微生物荧光原位杂交实验技术

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荧光原位杂交技术原理

荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）
是一种用于检测和定位靶标DNA序列的方法。

其原理是利用
荧光标记的DNA探针与靶标DNA特异性结合，通过荧光显
微镜观察细胞核内荧光信号的强度和位置，从而确定目标
DNA序列在细胞核中的位置和数量。

荧光原位杂交技术的步骤包括标记DNA探针、固定细胞样品、使细胞核开放透明化、探针与目标DNA杂交、洗涤去掉无特
异连接的探针、显微镜观察和分析。

在标记DNA探针的过程中，将目标DNA序列特异性引物和
荧光标记的核苷酸引物结合，通过聚合酶链反应使DNA探针
荧光标记。

标记DNA探针可以选择性地与目标DNA序列进
行互补结合。

固定细胞样品后，可以通过化学方法将细胞膜破裂并使细胞核透明化，使DNA探针能够更好地进入细胞核。

随后将标记好
的DNA探针加入样品中，在适当的温度下进行DNA杂交反应。

如果目标DNA序列在细胞核中存在，则DNA探针与目
标DNA序列结合，形成探针-目标DNA复合物。

在杂交反应后，需要进行洗涤步骤以去除无特异连接的DNA
探针。

这样可以提高荧光信号的特异性和强度。

最后，利用荧光显微镜观察样品中的荧光信号。

荧光探针与目标DNA序列结合后会发出特定颜色的荧光信号，可以通过观
察荧光信号的位置和强度来确定目标DNA序列在细胞核中的位置和数量。

荧光原位杂交技术可以应用于医学诊断、基因定位等领域，成为研究细胞遗传学和基因组学的重要工具。

荧光原位杂交

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。

下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。

非生物学专业的同学请不要往下看了。

1 载玻片涂层处理（Slide coating）(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixation）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。

3 脱水（Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交（Hybridization）(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer(2) 在48℃恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。

荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明

荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。

下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。

1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。

可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。

2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。

固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。

这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。

4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。

常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。

-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。

5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。

探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。

探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。

6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。

杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。

杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。

7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。

8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。

荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。

根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。

9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。

使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。

总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。

荧光原位杂交FISH实验步骤与方法

FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160℃以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、0.2mol/ L (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。

-----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解----0．2M (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。

2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB ，加蒸馏水至1000ml，混匀------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。

3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃，------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃-------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。

-------1/3体积的PBS溶液，-------用Hcl将pH调至7.2，定容，-------用孔径为0.22μm的滤膜过滤，----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。

（加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。

荧光原位杂交(FISH)实验步骤

仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。

FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。

（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。

每次新鲜配制。

（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。

每次新鲜配制。

调节pH前升至室温。

实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。

将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。

37℃孵育20min。

3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。

4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

荧光原位杂交操作技术(川农小麦所)

荧光原位杂交操作技术（四川农业大学小麦研究所）1．制片：取固定1-7天的根尖，醋酸洋红制片，液氮揭片，-20度低温冰箱中贮存备用（在载玻片上用刀刻出染色体位置）；用前以95%和100%酒精脱水，各5分钟。

2．探针制备：用Roche公司的Dig-Nick Translation Mix试剂盒按照说明书所述程序制备，置于-20度备用。

3．DNA变性：每张载玻片上加100微升70%甲酰胺(formamide)2 X SSC贮存液，盖上24X24 盖玻片，直接放在80度变性2分钟(可在PCR仪中变性)；取出玻片，轻轻甩掉盖玻片，此步骤动作必须快。

（若发现染色体较粗壮的话，可适当缩短变性时间）70%甲酰胺2XSSC贮存液：1000ul体系：甲酰胺700ul2 X SSC 300ul4．迅速将变性好的载玻片放在预冷（-20度）的70%，95%，100%乙醇中各处理5分钟。

其间用镊子不停晃动载玻片，完后将片子夹出，用纸抹去背面多余的乙醇。

气干。

5．配杂交液：取下列药品放入1.5ml EP管中：去离子甲酰胺（formamide）7.5ul20 X SSC 1.5ulSSDNA（鲑精DNA） 1.5ul50% DS（硫酸葡聚糖）3ulBlocking DNA(封阻) 0.5ulProbe DNA(探针，最后加) 1ul共为15微升体系，加探针后需瞬时离心以混匀。

