蛋白表达不同检测方式的比较和分析(仅供参照)
蛋白质定量分析了解生物体内蛋白质表达的方法
蛋白质定量分析了解生物体内蛋白质表达的方法蛋白质是生物体内重要的组成成分，它们在维持生命活动以及调节生理功能等方面起着关键作用。
了解生物体内蛋白质的表达水平对于研究生物体的功能与疾病机制具有重要意义。
在实验室中，科学家们常常需要进行蛋白质定量分析来准确测量生物体内蛋白质的表达水平。
本文将介绍几种常见的蛋白质定量方法。
一、BCA（巴氏反应）法BCA法是一种常用的蛋白质定量方法，它基于巴氏反应原理，通过将被测蛋白质样本与BCA试剂反应生成可着色的络合物，然后利用分光光度计测定络合物的吸光度来确定蛋白质浓度。
BCA法具有操作简单、反应时间短、灵敏度高的特点，被广泛应用于生物科学研究领域。
二、Lowry法Lowry法是另一种常用的蛋白质定量方法，它利用蛋白质在碱性条件下与铜离子和碱式碳酸铜反应生成可测量的蓝色复合物，再利用比色法测定复合物的吸光度来确定蛋白质浓度。
Lowry法具有较高的敏感性和较宽的线性范围，在分析蛋白质样品时非常可靠。
三、Bradford法Bradford法是一种相对快速且便于操作的蛋白质定量方法。
该方法利用考马斯亮蓝G250（Coomassie Brilliant Blue G-250）与蛋白质之间的非共价相互作用形成蓝色复合物，再通过比色法来测定蛋白质样品的吸光度。
Bradford法具有灵敏度高、线性范围广等优点，常被用于较快速的蛋白质定量。
四、荧光定量法荧光定量法是一种常用于测定蛋白质浓度的灵敏度高的方法。
该方法利用特定的荧光染料与蛋白质发生非共价相互作用，生成荧光染料-蛋白质复合物，进而通过测量荧光信号的强度来确定蛋白质浓度。
相比于上述几种方法，荧光定量法的线性范围更广，并且对于小样本量也能获得可靠结果。
五、质谱分析法质谱分析法是一种利用质谱技术对蛋白质进行定量分析的方法。
此方法通常结合先进的液相色谱技术与质谱仪器，通过将样品中的蛋白质分离和离子化，进而测量离子化蛋白质的质量-电荷比（m/z），最终得到蛋白质的浓度。
蛋白质各种定量方法的优缺点的比较
蛋白质各种定量方法的优缺点的比较令狐采学1．蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏（Kjeldahl）定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大1.2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是3 分子的脲经180℃左右加热，放出1分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。
测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg）优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近缺点：①灵敏度差；②三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
1.3 Folin-酚试剂法原理：Folin-酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
测定范围：20~250ug优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效缺点：①费时，要精确控制操作时间；②Folin -酚法试剂的配制比较繁琐,且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA和脲素均会干扰反应。
1.4 紫外吸收法原理：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比)。
此外，蛋白质溶液在280nm的吸光度值与肽键含量成正比，利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
蛋白表达不同检测方式的比较和分析(仅供参照)
蛋白表达不同检测方式的比较和分析免疫组化法(immunohistochemistry)原理：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
特点：是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。
样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。
蛋白免疫印迹( Western Blot)原理：蛋白质印迹法是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC 膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。
特点：先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。
ELISA检测原理：酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法，它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。
特点：用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。
免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。
Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。
几种测蛋白含量方法的比较
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定（一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。
其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。
定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。
蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。
其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。
定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。
