核桃的分离提纯实验方案

核桃中蛋白质的分离提纯

核桃(Juglans regial L．)原产中亚，又叫胡桃、羌桃、万岁子等，系胡桃科核桃属植物。我国栽培的核桃品种约有40 余种，各地均有分布。核桃作为林业副产品，很有开发利用的价值。核桃营养丰富，是世界“四大”干果之一。据测定，每百克含蛋白质14.9 克，脂肪58.8 克，核桃中的脂肪71%为亚油酸，12%为亚麻酸，碳水化合物9.6 克，膳食纤维9.6 克，胡萝卜素30 微克，维生素E 43.21毫克，钾385 毫克，锰3.44 毫克，钙56 毫克，磷294 毫克，铁2.7 毫克，硒4.62 微克，锌2.17 毫克人。就营养成分比较来说，核桃营养价值是大豆的8.5 倍，花生的6 倍，鸡蛋的12 倍，牛奶的25 倍，（1 斤核桃仁相当于5 斤鸡蛋或9 斤牛奶的营养价值）肉类的10 倍。核桃仁在增进人体健康方面，是中药的重要辅料，有顺气补血，止咳化痰，润肺补肾，滋养皮肤等功能。据有关资料记载历史上有许多老寿星和素食家也是把食用核桃作为养生美颜的主要果品。近几年有些癌症患者，经常食用核桃，或核桃仁加工的副食品，明显有控制癌扩散的积极效能；现代医学又证明，经常食用核桃有降低血液中胆固醇和软化血管的作用。

核桃蛋白含量为14%～17%，其蛋白消化率可达87.2%。主要由4类蛋白质构成, 即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白, 分别占核桃蛋白总量6.81%、17.57% 、5.33% 和70.11% , 核桃蛋白中的醇溶蛋白有独特的氨基酸组成, 其中支链氨基酸和中性氨基酸含量较高, 是植物蛋白中少有的特色组成,据有极高的开发利用价值。核桃蛋白含有18种氨基酸, 其中包括8种必需氨基酸, 且精氨酸、谷氨酸、组氨酸、酪氨酸等含量相对较高, 接近联合国粮农组织( FAO)和世界卫生组织(WHO )规定的标准, 它是一种很好的植物蛋白。

但目前理想的核桃蛋白保健食品在市场上并不多见，可见核桃蛋白极具开发价值。而且核桃在日常的生活和工业生产上的应用也越来越广泛，面临的问题也是愈来愈明显了，现在，我国核桃油生产厂家已达数十家，大量的脱脂核桃渣被作为饲料和肥料或丢弃，废物排放污染环境，其附加值较低。因此对核桃蛋白的研究就显得十分必要。

一、实验材料和仪器

原料:新鲜市售核桃

设备：超临界流体萃取设备（如果有脱脂核桃饼粕可以减少超临界流体萃取的过程）、凯氏定氮烧瓶、消化炉、滴定设备、干燥箱、粉碎机、离心机、恒温水浴锅、烧杯、培养皿、超滤设备等；

试剂：70%乙醇溶液、0.5%氢氧化钠溶液，O．O5mol／L HC1标准溶液、0.15mol/L 氯化钠溶液、饱和硫酸铵溶液、硫酸溶液、氨水、固体氢氧化钠和五氧化二磷、0.02～0.05mol/L 磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液等

二、实验原理

1、核桃蛋白的分离纯化

（1）核桃蛋白质特性核桃蛋白的热稳定性较差, pH 值、温度、加热时间均对其有影响。核桃蛋白质溶出率随温度、pH 的变化而变化。核桃的等电点不是一个, 而是多个。核桃蛋白是一种表面活性剂, 它能提高乳状液稳定性, 在0% - 0.1%蛋白质范围内, 蛋白质乳化能力和乳化稳定性均随蛋白质浓度增加而大。当蛋白质浓度为0% - 0.1% 时, 乳化稳定性可显著提高。质量分数0.5% NaOH 溶液中蛋白质溶解度最高, 为48.36mg /L, 在体积分70% 乙醇溶解度最小, 为

3.92mg /L。不同热处理方式对核桃蛋白质主要功能特性有影响,干热处理比湿热处理有利。最适宜的处理条件是干热处理温度为130℃, 时间为25 m in, 对核桃蛋白质主要功能性质影响最小。核桃蛋白在pH 5左右溶解度最小, 而在偏离pH 5酸性或碱性条件下溶解度较高, 核桃蛋白等电点在pH 5左右; 核桃蛋白质变性温度为67.05℃, 远低于其他植物蛋白, 核桃蛋白质对热较敏感。

（2）核桃蛋白质组成：

清蛋白(albumin）又称白蛋白。能溶于水，是一类不被50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀的球状蛋白质。其分子量较低，溶于水，易结晶。在中性溶液中加热即沉淀或凝固。分子量67500道尔顿，有584个氨基酸残基，等电点4.9。

球蛋白(globulin)是一类不溶或微溶于水，可溶于稀盐溶液的单纯蛋白质，可以被半饱和中性硫酸铵（它的优点是温度系数小而溶解度大，25℃时饱和溶解度为4.1mol,即767g/l；0℃时饱满和溶解度为3.9mol,即676g/l。硫酸铵浓溶液的PH 常在4.5～5.5 之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH 值往往降至4.5 以下,当用其他PH 值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节）沉淀，球蛋白具有

免疫作用。

醇溶蛋白（prolamin(e)）是植物种子储存蛋白的组分之一，不溶于水，可溶于50%～90%乙醇。目前人们普遍的提取醇溶蛋白的方法都是采用乙醇、丙三醇、丁二醇等为溶剂。

谷蛋白(glutelin)是一组单纯蛋白质，是种子的贮存蛋白质，有富含谷氨酰胺的结构域。不溶于水、稀盐溶液和乙醇，但溶于稀酸和稀碱溶液。

本实验依据蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中的性质，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。采用的分离纯化的方法有盐析法、等电点沉淀法、凝胶层析法、超滤法等，每一种蛋白质的分离提纯都是几种方法的合用，具体操作依各种蛋白质的性质而定。

2、核桃蛋白的脱盐

用盐析法分离而得到的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须首先去除。常用的方法有透析法、凝胶过滤层析法等。凝胶过滤层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。凝胶有多种，葡聚糖凝胶（Sephadex）是常用的一种人工合成的凝胶，脱盐用sephadexG-25层析柱，它的骨架是α-1，6-糖苷键联接成的直链葡聚糖，由环氧氯丙烷作交联剂制成的多孔网状结构的多聚物。结果大分子物质（蛋白质）直径大，不能进入凝胶颗粒的网孔中，垂直向下移动，速度快。而小分子物质（无机盐）可扩散入凝胶颗粒网孔中，流经的路程长、速度慢，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出，蛋白质先流出，无机盐后流出，得到除去盐的蛋白质溶液

3、核桃蛋白的浓缩

谷蛋白在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，需要进行浓缩。可采用的方法有：