Note: 探针DNA与封阻DNA浓度比大致控制在40-160（根据基因组间亲缘关系调整此比例）将混合的杂交液在80度条件下变性10分钟(可在PCR仪中变性)，完后迅速取出放在冰水盒中，让冰完全覆盖至少5分钟。

6．确认载玻片已完全变干，将杂交液（15ul）用移液枪加在染色体位置处（已做标记），迅速盖上18X18载玻片，用Rubber Cement将盖玻片周围密封，放在湿润不透光的盒子中37度处理过夜。

注意：此步骤应在避光条件下操作；加杂交液时，须保证无气泡产生；涂Rubber Cement的目的是防止杂交液在37度条件下变干。

【高中生物】荧光原位杂交(FISH)技术详解

【高中生物】荧光原位杂交(FISH)技术详解荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。

1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。

20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。

1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。

20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。

原理FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。

它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。

将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

实验流程FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→(染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析。

特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。

用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。

缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。

采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。

FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。

六大优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

荧光原位杂交操作步骤

荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。

一、样本准备。

要做这个实验，先得把样本处理好。

如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。

这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。

要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。

然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。

二、探针准备。

接下来就是探针啦。

探针就像是专门去找目标的小侦探。

得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。

把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。

三、杂交反应。

然后就到了杂交这一步啦。

把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。

这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。

然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。

在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。

四、洗涤。

杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。

这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。

用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。

五、检测。

最后就是检测啦。

这时候要用专门的荧光显微镜去看。

打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。

如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。

那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。

荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。

荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明

荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。

它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。

该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。

1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。

然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。

接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。

最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。

1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。

通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。

此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。

2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。

在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。

DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。

选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。

其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。

荧光原位杂交实验(FISH)