1微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）1.1原理样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤1.3特点准确度较高，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％；操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h，试剂消耗量大。
，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含量；适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。
2 双缩脲比色法2.1原理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。
因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。
在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
5种常规的蛋白质测定方法的全方位的比较分析
5种常规的蛋白质测定方法的全方位的比较分析来源： 类别：技术文章 更新时间：2011-02-16 16:32:50 阅读 62次蛋白质的测定在饲料的品质确定中占很大的作用，蛋白质的测定方法有很多种，最为常见的使用方式有定氮法，双缩脲法（Biuret 法）、考马斯亮蓝法(Bradford 法)、Folin －酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法，蛋白质测定仪采用索氏定氮原理，通过用加碱、加酸等过程将物质中的氮元素转化为氨气，然后再用滴定的方法讲物质中氮的含量或者蛋白质的含量计算出来。
蛋白质测定仪采用微电脑全自动控制，有两种模式：手动模式和自动模式。
根据这两种模式又能将其分之为半自动定氮仪以及全自动定氮仪两种，在进行检测的过程中克服了定氮法的一些弊端，让定氮法进行进一步的发展。
下面就是以上4种测定方法中的优缺点比较：方法灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl 法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg 氮，误差为 ±2％费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret 法） 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟多肽键＋碱性Cu 2＋?紫色络合物 硫酸铵； Tris 缓冲液； 某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 50～100mg 快速5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm 处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶； 各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin －酚试剂法（Lowry 法） 灵敏度高 ≈5mg慢速40～60 分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr 和Phe 还原 硫酸铵；Tris 缓冲液； 甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时； 颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Br adford 法) 灵敏度最高 1～5mg快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax 由465nm 变为595nm 强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS 最好的方法；干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化蛋白质含量测定的方法一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法含氮有机物与浓硫酸共热,即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。
蛋白质定量方法对比
蛋白质定量方法对比全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白质是生物体内重要的有机分子，负责着细胞结构的建立和维持以及体内新陈代谢的进行。
因此，研究蛋白质的定量方法对于生命科学领域具有重要意义。
本文将比较几种常见的蛋白质定量方法，包括BCA法、Lowry法、Bradford法和Spectrophotometric method，分析它们各自的优缺点和适用场景。
首先，BCA法是一种基于铜蛋白络合物比色反应的蛋白质定量方法。
该方法具有高灵敏度和广泛线性范围，适用于多种类型的蛋白质样本。
然而，BCA法也存在一些缺点，包括受到干扰物质的影响、反应条件较为复杂等。
与BCA法相比，Lowry法是一种较为经典的蛋白质定量方法。
该方法利用费里酚蓝与蛋白质中的酚类物质在碱性条件下形成的复合物来定量蛋白质含量。
Lowry法具有较高的准确性和稳定性，但需要较长的反应时间和较大的标准曲线范围。
另一种常见的蛋白质定量方法是Bradford法，该方法利用共价结合蛋白质中的氨基酸残基与染料之间的相互作用来定量蛋白质。
与前两种方法相比，Bradford法具有操作简便、灵敏度高的特点，但对于具有不同氨基酸组成的蛋白质可能存在测定误差。
最后，Spectrophotometric method是一种利用紫外可见分光光度计进行蛋白质定量的方法。
通过测定蛋白质溶液在特定波长下的吸光度来计算蛋白质的浓度。
这种方法操作简单、速度快，但对于含有其他物质的样品可能存在测定误差。
综上所述，不同的蛋白质定量方法各有优劣，研究人员在选择适合的方法时应该根据具体需求和样品特性来进行选择。
在进行蛋白质定量时，应根据实验要求和条件选择最适合的方法，以确保结果的准确性和可靠性。
希望本文的比较能够帮助读者更好地理解各种蛋白质定量方法的特点和适用范围，提高实验的效率和准确性。
第二篇示例：蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，具有多种生理功能。
