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页 附图1页(10)申请公布号CN 104130318 A1.一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，其特征在于：所述后提取工艺包括依次进行的放罐、离心、膜分离、调节pH值和喷雾干燥步骤。
2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，其特征在于：所述膜分离步骤中将离心后的上清液进行分级过滤，过滤温度40℃，陶瓷膜设备的进出口压降为0.1～0.15MPa，平均通量为0.5m3/h，除去菌体和杂蛋白率达到99.97%～99.99%，膜分离后的上清液中抗菌肽的抑菌效价为12689～12813。
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一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法王大威;张健;姜伟;张凤久【摘要】脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物产生的一类具有较强表面活性的生物表面活性剂.枯革杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(afp)是枯草芽孢杆菌中参与脂肽代谢的功能性基因.采用sfp基因PCR对从环境中得到的一组产生表面活性剂的微生物进行筛选,结合Tricine-SDS-PAGE电泳对PCR结果呈阳性的菌蛛的代谢粗初提物进行检测,初步鉴定得到两株枯草芽孢杆菌.进一步利用16S rDNA序列的系统发育学分析确定这两种菌株为枯草芽孢杆菌,并利用TLC、HPLC鉴定其产物为脂肽类表面活性剂,从而建立了一套快速分离检测产生脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌方法.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】5页(P142-146)【关键词】脂肽;枯草芽孢杆菌;sfp基因;Tricine-SDS-PAGE;电泳【作者】王大威;张健;姜伟;张凤久【作者单位】中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中国海洋石油总公司,北京100027;中国海洋石油有限公司,北京100027【正文语种】中文脂肽(Lipopeptide)又名脂酰肽(Acylpeptide)，是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成的小肽，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂显示了十分优良的特性，在医药、食品、化妆品、环境治理和微生物采油等领域都有广泛的应用[1] 。
大多数脂肽来源于微生物，而其中以来源于细菌的脂肽居多。
目前发现的脂肽类生物表面活性剂有10余种，主要包括Surfactin、Lichenysin、Iturin和Fengysin等[2] 。
其中表面活性素(Surfactin)是一类环状结构的脂肽(图1)，具有良好的表面活性，能增加憎水烃类的生物可获得性，激发烃的生物降解，与部分重金属结合能移除被污染的土壤和沉积物中的重金属;同时，还具有特殊的生物活性，能提高尿激酶的活性，防止血液凝结。
脂肽类生物表面活性剂发现35年来，尽管相比于化学合成表面活性剂，其具有诸多优点，但目前脂肽类表面活性剂的应用还十分有限。
这主要是因为发现的产生脂肽的菌株较少，公开报道只有20株菌株可以产生脂肽[3] 。
近年来，人们一直采用血平板法和扩油圈法筛选产生物表面活性剂的菌株，这些方法不仅工作效率低，且不能有效将产脂肽的微生物从中区分开;同时鉴定微生物产生的脂肽的方法一般都采用高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)、质谱对纯化的产物进行分析，这些检测手段对产物的纯度要求较高，但脂肽类生物表面活性剂纯化需要经过酸化沉淀、冷冻干燥、真空抽干等繁琐的工序，费时而且效率低，因此如何快速筛选产生脂肽类表活剂的微生物一直是困扰研究人员的主要问题。
枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(sfp)位于srf操纵子的下游(图2)，片段长4 kb，是参与脂肽代谢的第二调控元件。
Nakano等[4] 确定了sfp基因的核酸序列，其编码枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶(SFP)属于 4-phosphopantetheinyl transferase超家族。
Hsieh等[5] 曾报道针对sfp基因合成引物，建立快速鉴定产脂肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的方法，但该方法后期同样采用传统的HPLC(高效液相色谱)对菌株产物进行分析，在产物纯化时还是会消耗大量的时间和人力。
考虑到采用常规方法分离纯化微生物产生的脂肽存在的诸多困难，本研究拟采用以往蛋白质分离常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法对代谢产物进行分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法是分离蛋白质的常用生化方法，该方法简便、快速、价廉、不需要对蛋白或肽类进行过多处理，并具有相对较高的分辨率，但由于Bacillus属细菌所合成脂肽的相对分子量多在1 kD左右，为避免SDS微团对蛋白质分离产生干扰，本研究采用80年代末由Schagger和von Jagow首创的三羟甲基氨基甘氨酸Tris-tricine缓冲系统[6] 对脂肽进行分析。
该系统可使小蛋白质-SDS复合物与SDS微团分离，去除干扰，最小可分离1－10 kb的蛋白质，10多年来，一直利用这种较简便的不连续梯度胶分离小分子肽。