荧光原位杂交实验（FISH）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

1实验方法原理：荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。

间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。

荧光原位杂交技术及其应用

荧光原位杂交技术及其应用生物学研究中，了解基因表达情况是至关重要的。

荧光原位杂交技术（FISH）是一种常用的细胞学技术，能够直接观察到特定DNA序列的位置和数量，从而研究基因组结构、功能和进化。

本文将介绍FISH技术的原理、方法和应用，并探讨该技术在生物学领域中的前景。

一、FISH技术原理FISH技术是一种基于亲和原理的细胞学技术，它利用荧光标记探针与特定DNA序列的互补配对，使其在细胞核中特异性结合。

探针可以是DNA分子或RNA分子，它们被标记上荧光染料，通过显微镜观察荧光信号来确定探针的结合位置和数量。

FISH技术的主要步骤包括：样品制备、探针标记、探针杂交、洗涤和显微镜观察。

样品制备包括细胞培养、细胞固定和染色。

探针标记可以通过直接或间接标记方法实现。

直接标记方法是将荧光染料直接连接到DNA或RNA分子上，而间接标记方法是通过荧光标记的抗体来识别已标记的DNA或RNA分子。

探针杂交是将标记的探针与细胞核DNA或RNA进行互补配对，通常需要在高温下进行。

洗涤步骤可以去除未结合的探针，从而提高探针的特异性。

显微镜观察则是通过荧光显微镜观察荧光信号，确定探针的结合位置和数量。

二、FISH技术应用FISH技术在生物学研究中有广泛的应用，以下是几个常见的应用领域：1. 基因组结构研究FISH技术可以用于研究基因组的结构和变异。

例如，可以使用不同的探针标记染色体的不同区域，从而确定染色体的结构和数量。

此外，FISH技术还可以用于检测基因组的缺失、重复和重排等变异。

2. 基因表达研究FISH技术可以用于研究基因表达。

例如，可以使用探针标记mRNA 分子，从而确定mRNA在细胞中的分布和数量。

此外，FISH技术还可以用于研究基因转录和剪接等过程。

3. 染色体分析FISH技术可以用于染色体分析。

例如，可以使用探针标记人类性染色体的不同区域，从而确定性染色体的性别和结构。

此外，FISH 技术还可以用于研究染色体异常，如染色体重排、易位和缺失等。

荧光原位杂交技术在生物学研究中的应用

荧光原位杂交技术在生物学研究中的应用在生物学研究中，荧光原位杂交技术是一种常见的分子生物学方法。

通过荧光标记探针，该技术可以在细胞、组织、器官、甚至整个生物体上可视化特定的DNA、RNA序列。

这使得生物学家可以研究细胞内基因表达和基因组组织，这对研究生物学和人类健康问题非常重要。

一、荧光原位杂交技术的概述荧光原位杂交技术利用生物分子之间的互补性进行研究。

DNA和RNA是生命体系中最为重要的分子之一，它们内在的互补性使它们能够识别彼此。

在荧光原位杂交技术中，荧光标记的核酸探针与需要研究的特定序列互补杂交。

这使得荧光探针可以准确地在细胞或组织中可视化。

这种荧光信号可以通过显微镜观察。

二、荧光原位杂交技术的种类荧光原位杂交技术有两种主要的类型:核酸杂交和免疫荧光染色。

1. 核酸杂交核酸杂交是在无细胞和细胞水平上进行的。

在细胞水平上，荧光原位杂交技术通常用于识别和定位细胞中的mRNA分子。

通过将可靠的延伸探针标记附着到mRNA序列上来实现它。

可靠的延伸探针是通过逆转录、克隆和序列分析来获得的，它们是荧光标记的短DNA序列或RNA分子。

在无细胞级别上，荧光原位杂交技术可用于检测细胞和组织中特定的DNA序列。

这是通过采用荧光标记的探针来实现的，这些探针可以杂交到要检测的DNA序列上并显示出荧光标记的颜色。

2. 免疫荧光染色免疫荧光染色是另一种荧光原位杂交技术。

这种方法利用荧光标记抗体来识别和定位特定的蛋白质分子。

准确的荧光探针可以准确地将抗体与依靠特定抗原结构的细胞或组织相结合，显示出特定的荧光标记。

这种方法能够用于检测特定受体、细胞结构或定点蛋白质位置。

三、荧光原位杂交技术的应用本节将介绍荧光原位杂交在生物学研究中的一些应用。

1. 基因表达和调控荧光原位杂交技术是了解该基因在细胞中表达的位置、发展和分化状态所必需的，无论是在发育过程中还是在成人身体中。

例如，基因1在胚胎发育中的表达模式可以通过荧光原位杂交技术来确定，并验证其在造血干细胞、软骨和骨中的表达模式。

荧光原位杂交实验

实验四荧光原位杂交实验一、实验目的1.掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作；2.熟练掌握荧光显微镜的使用方法；3.掌握Image J软件进行图像融合的方法；4.理解荧光原位杂交技术的应用。

二、实验原理核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段，对核酸分子进行定性和定量检测。

两条互补的核苷酸单链在特定条件下退火形成异质双链；应用荧光标记的探针与待检测材料中的单链核酸进行特异性结合，形成可悲检测的杂交双链核酸。

在显微镜下观察并记录结果。

本实验所用探针是位点特异性标记探针GSP myc，是由SpectrumOrange （552/576）直接标记的荧光DNA探针，长度为200bp，能识别8号染色体的着丝粒部位的α卫星序列。

三、实验器材和试剂防脱载玻片（premiere公司），医用砂轮，20×20mm盖玻片，橡皮胶，平板加热器，杂交盒，恒温水浴锅，玻璃染色缸，香柏油，荧光显微镜拍照系统，MYC基因扩增检测试剂盒。

四、实验步骤1.样品处理1）取细胞培养悬液5ml（107 cell）,2000rpm离心5min，去上清；2）加入10ml的0.075M KCl，吹打混匀，静置3min；3）37℃水浴箱低渗30min；4）加固定液2ml，吹打混匀，室温预固定10min；5）2000rpm离心5min，去上清；6）沉淀加固定液5~10ml，吹打混匀，-20℃冰箱静置30min；7）2000rpm离心5min，去上清。

2.制片1）取一张干净的载玻片，用砂轮在背面划“一”标记，尽量在中间或靠下端标记；2）加50ul固定液重悬细胞，取4ul悬液滴加到载玻片上的标记位置，室温晾干；3）平板加热器上烤片，60℃30min，显微镜下观察细胞密度；4）PBS洗涤3min；5）1%多聚甲醛室温固定10min；6）PBS洗涤3min；7）70%、90%、100%梯度乙醇脱水2min；8）取出玻片，室温晾干。

荧光原位杂交技术

硕士学位论文荧光原位杂交技术及其在环境领域内的应用Fluorescence in situ hybridization technology and its application in thefield of environment作者姓名：**学科、专业：环境科学与工程学号：********指导教师：***完成日期：2014/3/26XX理工大学Dalian University of Technology摘要荧光原位杂交（FISH）是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。