准确测定蛋白质的含量对于生物学研究和临床诊断具有重要意义。
蛋白表达鉴定
蛋白表达鉴定
蛋白表达鉴定是生物学研究中的重要环节，主要用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达水平。
常用的蛋白表达鉴定方法包括免疫组化法（IHC）、免疫印迹法（WB）以及质谱分析等。
1.免疫组化法（IHC）：这是一种在组织或细胞水平上检测蛋白表达的方法。
它利
用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而对组织细胞内的抗原（主要为蛋白质）进行定性、定位及相对定量研究。
2.免疫印迹法（WB）：又称蛋白质印迹，主要利用SDS-PAGE技术将蛋白质按
分子量的大小进行分离，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上，再利用特定的抗体进行检测。
这种方法可以确定蛋白质的分子量、组成和纯度。
3.质谱分析：质谱技术可用于蛋白质组学的定量研究，是实现蛋白表达水平检测
的重要手段。
除了以上方法，近年来兴起的CITE-seq技术也可以用于蛋白表达鉴定。
这种技术可以一次性获得单个细胞的mRNA和蛋白的表达量，从而提高了细胞亚群分类的精度，并有助于识别罕见的细胞亚群。
总的来说，蛋白表达鉴定是一个复杂而精细的过程，需要多种方法的结合使用，以确保结果的准确性和可靠性。
在实际研究中，应根据具体的实验需求和条件选择合适的方法进行蛋白表达鉴定。
两种测定蛋白质含量方法的比较ppt实用资料
操作方法
一、制作标准曲线 二、样品测定
三、计算 取两组测的平均值计算：
YxN 血清样品蛋白质含量（mg/100mL）=
V
其中,Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/mL），N为稀释倍数， V为血清样品所取的体积（mL），c为样品原浓度（mg/mL）。
注意事项
（1）须于显色后30min内比色测定。各管由显色到比色的 时间应尽可能一致。 （2）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混 合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液 再测定。 （3）由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显 色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只 适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外 蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋 白质含量的准确性。
其中,Y为标准曲线查得紫蛋白红质色得浓铜度（双mg缩/mL脲），复N为合稀物释倍分数，子V为结血构清样为品所：取的体积（mL），c为样品原浓度（mg/mL）。
紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 紫红色铜双缩脲复合物分子结构为： （1）须于显色后30min内比色测定。 紫红色铜双缩脲复合物分子结构为： 双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。 不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。 紫红色铜双缩脲复合物分子结构为： 取两组测定的平均值计算： 不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。
两种测定蛋白质含量方法的实验比较
目的要求
（1）学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。 （2）学习紫外吸收法测定蛋白质的原理和方法。 （3）比较两种测定蛋白质方法的优缺点。
蛋白检测方法
蛋白检测方法蛋白是生物体内非常重要的一类生物大分子，它们在细胞内发挥着结构、功能和调控等多种生物学作用。
因此，蛋白的检测方法对于生命科学研究和临床诊断具有重要意义。
在本文中，我们将介绍几种常见的蛋白检测方法，希望能够为相关研究人员提供一些参考和帮助。
一、免疫印迹（Western Blot）。
免疫印迹是一种常用的蛋白检测方法，它利用抗体与目标蛋白特异性结合的原理，通过电泳将蛋白分离并转移到膜上，再利用特异性抗体进行检测。
这种方法可以检测特定蛋白的表达水平，对于研究蛋白的功能和调控机制非常有帮助。
二、酶联免疫吸附实验（ELISA）。
ELISA是一种高度灵敏和特异的蛋白检测方法，它通过将待测蛋白与特异性抗体结合，再加入酶标记的二抗进行检测。
ELISA方法可以定量检测蛋白的表达水平，广泛应用于临床诊断和生物医学研究领域。
三、质谱分析（Mass Spectrometry）。
质谱分析是一种高通量的蛋白检测方法，它通过将待测蛋白分离并离子化，然后利用质谱仪进行检测和分析。
质谱分析可以确定蛋白的氨基酸序列、翻译后修饰和相互作用，对于研究蛋白的结构和功能具有重要意义。
四、蛋白芯片技术（Protein Microarray）。
蛋白芯片技术是一种高通量、高灵敏度的蛋白检测方法，它通过将大量的蛋白固定在芯片上，再与待测蛋白进行相互作用，最终利用荧光或放射性同位素进行检测。
蛋白芯片技术可以同时检测多种蛋白的表达水平和相互作用，对于蛋白组学研究具有重要意义。
五、蛋白免疫沉淀（Co-Immunoprecipitation）。
蛋白免疫沉淀是一种常用的蛋白相互作用检测方法，它通过将待测蛋白与其相互作用的蛋白一起沉淀下来，再利用免疫印迹或质谱分析进行检测。
这种方法可以帮助研究人员了解蛋白之间的相互作用关系，对于研究蛋白的功能和信号转导具有重要意义。
总结：蛋白检测方法的选择应根据研究的具体目的和样本特点来确定，不同的方法各有优缺点。
各种蛋白质测定方法比较
各种蛋白质测定方法比较蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。
没有蛋白质就没有生命。
蛋白质测定便是指通过物理或化学方法对蛋白质含量进行测定。
目前测定蛋白质的方法较多，此报告主要介绍凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法、考马斯亮蓝法。
凯氏定氮法（Kjeldahl determination）原理：蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
蛋白质含量=含氮量/16%。
优势：测定结果准确，重现性好。
缺点：操作复杂费时，试剂消耗量大。
