支原体污染-细胞培养技术
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从门外汉角度谈—
支原体污染及防治
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1
支原体污染易被忽视 1.培养液可不发生混浊 2.细胞病理变化轻微或不显著 3.细微变化也可由于传代,换液而缓解。 4.个别严重者,可致细胞增殖缓慢,甚 至从培养器皿脱落
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2
支原体高污染率
国内外研究表明,在细胞培养中,支原体感染 率达到30-60%
支原体污染已成为世界问题!
应对支原体污染的策略一
• 细胞一旦发生了支原体污染,应当弃之。虽 然已有了针对支原体的抗生素及最近出现 的所谓支原体清除剂,这些方法只能杀灭细 胞外的支原体。
• 除非是不可替代或无法重新获得的细胞一, 般没有必要进行支原体清除工作。
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支原体的清除方法
20
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
支原体的清除方法
• 新一代支原体抗生素M-Plasmocin • 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核 糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻。另一 种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA 的复制。 • 可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细 菌,同时又不影响细胞本身的代谢,且处理过 的细胞不会重新感染支原体,是目前对抗支 原体最理想的方法。
3.定期对实验室中的培养物进行支原体检测。这也是国外 一些重要实验室的经验。一旦发现已经污染支原体的 培养物,灭活后弃之。更换新的培养物。避免支原体的进一 步播散。
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支原体污染的常用检测方法
• 缺点:有时易出 现假阴性和假阳 性
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支原体污染的常用检测方法
• PCR法:通过扩增被 检测标本中的支原体 DNA ,再进行琼脂糖 凝胶电泳。电泳完毕, 将电泳胶在紫外投射 仪下观察,根据标准 分子量及阳性对照、 内对照条带,观察待 测样品中是否有阳性 条带。
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支原体污染的类型
• • • • • • 口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支原体(M.fermentans) 梨支原体(M. pirum) 莱氏无胆甾原体(A.laidlawi)
5
支原体污染的来源
• 操作者无菌操作技术不当、 • 污染之培养基、血清、细胞等。 • 操作室环境不佳、实验器具不洁。
3333333
3
支原体的生物特性
◆是目前发现的最小细胞, 直径约为0.13-0.18μm。 ◆无细胞壁,不能维持固 定的形态,变形能力大。 ◆革兰氏染色不易着色或 呈阴性。 ◆胞膜中含有胆固醇或其 他甾醇。 ◆多数支原体适合在偏碱 性条件下生存(pH值 7.6~8.0),对酸耐受性 差。 ◆对热比较敏感,对一般 抗生素不敏感。 4
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M-Plasmocin
支原体感染的细胞
经M-Plasmocin处 理过的细胞
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应对支原体污染的策略二
1.从可靠来源引进、使用细胞,特别是知名的信誉良好 的专门机构,如ATCC、基础医学细胞中心等,这些机构对细 胞质量进行一系列检测。
2.预防为主:细胞培养实验室应制定严格的管理制度, 按照规范的实验程序操作。
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支原体污染对细胞的影响
9
支原体污染对细胞的影响
2.影响细胞的代谢和功能 • (1)培液中的精氨酸被支原体大量消耗, 引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合 成障碍; • (2)支原体活动使培液成分发生改变(如 发酵型支原体降解糖类产生酸性物质), 影响细胞代谢。 • (3)支原体吸附在细胞表面,破坏细胞膜 的完整性,影响细胞信号传递;
6
科研人员的困惑
有些实验结果仅能 在支原体阳性的细 胞中得到
也曾有利用肿瘤细胞制备的单克隆 抗体实为针对所污染的支原体的抗 体。还有的科研成果,他人无法重复, 也因所用细胞有支原体污染所致。
实验结果真实性和可靠性大大 下降
7
支原体污染对细胞的影响
• 1、影响细胞的生长状态及形态
• 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物 质含量减少,造成细胞生长缓慢甚至停止; 另外还会导致细胞微管解聚,引起细胞一 系列病变,表现为细胞收缩、贴壁细胞脱 落、裂解等。
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支原体污染的常用检测方法
• 1.培养法:原理是 利用营养丰富的培 养基,直接对待检细 胞、血清等进行支 原体培养。
缺点:灵敏度低,试 验周期长,不能检测 到种且不适用于检测 所有支原体。
15
支原体集落呈“油煎蛋”样
支原体污染的常用检测方法
• DNA荧光染色法 • 利用荧光Hoechst33258 标记细胞和支原体DNA, 在紫外光(波长为630 nm)激发下产生黄绿色 荧光,利用荧光显微镜 观察支原体是否存在。
10
支原体污染对细胞的影响
• (4)支原体消耗细胞的核苷库—染色体异常
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12
支原体污染对细胞的影响
• 3、其他
• 此外,支原体污染还会影响一些病毒在细 胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、 影响淋巴细胞分化等。
13
支原体污染的检测方法
• • • • • • • • 培养法 DNA荧光染色法 聚合酶链反应(PCR)法 电子显微镜法 相差显微镜检测 3-H胸腺嘧啶掺入法 酶联免疫吸附试验、免疫荧光法 低张处理地衣红染色观察
支原体污染及防治
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支原体污染易被忽视 1.培养液可不发生混浊 2.细胞病理变化轻微或不显著 3.细微变化也可由于传代,换液而缓解。 4.个别严重者,可致细胞增殖缓慢,甚 至从培养器皿脱落
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支原体高污染率
国内外研究表明,在细胞培养中,支原体感染 率达到30-60%
支原体污染已成为世界问题!