总结了一些实验关键步骤的操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面的应用做了综述。

利用FISH 技术在环境样品上直接原位杂交，不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可原位分析它们的空间及数量分布。

并且展望了FISH技术的未来。

关键词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测AbstractFluorescence in situ hybridization （FISH）isa new technologywhich is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle, process and technical issues of FISH.Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples, can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but alsoanalyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the futureof FISH.Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring目录摘要IAbstractII1 荧光原位杂交技术简介41.1 FISH发展历史41.2 FISH原理51.3 FISH基本过程61.3.1 探针制备61.3.2 探针的标记71.3.3杂交前处理71.3.4 杂交81.3.5荧光检测与结果分析91.4 FISH技术特点101.5 常见的技术问题及解决措施101.5.1 FISH检测的假阳性101.5.2 FISH检测的假阴性112 FISH技术在环境领域的应用112.1 对硝化细菌的监测112.2 对除磷细菌的监测122.3 FISH技术在丝状微生物研究中的应用122.4 对厌氧颗粒污泥中微生物的监测132.5 对自然环境中微生物多样性的监测133 未来展望14参考文献151荧光原位杂交技术简介荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。

微生物荧光原位杂交_FISH_实验技术_陈瑛

第40卷　第4期2008年4月哈　尔　滨　工　业　大　学　学　报JOURNAL OF HARB I N I N STI T UTE OF TECHNOLOGYVol 140No 14Ap r .2008微生物荧光原位杂交(FI SH)实验技术陈　瑛1,2,任南琪1,李永峰1,程　瑶1(1.哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090;2.哈尔滨师范大学生物系,哈尔滨150080,E 2mail:chenyinglady@yahoo )摘　要:为更好地应用荧光原位杂交(F I S H )实验进行微生物群落生态研究工作,对F I SH 实验原理和影响F I SH 实验结果准确性的主要因素进行分析和讨论,包括寡核苷酸探针的选择与标记、样品的预处理、杂交液和杂交条件的选择等步骤.总结了一些实验心得,提出关键步骤的操作要点和注意事项,以及F I SH 技术与其他实验手段相结合的发展前景.建议根据不同检测对象和实验目的,对关键步骤进行改进可以提高实验准确性、简化操作和降低成本.关键词:微生物生态学;环境微生物;荧光原位杂交;寡核苷酸探针中图分类号:Q93文献标识码:A 文章编号:0367-6234(2008)04-0546-04M i crob i ology exper i m en t of fluorescence i n situ hybr i d i za ti on(F I SH)techn i queCHE N Ying 1,2,RE N Nan 2qi 1,L I Yong 2feng 1,CHENG Yao1(1.School of M unici pal and Envir on mental Engineering,Harbin I nstitute of Technol ogy,Harbin 150090,China;2.Dep t .of B i ol ogy,Harbin Nor mal University,Harbin 150080,China,E 2mail:chenyinglady@yahoo )Abstract:I n order t o study the ecol ogy of m icr obial communities by app lying Fluorescence in situ hybridiza 2ti on (F I SH )technique,this paper analyzed the p rinci p le of F I SH and the influencing fact ors of the experi m en 2tal accuracy .These fact ors include choosing and marking the oligonucleotide p r obes,p retreating the sa mp les,and choosing the hybridizing