应用范围：适用于0.2～1.0mg氮，误差为2%。
双缩脲法（Biuret method）原理：双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子发生双缩脲反应，形成紫色络合物。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
优势：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点：灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
应用范围：适用于1～20mg氮。
紫外吸收法（UV spectrography）原理：蛋白质分子中，络氨酸、苯丙氨酸、色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后，反应生成的颜色产物用紫外—可见分光光度计在280nm波长下测定吸光度。
将测得的值对蛋白浓度作图，得标准曲线。
未知样品做同样处理后，根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知样品的蛋白浓度。
优势：特异性、精密度好；呈色稳定性好，试剂单一，操作简便；不消耗样品，可以回收。
缺点：准确度差，干扰物质多。
应用范围：适用于50～100mg蛋白质。
蛋白质定量方法的比较与优缺点分析
蛋白质定量方法的比较与优缺点分析蛋白质定量是生物学研究中非常重要的一项技术。
通过定量分析蛋白质，可以揭示许多生物学问题和生物化学反应机理。
但是，不同的蛋白定量方法有各自的优缺点，因此，选择适合的蛋白质定量方法是非常重要的。
下面，我们将分别介绍蛋白质定量的几种常见方法，并比较它们的优缺点。
1. Bradford法Bradford法是一种常用的蛋白质定量方法。
它是通过将一种特殊的染色剂Bradford与蛋白质结合，然后利用比色法来定量蛋白的含量。
Bradford法使用简单，快速，且具有较高的灵敏度。
但是，这种方法对于蛋白质的种类和质量要求较高，因此，在使用Bradford法进行蛋白质定量之前，需要进行标准曲线的制备和检测。
同时，Bradford法不太适用于含有一些干扰物质的样品。
2. BCA法BCA法是通过还原剂将蛋白质上的铜离子还原成铜离子，并在还原过程中与一种染色剂Bicinchoninic Acid（BCA）发生反应，然后根据比色法进行测定蛋白质含量的一种常见方法。
BCA法有较高的灵敏度，适用于不同种类的蛋白质。
但是，这种方法对于蛋白质的样品有较高的要求，同时也需要进行标准曲线的制备和测定。
3. Lowry法Lowry法是一种蛋白质定量的经典方法。
这种方法首先将蛋白质与碱式铜离子形成蛋白质和铜络合物，然后使用Folin-Ciocalteu试剂进行比色法测定蛋白质含量。
Lowry法在测定种类和样品方面都非常广泛。
但是，这种方法操作步骤较多，比较繁琐，同时与其他方法比较，这种方法的灵敏度较低。
4. UV-Vis吸收光谱定量法UV-Vis吸收光谱定量法是通过测定蛋白质在波长280nm处的吸收光谱，从而进行蛋白质定量的一种方法。
这种方法具有灵敏度较高，且对蛋白质的种类没有特殊要求的特点。
但是，这种方法只适用于含有色氨酸或苯丙氨酸等芳香族氨基酸的蛋白质。
在比较以上几种方法的优缺点后，我们可以得出结论：选择适合的蛋白质定量方法需要我们综合考虑所测蛋白质的种类和质量，实验室设备，操作步骤等因素。
检测蛋白质表达的方法
检测蛋白质表达的方法随着生物技术的不断发展，蛋白质表达已经成为了生命科学研究中的重要环节。
为了研究蛋白质的结构、功能以及生物学意义，需要对蛋白质的表达进行检测。
本文将从蛋白质表达的基本概念、检测方法、技术优缺点、以及应用前景等方面进行探讨。
一、蛋白质表达的基本概念蛋白质是生命体中最基本的分子，它们担任着许多生物学过程中的重要角色。
蛋白质表达是指在生物体内或外，通过基因转录和翻译过程，将基因信息转化为蛋白质的过程。
蛋白质表达的过程分为三个阶段：转录、翻译和后转录修饰。
在转录过程中，DNA被转录成RNA，然后在翻译过程中，RNA被翻译成蛋白质。
在后转录修饰过程中，蛋白质被修饰成具有特定功能的成品蛋白质。
二、蛋白质表达的检测方法1. SDS-PAGESDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离和检测方法。
它利用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行簇合和解离，使蛋白质在电场作用下按照大小分离。
分离后的蛋白质可以通过染色或Western blotting等方法进行检测。
2. Western blottingWestern blotting是一种常用的蛋白质检测方法。
它利用SDS-PAGE将蛋白质分离，然后将蛋白质转移到膜上，再通过特定抗体与蛋白质结合，最后用化学发光或染色等方法进行检测。
3. ELISAELISA是一种高灵敏度、高特异性的蛋白质检测方法。
它利用特定的抗体与蛋白质结合，然后通过化学反应产生颜色或荧光信号进行检测。
ELISA适用于检测血清、尿液、唾液等生物体液中的蛋白质。
4. 质谱质谱是一种高灵敏度、高分辨率的蛋白质检测方法。
它利用质谱仪对蛋白质进行分析，可以得到蛋白质的分子量、氨基酸序列、修饰等信息。
质谱适用于检测复杂样品中的蛋白质。
三、蛋白质表达检测技术的优缺点1. SDS-PAGE优点：简单易行，适用于大多数蛋白质；缺点：不能确定蛋白质的氨基酸序列；2. Western blotting优点：高特异性，适用于低丰度蛋白质的检测；缺点：需要特定抗体，成本较高；3. ELISA优点：高灵敏度、高特异性，适用于生物体液中的蛋白质检测；缺点：需要特定抗体，成本较高；4. 质谱优点：高分辨率、高灵敏度，可以确定蛋白质的氨基酸序列和修饰信息；缺点：需要高分辨率质谱仪，成本较高。
蛋白表达量测定
蛋白表达量测定一、蛋白表达量测定是什么呢？蛋白表达量测定呀，就像是去数一个工厂里生产出来的某种小零件的数量一样。
只不过这个“工厂”是细胞啦，“小零件”就是蛋白质咯。
这可超级重要呢，就好比我们要知道一家面包店一天到底能做出多少个面包，这样才能安排好后续的售卖、配送等好多事情。
对于蛋白来说，知道表达量，就能知道这个蛋白在生物体内是不是在正常工作，有没有偷懒或者是过于勤奋，是不是和其他小伙伴（别的蛋白或者分子）配合得好。
二、有哪些方法可以测定蛋白表达量呢？1. Bradford法这就像是用一种特殊的染料去给蛋白染色，然后根据颜色的深浅来判断蛋白的多少。
蛋白越多呢，颜色就越深，就好像穿深色衣服的人看起来更胖（这里只是个俏皮的比喻啦）。
这个方法很简单，操作起来也比较容易，就像我们做个小手工一样，不需要特别复杂的仪器。