应对支原体污染的策略一
• 细胞一旦发生了支原体污染,应当弃之。虽 然已有了针对支原体的抗生素及最近出现 的所谓支原体清除剂,这些方法只能杀灭细 胞外的支原体。
• 除非是不可替代或无法重新获得的细胞一, 般没有必要进行支原体清除工作。
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支原体的清除方法
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
支原体的清除方法
• 新一代支原体抗生素M-Plasmocin • 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核 糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻。另一 种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA 的复制。 • 可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细 菌,同时又不影响细胞本身的代谢,且处理过 的细胞不会重新感染支原体,是目前对抗支 原体最理想的方法。
3.定期对实验室中的培养物进行支原体检测。这也是国外 一些重要实验室的经验。一旦发现已经污染支原体的 培养物,灭活后弃之。更换新的培养物。避免支原体的进一 步播散。
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支原体污染的常用检测方法
• 缺点:有时易出 现假阴性和假阳 性
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支原体污染的常用检测方法
• PCR法:通过扩增被 检测标本中的支原体 DNA ,再进行琼脂糖 凝胶电泳。电泳完毕, 将电泳胶在紫外投射 仪下观察,根据标准 分子量及阳性对照、 内对照条带,观察待 测样品中是否有阳性 条带。
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支原体污染的类型
• • • • • • 口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支原体(M.fermentans) 梨支原体(M. pirum) 莱氏无胆甾原体(A.laidlawi)
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支原体污染的来源
• 操作者无菌操作技术不当、 • 污染之培养基、血清、细胞等。 • 操作室环境不佳、实验器具不洁。
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支原体的生物特性
◆是目前发现的最小细胞, 直径约为0.13-0.18μm。 ◆无细胞壁,不能维持固 定的形态,变形能力大。 ◆革兰氏染色不易着色或 呈阴性。 ◆胞膜中含有胆固醇或其 他甾醇。 ◆多数支原体适合在偏碱 性条件下生存(pH值 7.6~8.0),对酸耐受性 差。 ◆对热比较敏感,对一般 抗生素不敏感。 4
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M-Plasmocin
支原体感染的细胞
经M-Plasmocin处 理过的细胞
22
应对支原体污染的策略二
1.从可靠来源引进、使用细胞,特别是知名的信誉良好 的专门机构,如ATCC、基础医学细胞中心等,这些机构对细 胞质量进行一系列检测。
2.预防为主:细胞培养实验室应制定严格的管理制度, 按照规范的实验程序操作。
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支原体污染对细胞的影响
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支原体污染对细胞的影响
2.影响细胞的代谢和功能 • (1)培液中的精氨酸被支原体大量消耗, 引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合 成障碍; • (2)支原体活动使培液成分发生改变(如 发酵型支原体降解糖类产生酸性物质), 影响细胞代谢。 • (3)支原体吸附在细胞表面,破坏细胞膜 的完整性,影响细胞信号传递;
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科研人员的困惑
有些实验结果仅能 在支原体阳性的细 胞中得到
也曾有利用肿瘤细胞制备的单克隆 抗体实为针对所污染的支原体的抗 体。还有的科研成果,他人无法重复, 也因所用细胞有支原体污染所致。
实验结果真实性和可靠性大大 下降
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支原体污染对细胞的影响
• 1、影响细胞的生长状态及形态
• 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物 质含量减少,造成细胞生长缓慢甚至停止; 另外还会导致细胞微管解聚,引起细胞一 系列病变,表现为细胞收缩、贴壁细胞脱 落、裂解等。
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支原体污染的常用检测方法
• 1.培养法:原理是 利用营养丰富的培 养基,直接对待检细 胞、血清等进行支 原体培养。
缺点:灵敏度低,试 验周期长,不能检测 到种且不适用于检测 所有支原体。
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支原体集落呈“油煎蛋”样
支原体污染的常用检测方法
• DNA荧光染色法 • 利用荧光Hoechst33258 标记细胞和支原体DNA, 在紫外光(波长为630 nm)激发下产生黄绿色 荧光,利用荧光显微镜 观察支原体是否存在。
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支原体污染对细胞的影响
• (4)支原体消耗细胞的核苷库—染色体异常
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支原体污染对细胞的影响
• 3、其他
• 此外,支原体污染还会影响一些病毒在细 胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、 影响淋巴细胞分化等。
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支原体污染的检测方法
• • • • • • • • 培养法 DNA荧光染色法 聚合酶链反应(PCR)法 电子显微镜法 相差显微镜检测 3-H胸腺嘧啶掺入法 酶联免疫吸附试验、免疫荧光法 低张处理地衣红染色观察