s oluti on and hybridizing conditi ons .The experi m ental results were su mmarized and the main operati on points of key p r ocedures were suggested .The future of F I SH combining with other techniques was expected .This paper suggests that the increase of the accuracy,the si m p lificati on of the p r oce 2dure and the decrease of the cost can be achieved by i m p r oving key p r ocedures according t o different sa mp les and researching goals .Key words:m icr obial ecol ogy;envir onmental m icr oorganis m;fluorescence in situ hybridizati on (F I SH );oli 2gonucleotied p r obe收稿日期:2006-03-17.基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(50125823);国家重点基础研究发展计划资助项目(G2000026402).作者简介:陈　瑛(1972—),女,博士;任南琪(1959—),男,教授,博士生导师,长江学者特聘教授. 1969年,Pardue [1]和John [2]两个研究小组建立了原位杂交技术(I SH ),这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下,检测出细胞内特定核酸序列,即采用DNA 或RNA 探针,通过原位杂交的方法,将特定的DNA 或RNA 序列在细胞或染色体上显示出来.最初是采用同位素标记的方法,通过放射自显影,将已结合在靶位上的探针显示出来.后来改进了标记的材料,用包括荧光酶、地高辛、生物素等荧光物质代替了同位素,从而形成了荧光原位杂交(F I SH )技术.荧光物质的使用提高了分辨率,简化了检测步骤,增强了安全性,为同时检测不同的探针提供了可能,从而发展出了多重原位杂交,并被广泛应用.1988年,Gi ovan 2noni 等[3]首次将F I SH 技术引入细菌学的研究.1989年,Del ong [4]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞.近几年,F I SH技术由于其灵敏、快速、使用安全、特异性好等特点,已经成为医学、生态学、遗传学、环境微生物学研究的有力工具.1　F I SH原理和实验步骤F I SH是将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合而形成的新技术.其原理是基于碱基互补的原则,用荧光素标记的已知外源DNA或RNA 作探针,与载玻片上的组织切片、细胞涂片、染色体制片等杂交,与待测核酸的靶序列专一性结合,通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位[5].目前,荧光原位杂交在微生物系统发育、微生物诊断和环境微生物生态学研究中应用较多.由于微生物的16S r DNA、23S r DNA以及它们的间隔区的核苷酸序列具有稳定的种属特异性,通常以它们特定的核苷酸序列为模板,设计互补的寡核苷酸探针,通过与微生物细胞杂交,鉴定微生物的种类、数目以及空间分布等.利用对r RNA(主要是16S和23S r RNA)序列专一的探针进行杂交已经成为微生物鉴定的标准方法.近几年,已对2500多种细菌的16S r RNA 进行了测序,在系统发育水平上得到了大量的有用信息[6].F I SH技术的基本操作过程对染色体、细胞和组织切片来说基本相同,主要包括4个步骤: 1)制备和标记探针;2)准备杂交样品;3)原位杂交;4)信号处理及观察记录.根据不同的实验目的和研究对象,每一步骤的要求和细节会有所变化.对于微生物F I SH实验而言,解决好如下关键步骤的技术问题是获得科学结果的保证.2　F I SH实验关键步骤和方法211　核酸探针的准备核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交,而后又能被特殊方法检测的被标记的已知核苷酸链.根据来源和性质可将核酸分子探针分为基因组DNA探针、c DNA探针、RNA探针以及人工合成的寡核苷酸探针几类.可以针对不同的研究目的选用不同的核酸探针,选择的基本原则是探针应具有高度特异性.核酸探针的制备是F I SH技术关键的一步,影响着该技术的应用与发展.近年来,随着DNA 合成技术的发展,可以根据需要随心所欲地合成相应的核酸序列,因此,人工合成寡核苷酸探针被广泛采用.这种探针与天然核酸探针相比具有特异性高、容易获得、杂交迅速、成本低廉等优点.寡核苷酸探针是根据已知靶序列设计的.一般应遵循如下的设计原则:1)探针长度: 10～50bp.越短则特异性越差,太长则延长杂交时间.2)G+C%应在40%～60%,否则降低特异性.3)探针不要有内部互补序列,以免形成“发夹”结构.4)避免同一碱基连续重复出现.5)与非靶序列区域同源性<70%[7].