2. Western blot法这个方法就稍微复杂一点啦。
就像是把蛋白放在跑道上（凝胶电泳），让它们跑起来，根据跑的快慢把不同大小的蛋白分开。
然后再把它们转移到一个特殊的“纸”（膜）上，再用一种像小侦探（抗体）一样的东西去找到我们想要的蛋白，最后再用化学的方法让这个小侦探显形，这样我们就能知道我们要的蛋白有多少啦。
这种方法很准确，但是就像做一道复杂的数学题，需要耐心和细心。
3. 酶联免疫吸附测定（ELISA）这个方法呢，就像是给蛋白设了一个小陷阱，这个陷阱是专门针对我们想要测定的蛋白的。
蛋白掉进陷阱里就会被检测到，然后根据一些化学反应产生的颜色或者荧光等信号来判断蛋白的量。
这有点像钓鱼，不同的鱼（蛋白）有不同的鱼钩（抗体）来钓它们。
三、测定蛋白表达量的时候要注意些什么呢？首先呢，样本的处理很关键。
就像我们做饭，食材要是处理不好，做出来的菜肯定不好吃。
样本要是没有处理好，测出来的蛋白表达量可能就不准确。
比如说要保证样本的新鲜度，不能让蛋白在处理过程中就坏掉了或者发生了变化。
然后呢，选择合适的测定方法也很重要。
蛋白质检验方法
蛋白质检验方法
蛋白质是生物体内一类十分重要的有机物质，它们参与了生物体内的几乎所有生命活动。
因此，对蛋白质的检验方法显得尤为重要。
本文将介绍几种常见的蛋白质检验方法，以供参考。
首先，最常见的蛋白质检验方法之一是SDS-PAGE。
SDS-PAGE是一种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，通过电泳分离蛋白质，可以根据蛋白质的大小进行分析。
这种方法操作简单，结果准确，因此被广泛应用于蛋白质的检验和分析。
其次，免疫印迹法（Western blot）也是一种常用的蛋白质检验方法。
通过Western blot，可以检测特定蛋白质在混合蛋白质中的存在情况，并且可以定量分析目标蛋白质的表达水平。
这种方法对于研究特定蛋白质在细胞信号转导、疾病诊断等方面具有重要意义。
另外，酶联免疫吸附试验（ELISA）也是一种常见的蛋白质检验方法。
ELISA通过酶标记的抗体与待测蛋白质结合，再通过底物的反应产生可定量测定的色素来检测蛋白质的存在。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点，被广泛应用于医学诊断、生物
学研究等领域。
此外，质谱法也是一种重要的蛋白质检验方法。
通过质谱法，
可以对蛋白质的氨基酸序列、翻译后修饰等进行全面的分析。
质谱
法具有高分辨率、高灵敏度和高通量的特点，对于蛋白质的结构和
功能研究具有重要意义。
综上所述，蛋白质的检验方法多种多样，每种方法都有其特定
的应用领域和优势。
在实际应用中，可以根据实验的具体要求和条
件选择合适的蛋白质检验方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文所介绍的蛋白质检验方法对您有所帮助。
组织蛋白表达水平检测方法的比较分析
组织蛋白表达水平检测方法的比较分析鲍鹏;余斯琦;苏春玉;于东渤;朱长军;董智雄【摘要】为了得到一种能够准确、快速检测组织蛋白表达水平的方法,收集了12例结肠癌病人的癌组织及癌旁组织,以RRP15 mRNA的表达水平作为参照,比较免疫组织化学染色法和免疫荧光染色法在检测组织蛋白表达水平方面的优劣.免疫组织荧光染色结果显示,12例患者中有8例患者肿瘤组织的RRP15表达为阳性,4例为阴性,其结果与Real-time PCR定量结果高度一致.免疫组织化学染色结果显示,12例患者中有9例患者肿瘤组织的RRP15表达为阳性,其余3例为阴性,其中6号和11号免疫组织化学检测为阴性,而Real-time PCR定量和免疫组织荧光染色结果均为阳性,即免疫组化检测结果与Real-time PCR定量结果的一致性较差.因此认为,免疫荧光染色法是检测组织中蛋白表达水平的首选方法,免疫组织化学染色法可作为一种辅助方法.【期刊名称】《天津师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(039)001【总页数】5页(P46-50)【关键词】蛋白表达水平;检测;石蜡切片;免疫荧光染色;免疫组织化学染色【作者】鲍鹏;余斯琦;苏春玉;于东渤;朱长军;董智雄【作者单位】天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津300387;天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津300387;天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津300387;天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津300387;天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津300387;天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津300387;天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室,天津300387【正文语种】中文【中图分类】Q291生物体中，蛋白质是基因表达的产物，也是最终执行生物功能的分子.核仁是真核细胞内核糖体生物发生的场所，它通过控制核糖体的生物发生调控细胞的各项基本生命活动[1-5].有研究发现，大量与核仁和核糖体生物发生途径相关的蛋白在肿瘤中的表达水平升高，可用于肿瘤诊断、恶性程度判断及预后等.如核仁蛋白NOP14在胰腺癌肝转移灶中表达上调，可能通过促进肿瘤微血管形成导致胰腺癌的生长和转移[6-7]；核仁蛋白EBP2在肺癌细胞系中高表达，且它的过表达能促进肺癌细胞的增殖[8]；核仁蛋白PES1在乳腺癌组织中高表达，它与乳腺癌的发生和发展相关，可作为乳腺癌的生物标记物[9-11].常用于组织蛋白表达水平检测的方法有Western blot、酶联免疫吸附技术（ELISA）、免疫荧光染色、免疫组织化学染色等.Western blot可以检测样品中是否存在目的蛋白的抗原、在组织中的含量及其抗原多肽链的相对分子质量等，具有高效、简便、灵敏等特点，但在检测过程中经常会出现非特异性条带、膜本底差、显色不好等问题，从而影响实验结果.ELISA多用于定量分析，其灵敏度极高，可以定量检测蛋白，直接读出浓度，但如果抗体出现非特异性结合，则通过ELISA得到的数值可信度会降低，且该方法也无法检测目的蛋白与特定蛋白质的结合情况.免疫荧光染色和免疫组织化学染色中，目前常用的是冰冻切片免疫荧光染色、石蜡切片免疫组织化学染色和石蜡切片免疫荧光染色.