串联质谱技术的应用综述

《有机结构分析II》

串联质谱技术的应用

液相色谱-质谱法(LC/MS)将应用范围极广的分离方法与灵敏、专属、能提供相对分子质量和结构信息的质谱法结合起来, 因此已成为一种重要的现代分离分析技术。虽然与LC相连的单极质谱仪也能够提供相对分子质量的信息, 但不足之处在于基质对待测组分的干扰难以排除及待测组分的结构信息不能充分利用。液相色谱与串联质谱联用可在一级质谱MS条件下获得很强的待测组分的准分子离子峰, 几乎不产生碎片离子, 并可对准分子离子进行多级裂解, 进而获得丰富的化合物碎片信息, 可用来推断化合物结构, 确认目标化合物, 辨认重叠色谱峰以及在高背景或干扰物存在的情况下对目标化合物定量, 因而成为药物代谢过程和产物研究, 复杂组分中某一组分的鉴定和定量测定, 以及药用植物成分研究中更为强有力的工具。本文对液相色谱-串联质谱法(LC-MSn)的原理及其在药物代谢方面的应用作简要介绍。

1 串联质谱(MS/MS)基本原理

1.1 离子源

离子源的种类包括:电子轰击电离(EI)、化学电离(CI)、快原子轰击(FAB)、场电离(FI)和场解吸(FD)、大气压电离源(API)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)和电感耦合等离子体离子化(ICP)等。现在主要采用大气压离子化技术(API), 包括电喷雾离子化(ESI)、大气压化学离子化(APCI)和大气压光电离化(APPI)。API 是软电离技术, 通常只产生分子离子峰, 因此可直接测定混合物。其中,ESI应用十分广泛, 适用于极性、热不稳定、难气化的成分分离分析, 小到无机离子, 大到蛋白质、核酸。ESI-MS中可以容易地控制碎片的裂解程度。用串联质谱可以选择特定的离子, 通过碰撞诱导解离(CID)使其碎裂成碎片离子;另一种方法是通过改变锥孔(取样口)电压(源内CID)的方式, 无选择地将源内所有的离子击碎。

1.2 质量分析器及其特点

质量分析器是质谱计的核心, 不同类型的质量计其功能、应用范围、原理和实验方法均有所不同。磁质谱:分为单聚焦磁场分析器和双聚焦分析器。离子源中生成的离子通过扇形磁场和狭缝聚焦形成离子束。离子离开离子源后, 进入垂直于其前进方向的磁场。不同质荷比的离子在磁场的作用下, 前进方向产生不同的偏转, 从而使离子束发散。由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径, 通过改变磁场强度, 检测依次通过狭缝出口的离子, 从而实现离

子的空间分离, 形成质谱。高分辨的双聚焦质谱仪可以测定分子离子的精确质量数(误差在5 ppm以下), 可以确定元素组成。

四极杆分析器(简写为Q):因其由四根平行的棒状电极组成而得名。离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦, 一个直流固定电压(DC)和一个射频电压(RF)作用

在棒状电极上, 两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压, 特定质荷比的离子在轴向稳定运动, 其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将DC和RF

以固定的斜率变化, 可以实现质谱扫描功能。四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度。

离子阱分析器(TRAP):由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地, 环电极施加射频电压(RF),通过施加适当电压就可以形成一个势能阱(离子阱)。根据RF电压的大小, 离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子, 待离子累积到一定数量后, 升高环电极上的RF电压, 离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱, 被电子倍增监测

器检测。离子阱分析器现已可以分析质荷比高达数千的离子。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度, 而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多

级质谱(MSn)的功能。

飞行时间分析器(TOF):具有相同动能, 不同质量的离子, 因其飞行速度不

同而分离。如果固定离子飞行距离, 则不同质量离子的飞行时间不同, 质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。离子以离散包的形式引入质谱仪, 这样可以统一飞行的起点, 依次测量飞行时间。离子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生, 但只在某一特定的时间引入飞行管。TOF具有较大的质量分析范围和较高的质量分辨率, 尤其适合蛋白等生物大分子分析, 常用MALDI为离子源。其分辨率随着质荷比的增大而降低。

傅里叶变换-离子回旋共振分析器(FT-ICRMS):在一定强度磁场中, 离子做

圆周运动, 离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时, 离子稳定加速, 运动轨道半径越来越大, 动能也越来越大。当电场消失时, 沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。优点为分辨率很高, 质荷比可以精确到千分之一道尔顿, 但价格十分昂贵。液相色谱与串联质谱联用

的质量分析器中最常用的是四极杆分析器, 其次是离子阱分析器和飞行时间分析器。

1.3 串联质谱的方式

两个或更多的质谱连接在一起, 称为串联质谱。串联质谱根据连接方式的不同一般分为空间串联和时间串联。空间串联型又分磁扇型串联, 四极杆串联, 混合串联等。如果用B表示扇形磁场, E表示扇形电场, 那么串联质谱主要方式有:空间串联(如磁扇型串联方式:BEB, EBE, BEBE等;四极杆串联:Q-Q-Q;混合型串联:BE-Q、Q-TOF和EBE-TOF等)②时间串联:离子阱质谱仪和回旋共振质谱仪。另外, 还有Q-TRAP等。

1.4 串联质谱的工作

无论是哪种方式的串联, 都必须有碰撞活化室,从第一级MS分离出来的特定离子, 经过碰撞活化(碰撞气常用N2和Ar等)后, 再经过第二级MS进行质量分析, 以便取得更多的信息。最常见的串联质谱为三级四极杆串联质谱(QQQ)。第一级和第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2, 第二级四极杆分析器所起作用是将从MS1得到的各个峰进行轰击, 实现母离子碎裂后进入MS2再行分析。

1.5 串联质谱数据采集方式

串联质谱主要有4种数据采集方式:①子离子扫描:选择一定的母离子经CID 活化, MS2记录产生的子离子。该方式特别适合于软电离(如ESI,CI, FD, FAB)得到的分子离子进一步裂解以获得分子的结构信息。通常先收集母体药物的子离子谱,再获得代谢物的子离子谱, 根据生物转化/代谢的位点, 可以提供丰富的结构信息。合理化裂解的这些碎片离子通常可提示药物代谢物的可能结构。②母离子扫描:选择MS2 中的某一子离子, 测定MS1中的所有母离子。该方式能帮助追溯碎片离子的来源, 能对产生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速筛选。这种扫描功能在药物代谢中非常重要。③中性丢失扫描:MS1 和MS2 同时扫描, 但MS2与MS1 始终保持质量差(即中性丢失质量)Am, 最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中性碎片(Am)的离子。中性丢失谱最能反映化台物的特定官能团, 如有中性丢失18Da的意味着-H2O。中性丢失扫描广泛地用于测定II相代谢过程变化, 如葡萄糖醛酸苷(-176Da)和硫酸盐(-80Da), 同样可以测定谷胱苷肽(GSH)加合物(-129Da)。④多反应检测(MRM)或选择反应监测(SRM):由MS1选择