目前,已有大量寡核苷酸探针被设计合成,并且建立了有关探针的数据库,研究者可以很方便地通过互联网查询所需的探针或设计探针的资料和软件.例如,Loy A.,Horn M.,W angerM.等建立的p r obe Base寡核苷酸数据库,就可以提供以r RNA为目标的寡核苷酸探针的相关资料以及检验探针专一性的软件系统[8].常用于环境微生物检测的寡核苷酸探针见表1.表1　常用于环境微生物检测的寡核苷酸探针探针名称目标微生物E UB338most BacteriaUN I V1390all O rganis m sChis150most of the C lostrid ium h istoly ticum gr oup(C lostrid ium cluster I and II)Clit135s ome of the C lostrid ium litusebu rense gr oup(C lostrid ium cluster X I)LGC354F ir m icu tes(Gram-positive bacteriawith l ow G+C content)HGC A ctinobacteria(high G+C Gram-positive bacteria) ENT183En terobacteriaceaeMg1004M ethy lo m icrobiumMB311M ethanobacteria lesAmx368all ANAMMOX bacteriaN I T3N itrobacter sppNS O B etaproteobacteria l amm on ia-ox id izing bacteriaACA652A cinetobacter 设计或选定的寡核苷酸探针可以用DNA合成仪很方便地合成,然后用荧光素进行标记.常用的荧光素有:异硫氰酸荧光素(F I TC)、羧基荧光素(F AM)、四氯荧光素(TET)、六氯荧光素(HEX)、四甲6羧罗丹明(T AMRA)、吲哚二羧菁(Cy3,Cy5)等[9].这些荧光素具有不同的激发和吸收波长,一般需要选择两种以上的探针同时杂交时,要给这几种探针分别标记不同的荧光素.标记的方法分为间接标记和直接标记.目前,有人在多彩色荧光原位杂交实验中,采用混合调色法和比例调色法,仅用2～3种荧光素就可以给4～7・745・第4期陈　瑛,等:微生物荧光原位杂交(F I S H)实验技术种探针标记上不同的颜色[10].探针的合成与标记可以根据条件自己进行或选择相应的生物技术公司来完成.标记好的探针通常放在-20℃、避光保存.使用前,将探针稀释到5ng/mL的质量浓度,分装备用.212　杂交样品的准备对于微生物原位杂交,首先涉及的是微生物样品的收集.既要求尽可能多地收集到样品中的微生物,又要尽量减少样品中杂质对杂交结果的影响.因此,无论是来自人工培养基的,或是自然环境的,还是污水处理设备的微生物样品,必须先经过打碎、离心、清洗等处理步骤.目的是使微生物细胞与杂质分离、除去杂质、收集细胞.可以用灭菌玻璃珠震荡将样品打碎,1000r/m in离心2m in,取上清液,将上清液5000～8000r/m in离心2m in,弃上清液,再用P BS将收集到的微生物冲洗一次.上述过程每一步可重复2～3次.然后,需要对收集的样品进行固定和预处理.这一步要求微生物细胞保持形态基本不变,同时要增大细胞壁的通透性,保证探针顺利进入与DNA或RNA杂交.一般先用4%多聚甲醛溶液固定,4℃过夜.如果不能马上进行杂交实验,可将固定好的样品暂时放在50%乙醇/P BS溶液中, -20℃保存.杂交实验前,用P BS液清洗,离心收集.用蛋白酶K,3730m in,减少蛋白质对杂交的影响.再用溶菌酶处理10m in,以增加细胞的通透性.最后用梯度酒精(50%,80%,95%, 100%)依次脱水.213　杂交这一步首先涉及配制杂交液.一般的荧光原位杂交液的组成成分有:氯化钠、Tris-cl缓冲液、S DS或Tri onx-100、甲酰胺以及硫酸葡聚糖.各种成分的浓度见表2.S DS和Trit onx-100的作用是去污,二者取一即可.硫酸葡聚糖的作用是增加探针的相对浓度.甲酰胺的浓度直接影响杂交的特异性,因此,需根据不同的探针和杂交温度加以选择.一般情况下,甲酰胺的浓度和杂交温度越高,探针的特异性越强,反之,探针的特异性降低.探针在杂交前加入杂交液中,使其终质量浓度为015ng/mL.表2　荧光原位杂交液的组成成分NaCl/ (mol・L-1)Tris-cl/(mmol・L-1)S DS/%甲酰胺/%01920011～15～55 杂交在载玻片上进行,取经过预处理的样品涂于载片,充分干燥后,加杂交液.在微生物F I SH 实验中,样品与杂交液的比例大约为1∶2,通常是10μL样品加20μL杂交液,置于46℃杂交炉中,避光杂交2～4h.由于杂交温度较高,杂交液又很少,容易蒸发干燥,因此,需使用密闭湿盒.杂交完成后,要用洗脱液将多余的探针除去.常用洗脱液为SET或SSC,洗脱温度低于50℃.洗脱是否充分会影响杂交结果的准确性,因此,常采用多梯度、多次的洗脱方法.如果检测同一样品中的多种微生物,往往需要使用二种以上的探针,只要在洗脱后,在新的杂交液中再加入其他16S r RNA探针溶液,按上述步骤杂交即可.214　结果观察和分析全部操作完成后,加少量对苯二胺-甘油溶液覆盖样品,防止荧光淬灭,再封片.结果用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜(CLS M)观察、照相并进行分析.