冰冻切片免疫荧光染色最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，染色方法简单、快速、敏感，容易重复，结果容易判断，但冰冻组织块很小，难以长期保存，因此无法用于回顾性分析研究[1].石蜡切片的优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确.石蜡切片虽优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂的处理，组织内抗原活性失去较多.总之，组织蛋白表达的检测方法很多，各有利弊，目前还没有一个明确、统一的检测方法.本课题组通过检索和分析Oncomine肿瘤基因数据库发现，核仁蛋白RRP15与结肠癌的发生发展密切相关，其表达量在癌组织中上调了2.65倍.本研究制备了RRP15的特异性抗体，分别利用免疫组织化学染色和免疫荧光染色方法，检测该蛋白在组织中的表达水平.以RRP15 mRNA的表达水平为参照，比较不同染色方法的优劣性，从而为找到一种能够快速、准确定量检测组织蛋白表达水平的方法提供参考.1 材料与方法1.1 主要材料与仪器1.1.1 材料12例病例标本购置于武汉谷歌生物科技有限公司.1.1.2 仪器荧光共聚焦显微镜（Eclipse90i），日本Nikon公司；实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司.1.1.3 试剂特异性多克隆兔抗RRP15抗体，本实验室自制；辣根过氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔抗体，美国Immuno公司；Trizol试剂盒，美国Invitrogen公司；免疫组化试剂盒，丹港生物科技有限公司；Ultra SYBR Mixture，北京康为世纪生物科技有限公司.1.2 方法1.2.1 Real-time PCR检测RRP15 mRNA的表达使用Trizol试剂盒（操作参照说明书）提取肿瘤组织和正常组织的总RNA.取2μg总RNA进行反转录合成cDNA.PCR总反应体系为20 μL，包括oligo dT 1μL、dNTP 4 μL、5×buffer 4 μL、反转录酶1 μL，加高压水补足至20 μL，将上述样品混匀，利用PCR仪进行扩增.反应参数：25 ℃ 10 min；42 ℃ 1 h；95 ℃ 5 min；4℃保温.合成cDNA后进行PCR反应，检测RRP15 mRNA的表达水平，以β-actin为内参.PCR引物包括：RRP15 上游引物（5′-GGTAACTGGAGCCGTAG-3′）、下游引物（5′-GGACTTTAGCCATAGCAT-3′）；β-actin 上游引物（5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′）、β-actin下游引物（5′-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3′）.PCR总反应体系为20 μL，包括2×Ultra SYBR Mixture PCR缓冲液10 μL、10 μmol/L 的上、下游引物各1 μL、cDNA模板1.5 μL，超纯水补足至20 μL.反应条件：95℃预变性10 min；95℃反变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，共35个循环.溶解曲线分析：95℃15s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s.1.2.2 免疫组织荧光染色法石蜡切片免疫组织荧光染色步骤如下：（1）切片常规脱蜡至水；（2）将切片放入柠檬酸钠缓冲液中，微波炉低火加热15 min，用PBS 冲洗一次，5 min；（3）加入500 μL 封闭液，37 ℃孵育 20 min；（4）滴加稀释的一抗工作液兔抗RRP15，37℃孵育2 h，用PBS冲洗3次；（5）滴加500 μL第二抗体，37℃湿盒孵育 1 h，用PBS 冲洗 3次；（6）滴加500 μL 的 DAPI，37℃湿盒孵育5 min，用PBS洗3次，封片.1.2.3 免疫组织化学染色法石蜡切片免疫组织化学染色步骤如下：（1）切片常规脱蜡至水；（2）将切片放入柠檬酸钠缓冲液中，中火煮沸8 min，停火8 min，中低火煮7 min，用PBS洗一次；（3）将切片放入体积分数为3%的H2O2中，37℃避光孵育 25 min，PBS洗 3次；（4）加入500 μL 封闭液，37℃孵育10 min；（5）滴加稀释的一抗工作液兔抗RRP15，4℃过夜；（6）PBS洗 3次，滴加500 μL 兔抗生物素化二抗，37℃湿盒孵育10 min，PBS冲洗3次；（7）滴加500 μL HRP标记链亲和素，37℃湿盒孵育10 min，PBS冲洗 3次；（8）滴加400μL 新鲜配制的DAB显色液作用7 min，水洗10 min，苏木精复染1 min，用流水冲洗返蓝，分化30 s，流水冲洗5 min，伊红染色1 min，流水冲洗5 min，梯度乙醇脱水，浸入二甲苯，自然晾干后，中性树胶封片，在光学显微镜下观察.1.2.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，等级资料采用非参数秩和检验进行分析，P＜0.05时差异具有统计学意义.2 结果与分析2.1 Oncomine数据库分析RRP15蛋白在结肠癌中的表达利用Oncomine数据库分析RRP15蛋白在多种癌症中的表达情况，结果如图1所示.由图1可以看出，相对于正常结肠组织，RRP15蛋白在结肠癌组织中的表达显著升高，其表达量是正常组织中的2.65倍.图1 Oncomine数据显示RRP15在结肠癌中高表达Fig.1 High expression of RRP15 in colon cancer showed by oncomine data2.2 Real-time PCR检测RRP15在结肠癌中的表达从12例结肠癌病人的癌组织及相应的癌旁正常组织中选取RRP15为目的蛋白，利用Trizol法提取组织的总RNA，反转录后得到cDNA，进行Real-time PCR检测，定量结果如图2所示.由图2（a）可以看出，在 12例病人中，1号、2号、5～8号、10～12号病例的结肠癌组织中，RRP15 mRNA的水平明显高于癌旁组织，3号、4号、9号病例中的表达有不同程度的下调.由图2（b）可以看出，结肠癌组织中RRP15的表达量为癌旁组织的1.88倍.图2 RRP15 mRNA在结肠癌组织中的表达Fig.2 RRP15 mRNA expression in colon cancer tissues2.3 免疫荧光染色法检测RRP15在结肠癌中的表达制备12例结肠癌病人的癌组织及癌旁组织的石蜡切片，进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下以相同曝光时间进行图像采集，之后用Image Pro Plus统计其荧光强度，结果如图3所示.