流式细胞术基本原理

（三）光收集系统
• 滤光片的组成
– 长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过； – 短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过； – 带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。
460 500 540 460 500 540 460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
数字信号
• 通道(channel)
一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍 增管，就有多少个通道： – 散射光通道: FSC通道和SSC通道； – 荧光通道 • 通道命名方式： – 以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。 – 以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、 APC通道等。 • For example：FACSCalibur有488nm和633nm两根激光器， 488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、 FL2(PE)、 FL3(PerCP)， 635能检测FL4(APC)，代表Calibur有6个通道，最多能同时 检测4个荧光，6种参数。
500-549nm，绿色荧光（Green）； 585-615nm，橙色荧光（Orange）； ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。
标记抗体的荧光素
荧光素分子 FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647 发射光波长 （nm） 520 575 675 660 670 767 519 665 中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
（三）电脉冲信号的面积A、高度H和宽度W
Width = Area/Height
Pulse Height
Volts
Pulse Area
0
Pulse Width
Time
Creation of a Voltage Pulse
Quantification of a Voltage Pulse
光信号
电信号
（三）阈值 Threshold
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰 信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较 小的死细胞。 • FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
5%
32%
默认阈值
升高阈值后
1.3.2 荧光信号
（一）荧光： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变
鞘液
鞘液
细胞流
激光照射点 流体动力学聚焦示意图
（一）流动室和液流驱动系统
• 流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。 流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。
进样孔
鞘液Sheath 荧光信号 激光束
流动室结构图：单细胞发生器
液流驱动系统
（二）进样速率控制
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的 细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
• 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
粘连 细胞 死细胞
死细胞 或碎片
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
Gallios 三激光十色，分 析型
CyAn三激光九色，分析型
MoFlo XDP 高端分选型
1.2 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统
• 光学系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
• 细胞分选系统
– 喷嘴 – 电偏转板 – 样本收集器
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； – 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流 式细胞仪一般只用于分选。
BD公司分析型流式细胞仪
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
10 psi 10.2 psi
10 psi
10.8 psi
• 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。 • 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
1.2.2 光学系统
（一）激发光源 ：激光器
• 气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)； • 染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激 光器，发出550-650nm可变波长激发光； • 半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器。
流式细胞术
---原理、操作及应用
生物化学与分子细胞生物学系 流式实验室 地址：西7楼107室 电话：63846590-776423
教学参考书
• 实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4
• 临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。 2005.8 • 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出 版社。2008.2 • 实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学 出版社。2010.9 • 流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10
– 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 – 现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、 633nm和355nm、405nmUV；
（ 二 ） 光 束 成 行 系 统
细Leabharlann Baidu流动方向
FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样 本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。
核酸荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响； PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 • 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱 基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 • DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链 上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想 的DNA定量染料。 • Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。 • PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 • AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
FACS Verse双激光六色，三 激光八色
BD公司分选型流式细胞仪
FACSVantage SE
FACSAria III
Influx
Beckman Coulter流式细胞仪
Epics XL 单激光四色，市场 覆盖率高，分析型
FC 500 单激光或双激光五色， 市场覆盖率高，分析型
PMT
前向散射光 光电二极管
（二）电信号两种放大方式
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析 处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin) 对数(logarithmic; log)
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号 变异范围较大，多使用对数放大。
• 前置放大电路
将信号等比例放大，输出电脉冲信号。
• 模数转换器
将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。
• 数据处理系统
计算机系统数据采集、分析。
（一）光电检测器(photodetector)
• 光电二极管(photodiode) 光灵敏度低，测定强信号（FSC）； • 光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。
1.3.1 散射光信号
（一）前向散射光FSC
FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内， 亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。
（二）侧向散射光SSC
• SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散 射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
（三）散射光的作用
1979年 国家科委重点项目：
研制国内第一台激光流式细胞仪
1982年 国内第一台三参数激光流式细胞
1984年 国家科委组织科研成果的鉴定验
1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖；
1985年--1990年 灵敏度、信噪比、更多
流式分选仪研制开发； 计算机四参数软件；
样品制备、医学生物学
流式细胞仪的分类
1.3 流式细胞术光信号检测
光信号的类型 • 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
• 荧光信号
– 自发荧光 ：微弱 – 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
激发波长 Excitation wavelength
＜
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
（二）常用荧光素
<499nm 蓝色荧光（Blue）； 550-584nm，黄色荧光（Yellow）； 616-700nm，红色荧光（Red）；
激发光波长 （nm） 490 488 490 650 496/546 496/546 495 650
Long pass
Short pass
Band pass
• 透射光路
FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统
• 全反射光路
PerCP-Cy5.5 PE
SSC
FITC PE-TexasRed
PE-Cy7
FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统
1.2.3 电子系统
• 光电检测器
将光信号转换成电子信号。
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术的特点
• • • • • • 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– – – – – 流式细胞术简介 流式细胞仪的结构组成 流式细胞仪的光信号检测 流式细胞术数据的存贮、显示与分析 流式分选
• 二、流式细胞术操作与技巧 • 三、流式细胞术在生物医学中的应用
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
1.2.1 液流系统
• 鞘流技术：根据层流原理发 展起来的技术，可以实现两 种液体的同轴流动，样本细 胞流位于轴心稳定流动，外 面包裹有鞘液(sheath)。 • 流体动力学聚焦：稳定的液 流从截面积较大的部分流入 截面积较小的部分后，有一 个聚焦收缩作用，细胞流直 径被约束在10-20um，避免 了多个细胞重叠进入检测区。
• 流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准； • WB ：群体分析，得到多个细胞的平均值。
流式细胞仪的发展及商品化
• 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； • 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； • 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； • 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； • 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； • 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； • 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； • 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。