共聚焦显微镜空间分辨力强、敏感性高、可屏蔽自发荧光的干扰.其与数字成像系统结合,可进行量化分析和自动化分析,已越来越多地应用于F I SH信号检测[6].另外利用流式细胞仪可以对于每一个靶细胞-探针杂交物的荧光强度进行定量测定.下列图片中显示了CLS M拍摄下的、用上述方法进行的F I SH实验结果.其中,图1是分别用红色ROX和黄色TET标记的两种探针双杂交实验结果,图2为分别用RDX、TET、绿色(F I TC)染料标记的探针的单杂交实验结果.检测的样品是活性污泥中收集来的混合细菌.图1　双色探针杂交实验(使用显微镜倍数×63oil)) 215　F I SH技术存在的问题和解决方案F I SH技术在某些方面也存在缺陷.例如,在营养饥饿状态下,细菌的染色体含量降低,因而细胞中的16S r RNA减少,会导致荧光杂交信号减弱形成假阴性结果.为了增强杂交信号,研究了一些荧光增强方法,如多重探测、生物素、亲合素标记等方法.Prescott和Fricker[11]利用核酸肽・845・哈　尔　滨　工　业　大　学　学　报第40卷　(P NA )作为探针进行原位杂交,检测自来水中的E .coli,取得了与传统的平板计数法相一致的结果.P NA 探针具有稳定、不易降解和较高的杂交亲和力等特性,检测细菌细胞的r RNA 具有较高的灵敏性,即使是细菌死亡一段时间后也可能被检测到.而且,由于其主链骨架是中性的,并且通常比寡核苷酸探针短,能够通过疏水的细胞壁,具有较好的渗透性,因此,可以大大提高F I SH 实验的灵敏性[12].使用显微镜倍数为×63oil图2　单杂交实验另外,细菌普遍存在的自发荧光现象及探针的特异性不足还可能导致假阳性结果.使用窄波段的滤镜和信号放大系统可能降低自身背景荧光,不同激发波长对自身背景荧光强度也有影响,因此,在检测未知混合微生物时,要进行相应处理.共聚焦显微成像系统(CLS M )可以较好地解决这一问题.探针的特异性需要通过严格的杂交条件控制和设置阳性对照来保证.在进行微生物生态学研究中应结合传统的培养、镜检等方法及现代分子生物学的多种方法,使得到的结果更加可信.3　F I SH 技术的发展F I SH 技术逐渐形成了从单色到多色、从中期染色体到粗线期染色体再向DNA 纤维的发展趋势,灵敏度和分辨率正在由mb 向kb 、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、大片段向小片段再向BAC /Y AC 等方向深入[13].F I SH 技术还与其他技术相结合,为环境微生物的研究提供更多信息.例如,O r phan [14]等人利用F I SH 与次级离子质谱(SI M S )结合对厌氧条件下的甲烷氧化菌进行了鉴定;Lee [15]等人采用F I SH 与显微放射自显影技术研究了生化物质在细胞内的合成、转移和转化等代谢过程;Sekigu 2chi [16]等人利用共聚焦激光扫描显微镜与F I SH 技术得到了不同菌种在颗粒污泥内部成层分布的高清晰照片[17].与生物传感器结合也是F I SH 技术在环境微生物研究中应用的新手段.随着技术的不断进步,F I 的准确性和灵敏度将进一步提高,必将在微生物生态学研究领域得到更加充分的应用.参考文献:[1]P ARDUE M L,G ALL J G .Molecular hybridizati on ofradi o active DNA t o the DNA of cyt ol ogical p reparati ons [J ].Pr oc Natl Acad Sci US A,1969,6464:600-604.[2]JOHN H,B I RNSTI E L M,JONES K .RNA:DNA hybridisatthe cyt ogenetical level[J ].Nature,1969,223:582-587.[3]GI O VANNON I S J,DE LONG E F,OLSE N G J,et a l .Phyl ogenetic gr oup s pecific oligodeocy nucleotide p r obes f or identificati on of single m icr obial cells[J ].J Bacteri 2ol,1988,170:720-726.[4]DE LONG E F,W I CKHAM G S,P ACE N R.Phyl onge 2netic stains:ribos omal RNA based p r obes for the identi 2ficati on of single m icr obial cells [J ].Science,1989,65:5554-5563.[5]逄兵,蒋学之,倪祖尧,等.荧光原位杂交原理及其在染色体畸变研究中的应用[J ].劳动医学,1997,14(1):52-56.[6]王建龙.荧光原位杂交(F I SH )技术检测水体中大肠菌群研究[J ].中国生物工程杂志,2004,24(2):70-73.[7]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M ].2版,北京:中国协和医科大学出版社,1999.[8]LOY A,HORN M ,WAG NER M.Pr 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荧光原位杂交实验方法及步骤