由图3（a）和图3（b）可以看出，在12例结肠癌病人中，1号、2号、6号、7号、8号、10号、11号、12号结肠癌组织中RRP15的荧光强度明显高于癌旁组织，3号、4号、5号、9号结肠癌组织中的荧光强度则弱于癌旁组织，这与Real-time PCR的结果基本一致.综合所有病例的结果可知，RRP15在结肠癌组织中的荧光强度是癌旁组织的1.29倍，如图3（c）所示.2.4 免疫组织化学染色法检测RRP15在结肠癌中的表达利用免疫组织化学染色法检测12例结肠癌病人的癌组织及癌旁组织中RRP15的表达，结果如图4所示.图3 免疫荧光染色检测RRP15在结肠癌中的表达Fig.3 Detection of RRP15 expression in colon cancer tissues using immunofluorescence stainingNote：The green fluorescence staining with RRP15 antibody， the blue fluorescence staining with DAPI.图4 免疫组织化学染色检测RRP15在结肠癌中的表达Fig.4 Detection of RRP15 expression in colon cancer tissues using immunohistochemical staining由图4可以看出，在12例患者中，1号、2号、3号、5号、6号、8号、9号、10号、12号为阳性，4号、7号、11号为阴性.该种检测方法中，3号、7号、9号、11号的检测结果均与Real-time PCR的检测结果不一致.3 讨论与结论为了寻找一种简便快捷、可靠的组织蛋白表达水平检测方法，本研究以结肠癌患者肿瘤组织和正常组织中RRP15 mRNA的表达水平作为参照，比较免疫荧光染色法和免疫组织化学染色在检测组织蛋白表达水平上的优劣.结果显示，石蜡切片免疫组织化学染色法和石蜡切片免疫荧光染色法都能对癌组织中蛋白的表达进行检测，但后者准确率更高，而且通过统计染色后的荧光强度，可将蛋白水平进行量化，更直观地反映出表达情况.在肿瘤的临床检测与治疗过程中，多种蛋白的表达水平与患者的疾病恶化程度判断、临床治疗手段的选择及预后等直接相关.如NGAL蛋白与免疫炎症反应相关，当炎症或肿瘤发生时组织内的NGAL迅速升高，被认定为评价因炎症或肿瘤形成而导致内皮损伤严重程度的重要标志物[12-13].Survivin蛋白在多种泌尿系肿瘤中有表达，其高表达往往预示患者预后不良以及较高的复发率[14].由此可见，这些与癌症发生发展、预后相关的蛋白在组织中精确的定量检测至关重要.免疫荧光染色法能够对组织中的目的蛋白进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜对荧光标记的组织标本进行共聚焦荧光定量分析，或者通过采集图像信息统计其荧光强度进行定量分析.而免疫组织化学染色法只能进行半定量的分析研究，而且其结果判断主观性较强，因此免疫组化法难以对某一蛋白进行精确的定量分析.除此之外，石蜡切片免疫荧光双重染色法既有冰冻切片免疫荧光染色抗原特异性高、敏感性强、能同时显示表达于同一部位的2种抗原的特点，又具有石蜡切片免疫组化染色组织细胞结构清晰、抗原定位准确的优点，这对于某些癌症中需要精确检测目的蛋白的表达水平具有重要临床意义.而免疫组化方法虽然具有特异性强、灵敏度高、方法简单易行、图像直观、结果便于评价等优点，但却有很大的局限，例如一次只能检测一个抗原、用多底物显色系统标记后结果不容易区分、特别是表达在相同位置的2个抗原容易出现重叠因此结果不好判断等.该方法也会受到分辨率的影响，在明场下，底物颜色和切片厚度都能影响到最终结果.另外，由于显色底物是酶促反应，很容易出现底物饱和的现象，因而限制了半定量分析[15].综上所述，免疫荧光染色检测法是检测组织中蛋白表达水平的首选方法，免疫组化染色可作为一种辅助方法.对于某些组织只需要检测目的蛋白表达的有无或者表达的高低可以选择方法更加简便快捷的免疫组化，但对于需要准确定量分析蛋白表达水平，或者探究蛋白表达水平与某种疾病之间的关系，免疫荧光染色是必不可少的检测手段.【相关文献】[1]BANCROFT J D，GAMBLE M.组织学技术的理论与实践[M].北京：北京大学医学出版社，2010.BANCROFT J D，GAMBLE M.Theory and Practice of HistologicalTechnology[M].Beijing：Peking University Medical Press，2010（in Chinese）.[2]ORSOLIC I，JURADA D，PULLEN N，et al.The relationship between the nucleolus and cancer：Current evidence and emerging paradigms[J].Seminars in Cancer Biology， 2016，37（38）： 36-50.[3]BOISVERT F M，VAN K S，NAVASCUÉS J，et al.The multifunctional nucleolus[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2007， 8（7）：574-585.[4]DE LA CRUZ J， KARBSTEIN K，WOOLFORD J L.Functions of ribosomal proteins in assembly of eukaryotic ribosomes in vivo[J].Annual Review of Biochemistry， 2015， 84：93-129.[5]NERURKAR P，ALTVATER M，GERHARDY S，et al.Eukaryotic ribosome assembly and nuclear export[J].International Review of Cell&Molecular Biology， 2015， 319：107-140.[6]ZHOU B，WU Q，CHEN G，et al.NOP14 promotes proliferation and metastasis of pancreatic cancer cells[J].Cancer Letters， 2012， 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蛋白质是否成功表达的验证方法