本试验采用sfp基因PCR结合Tricine-SDSPAGE电泳拟建立一套快速分离检测枯草芽孢杆菌及其产物脂肽的方法，减少在菌株分离和产物纯化过程中的对人力和时间的浪费，加快分离目标菌株的进程，为今后现场筛选脂肽类表面活性剂产生菌株提供可靠的方法。
1.1.1 菌株 10株现场分离的产生生物表面活性剂的未知菌株，标准菌株为本实验室保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZW-3。
1.1.2 培养基液体培养基用基本无机盐培养基：K2HPO4·3H2O 4.8 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.2 mg，三水合柠檬酸钠0.5 g，酵母浸出物0.1 g，氮源为1 g硫酸铵，葡萄糖为碳源，加水配成1 L溶液。
固体培养基另加2%的琼脂，121℃灭菌20 min。
1.1.3 标准品脂肽标准品购自于Fluka(Sigma)。
1.2.1 sfp基因的PCR扩增将初筛的菌株接种于摇瓶培养基中180 r/min 37℃振荡培养3 d。
基因组 DNA的提取参考分子克隆实验指南(第3版)[7] 。
sfp基因的PCR扩增方法参考文献[5] 。
提取细菌基因组DNA，以其为模板PCR扩增sfp基因。
引物f(5'-ATGAAGATTTACGGAATTTA-3')和r(5'-TTATAAAAGCTCTTCGTA-3')由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR体系采用20 μL，反应体系：10×PCR 缓冲液(含MgCl220 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，DNA 模板1 μL，去离子水13.8 μL。
PCR扩增程序：94℃ 10 min;94℃ 1 min，46℃ 30 s，72℃ 1 min。
共25个循环;72℃ 10 min。
PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳进行检测。
1.2.2 Tris-tricine缓冲系统丙烯酰胺凝胶电泳参照文献[8] ，将PCR阳性菌株接种于摇瓶培养基中180 r/min 37℃振荡培养3 d，发酵液8 000 r/min离心10 min，弃菌体沉淀。
制胶方法与普通Tris-Gly系统相同，注意电泳槽内分别加入阴极和阳极电泳缓冲液，将上清液和Surfactin脂肽标准品溶液(400 μg/mL)上样后，先在30 V恒压下电泳1 h，然后在150 V恒压下电泳4 h，溴酚蓝前沿即可移动到离底部约0.5－1 cm，停止电泳，凝胶小心取下后，浸入染色液中染色，而后脱色、保存。
电泳后，凝胶首先经考马斯亮蓝G-250染色液初染，再使用油红O进行了第二次染色，油红O为脂溶性染料，用于脂类染色。
1.2.3 16S rDNA基因的序列分析为最终确定PCR扩增呈阳性及产物经Tricine-SDS-PAGE电泳为脂肽的目标菌株的种属，对其进行16S rDNA基因的序列分析。
以细菌基因组DNA为模板，扩增引物采用细菌通用引物B14926(5'-CCGGATCCAGAGTTTGATCCTGGTCAGA-ACGAACGCT-3')和B14927(5'-CGGGATCCTACGCCTACCTTGTTACG ACTTCACCC-3')(上海生工生物技术有限公司合成)。
PCR反应体系选用20 μL反应体系：10×PCR缓冲液(含 MgCl220 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，DNA 模板 1 μL，去离子水13.8 μL。
PCR扩增程序：94℃ 10 min;94℃45 s，55℃ 60 s，72℃ 70 s，共 30 个循环;72℃ 10 min。
扩增的PCR产物连接到载体pMD18-T(TaKa-Ra)上，转化E.coli DH5α。
提取有16S rDNA插入的质粒并测序，序列测定由北京三博远志公司完成。
1.2.4 脂肽薄层层析(TLC)鉴定脂肽薄层层析方法参照文献[9] ，将分离得到的表面活性剂样品溶解在二氯甲烷中配成溶液。
取两块活化的薄板，记为A板、B板，每块板分别点样，在氯仿∶乙酸=8∶2(V/V)中展开10 min。
挥发掉溶剂后，A板直接以茚三酮试剂(0.15%的茚三酮丙酮溶液)显色。
把B板放入耐高温的密封瓶内，瓶中预先以小杯盛约1 mL浓盐酸，110℃烘箱中熏蒸1 h进行原位酸水解，通风橱中冷却，吹去盐酸后，以茚三酮试剂显色。
1.2.5 脂肽高效液相色谱(HPLC)鉴定为进一步验证Tricine-SDS-PAGE电泳的有效性和稳定性，对脂肽表面活性剂进行纯化。
纯化样品采用高效液相色谱进行检测，流动相 A(40%乙腈 +60%10 mmol/L醋酸铵，pH6.9)，流动相 B(乙腈)，进行梯度洗脱，0－10 min内B相由10%变到25%，流动相1.0 mL/min、反相C18柱、紫外215 nm检测即可。
sfp基因PCR产物电泳(图3)显示10株生物表面活性剂代谢菌株中，ZW-4、ZW-8在675 bp处有条带，与正对照菌株一致，可以初步判定为枯草芽孢杆菌。
对细菌发酵液离心上清电泳后，凝胶首先经考马斯亮蓝G-250染色液初染，发现发酵液最前沿条带呈浅蓝色，其迁移距离与Surfactin脂肽标准品相同。
为了进一步确认该条带为脂肽，经油红O染色后，原本呈浅蓝色的最前沿条带和Surfactin 脂肽都被染成红色，可确定该条带为脂肽，电泳结果如图4所示。
染色体DNA用PCR扩增出单一条带，PCR产物回收纯化后，经DNA测序，序列长度为1 426 bp，与GenBank中现有的菌种的16S rRNA基因序列比对，进一步确定 ZW4、ZW8菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，与sfp基因PCR结果、Tris-tricine凝胶电泳结果吻合。
将纯化脂肽进行薄层层析，使用氯仿/乙酸为展开剂，以Surfactin标准样为对照，层析结果如图5所示，样品与Surfactin相当，并且只呈现1个斑点，证明样品被纯化，菌株代谢产物为脂肽(Surfactin)。