荧光原位杂交实验⽅法及步骤2.38.1 实验⽅法及步骤(1) 探针变性将探针在75℃恒温⽔浴中温育5min，⽴即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。

(2) 标本变性a.将制备好的染⾊体玻⽚标本于50℃培养箱中烤⽚2～3h。

(经Giemsa染⾊的标本需预先在固定液中退⾊后再烤⽚)。

b.取出玻⽚标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。

c.⽴即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰⼄醇系列脱⽔，每次5min，然后空⽓⼲燥。

(3) 杂交将已变性或预退⽕的DNA探针10µL 滴于已变性并脱⽔的玻⽚标本上，盖上18×18盖玻⽚，⽤Parafilm封⽚，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜(约15～17h)。

由于杂交液较少，⽽且杂交温度较⾼，持续时间⼜长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进⾏。

(4) 洗脱此步骤有助于除去⾮特异性结合的探针，从⽽降低本底。

a.杂交次⽇，将标本从37℃温箱中取出，⽤⼑⽚轻轻将盖玻⽚揭掉。

b.将已杂交的玻⽚标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。

c.在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。

d.在室温下，将玻⽚标本于2×SSC中轻洗⼀下。

e.取出玻⽚，⾃然⼲燥。

f.取200µL复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻⽚标本上，盖上盖玻⽚。

(5) 杂交信号的放⼤(适⽤于使⽤⽣物素标记的探针)a.在玻⽚的杂交部位加150µL封闭液I，⽤保鲜膜覆盖，37℃温育20min。

b.去掉保鲜膜，再加150µL avidin-FITC于标本上，⽤保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。

c.取出标本，将其放⼊已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。

其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。

试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。

（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。

（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。

（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。

称量试剂勺也要干烤。

塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。

若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。

（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。

2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。

荧光原位杂交实验具体步骤及方法

荧光原位杂交实验具体步骤及方法用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。

2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。

（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。

（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。

3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。

由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。

（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。

（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。

（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。

（5）取出玻片，自然干燥。

（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。

一种细菌荧光染色的方法

一种细菌荧光染色的方法细菌荧光染色是一种常用的技术，通过荧光染料与细菌中的特定结构或分子相互作用，使其发出荧光信号，以便观察和研究细菌的形态、结构和功能。

下面我将介绍一种常见的细菌荧光染色方法——荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）。

荧光原位杂交是一种特异性的核酸杂交方法，可以迅速、高效地将标记了荧光染料的核酸探针与靶细菌的DNA或RNA序列结合。

这种方法可用于在单个细菌细胞或细菌群体中定位和鉴定特定的细菌，使得细菌在荧光显微镜下形成明亮的点或条带。

荧光原位杂交的主要步骤包括：制备探针、固定细菌、杂交和显微镜观察。

首先，设计和合成荧光探针。

荧光探针是一段特异性的寡核苷酸序列，与目标细菌DNA或RNA序列的互补部分配对，从而实现荧光染色。

探针通常选择到目标细菌特异性基因或序列，如16S rRNA基因。

染色的荧光探针可以通过化学合成或PCR扩增的方式制备得到，其中至少含有一对标记有不同颜色的荧光染料。

其次，固定待染色的细菌。

将细菌细胞进行化学固定，常用的固定剂包括氯仿、醋酸乙酯、高氯酸等。

固定处理主要是为了保持细菌的形态结构，同时阻止细菌内的核酸酶降解探针。

然后，进行荧光原位杂交。

将固定的细菌与荧光标记的探针一同处理，使其在适当的条件下发生杂交反应。

杂交反应通常在相对低的温度和高盐条件下进行，以促进探针与细菌的特异结合。

最后，使用荧光显微镜观察和记录结果。

将染色好的样品装载到荧光显微镜的载玻片上，通过选择适当的荧光滤光片组合，观察和记录细菌的荧光信号。

荧光显微镜能够同时检测多种不同波长的荧光染料，从而实现多重标记，对于细菌的鉴定和数量分析非常重要。

荧光原位杂交技术具有许多优点，例如快速、灵敏、定量等。

它可以定位和识别混合菌群中的特定细菌，对于环境微生物学、临床诊断和微生物生态学等领域都具有重要的应用价值。

此外，荧光原位杂交方法还可以与其他技术相结合，如流式细胞术、原位PCR等，进一步扩展其应用范围和功能。