蛋白质是否成功表达的验证方法
验证蛋白质是否成功表达是分子生物学实验中必不可少的步骤，正确高效地验证蛋白质的表达是确保实验结果准确性的关键。
目前检测蛋白质是否表达成功的方法很多，有引物聚合酶链反应（PCR）、蛋白印迹法（PAGE），还有Western blotting、Real-time PCR等。
引物聚合酶链反应（PCR）是实验常用的一种方法，通过建立对应的引物，先对未表达的蛋白的原姙质进行标记，从而用荧光和电泳或者PCR进行检测，测量它们的表达水平，从而验证蛋白质是否表达成功。
另外，蛋白印迹法（PAGE）也是一种老牌的验证手段，将原始质粒经过消化后在将消化物处于凝胶电泳中来对目标蛋白的表达情况进行检测。
如果蛋白质表达成功，就会在想要测量的游离核苷酸或者某种表达产物位置发现目标蛋白斑点。
Western Blotting是用于识别活性和特异性状态下蛋白质复合物及它们之间关系的测定方法，通过把表达的蛋白质分离并用免疫抗体进行检测，有效验证蛋白质是否表达成功。
Real-time PCR是实时定量聚合酶链反应（PCR）的一种，能够定量检测RNA
的表达量，可以有效验证蛋白质的表达水平，从而评估蛋白质是否正确表达。
总之，引物聚合酶链反应、蛋白印迹法、Western Blotting以及Real-time PCR等等都是可以有效验证蛋白质是否表达成功的常用方案，根据实验的要求，可以有效选择合适的技术，确保蛋白质表达实验达到最好的效果。
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蛋白表达不同检测方式的比较和分析
免疫组化法(immunohistochemistry)
原理：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
特点：是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。
样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。
蛋白免疫印迹( Western Blot)
原理：蛋白质印迹法是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC 膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。
特点：先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。
ELISA检测
原理：酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法，它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。
特点：用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。
免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。
Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。
3种蛋白检测水平的比较
蛋白检测方式免疫组化法Western blot法ELISA试剂盒法相同点原理：抗体-抗原结合反应
不同点样品类
型
组织或细胞组织或细胞血清、血浆、尿液、
细胞或组织培养上
清液
分析方
式
定位、定性及定量的研究
(主要是定位，定位敏感性
远远高于Western blot
法)
可以用于定性和半定
量，定量较免疫组化
法准确
多用于定量分析，其
灵敏度非常高
观察结
果
免疫组化图（膜阳性、质
阳性和核阳性）
电泳图（着色的位置
和着色深度）
蛋白浓度
优点特异性强、敏感性高、定
位准确、形态与功能相结
合
分析容量大、敏感度
高、特异性强
灵敏、特异、简单、
快速、稳定、易于自
动化操作及节省实
验经费
应用范
围
⑴恶性肿瘤的诊断与鉴别
诊断；⑵确定转移性恶性
肿瘤的原发部位；⑶对某
类肿瘤进行进一步的病理
分型；⑷软组织肿瘤的治
疗一般需根据正确的组织
学分类，因其种类多、组
织形态相像，有时难以区
分其组织来源，应用多种
标志进行免疫组化研究对
软组织肿瘤的诊断是不可
缺少的；⑸发现微小转移
灶，有助于临床治疗方案
的确定，包括手术范围的
确定。
⑹为临床提供治疗
方案的选择。
是检测蛋白质特性、
表达与分布的一种最
常用的方法。
⑴组织抗原的定性定
量检测；⑵多肽分子
的质量测定；⑶病毒
的抗体（或抗原）检
测；⑷疾病早期诊断
是分泌性蛋白检测
首选方法之一。
⑴免疫酶染色各种
细胞内成份的定位；
⑵研究抗酶抗体的
合成；⑶显现微量的
免疫沉淀反应。
⑷定
量检测体液中抗原
或抗体成份。
【多种
病原微生物所引起
的传染病、寄生虫病
及非传染病等方面
的免疫诊断】
各组检测方法之间的差别及特点：
以下是western和ELISA的区别：
1. western blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较烦
2. ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。
3. WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到
4. ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响
5. WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测。
6. WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而ELISA无能为力。
7. WB所适用的一抗一般是线性位点的，ELISA线性或构象型抗体都可以使用。
从另一个意义上讲，WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定，而ELISA不行。
8. WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。
ELISA一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。
9. WB操作常见的非特异性条带，膜本底差，显色不好等缺点在ELISA上表现得要好得多。
《HMGB1、MMP-9和CEA在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义》
中英文实例分析：
一、免疫组化（免疫组化图——阳性表达率）
二、western blotting
三、ELISA。