流式细胞术基本原理
荧光流式细胞术原理
荧光流式细胞术原理
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种先进的细胞分析技术，其工作原理可以概括为以下几个步骤：
首先，待测细胞需要经过染色处理，使其表面或内部特定的化学成分可以被荧光标记。
这些标记的细胞随后被制成单细胞悬液。
接下来，这些细胞悬液被送入流式细胞仪的流动室。
流动室中有一个液流驱动系统，它将细胞悬液以一定速度推动，使细胞单行排列，依次通过检测区域。
在检测区域，细胞会经过一束激光的照射。
激光激发荧光素，使得标记的细胞发出荧光。
这些荧光信号和细胞散射光会被不同的探测器接收。
其中，前向光电二极管检测细胞散射光，这种信号通常用来反映细胞的大小；而90度方向的光电倍增管（PMT）则接收荧光信号，这些信号代表了细胞表面抗原的强度或核内物质的浓度。
接收到的电信号经过光电转换器转换为电信号，再通过模数转换器转换为数字信号，由计算机进行采集和处理。
计算机对采集到的信号进行分析，将分析结果显示在屏幕上，也可以打印出来或以数据文件的形式存储，便于后续查询和分析。
此外，流式细胞仪还具有细胞分选功能。
通过在流动室喷口处安装超高频的压电晶体，可以产生液滴，使得待测细胞分散在这些液滴中。
液滴带有正负不同的电荷，当它们流经带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，最终落入各自的收集容器中，从而实现细胞的分离。
总的来说，流式细胞术通过高速、多参数的细胞分析，能够对细胞进行定量分析和分选，广泛应用于免疫学、血液学、细胞生物学等多个领域。
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术是一种广泛使用的细胞分析技术，可以用于分离、鉴定和计数单个细胞，同时可以对细胞的形态、大小、表面分子、细胞器和细胞活性等方面进行分析。
这项技术已经成为生物医学研究和临床诊断的重要工具之一。
流式细胞术的基本原理是将细胞悬浮液通过一根细长的玻璃管，使细胞单个地通过一束激光束，利用光学和电子学技术分析细胞的特性。
这个过程可以分为样本制备、细胞计数和细胞分析三个步骤。
样本制备在进行流式细胞术之前，需要对样品进行一系列的处理，以便得到单个、均匀分布的细胞悬浮液。
样品处理的方法包括细胞分离、细胞培养和细胞染色等。
通常使用的染色剂有荧光素、荧光素同工异构体、荧光素酯和荧光素类核酸探针等。
这些染色剂能够与细胞特定的分子结合，从而标记细胞并使其在流式细胞术中被检测到。
细胞计数细胞计数是流式细胞术的重要步骤之一。
在流式细胞术中，使用一种称为细胞计数器的设备，可以精确地计算细胞的数量。
细胞计数器通常由一个光源、一个流式细胞术仪和一个计算机组成。
在进行细胞计数时，将细胞悬浮液置于流式细胞术仪中，通过一束激光束照射细胞，从而产生荧光信号。
计算机会根据荧光信号的数量和强度来确定细胞的数量。
细胞分析在细胞计数后，可以对细胞进行分析。
流式细胞术中常用的分析方法包括细胞分类、细胞分选和细胞表面分析等。
细胞分类是将细胞根据其形态、大小和荧光特性分为不同的亚群。
细胞分选是将目标细胞从混合的细胞群中分离出来。
细胞表面分析是通过标记细胞表面分子，然后利用流式细胞术检测这些标记物，以确定细胞的特殊表面分子。
总结流式细胞术作为一种高效的细胞分析技术，已经广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
其基本原理是利用激光束对单个细胞进行分析，以确定细胞的特殊特性。
在进行流式细胞术前需要进行样品制备和细胞计数，然后可以对细胞进行分类、分选和表面分析等分析方法。
流式细胞术的应用范围广泛，可以用于癌症诊断、药物筛选和免疫学研究等领域。
流式细胞术之基本原理及运用
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1.3 流式细胞术光信号检测
光信号的类型 • 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
• 荧光信号
– 自发荧光 ：微弱 – 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
FITC、Alexa Fluor 488 PE PI PE-Cy5、PerCP APC、AF647
FL3
FL4 640 FL10
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同； • 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
流式细胞仪的发展及商品化
• • • • • • • • 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
• 光路系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术是通过一种名为流式细胞仪的仪器完成的，它能够以非常
高的精确度进行分析和检测。
流式细胞仪通过一根轴，从这个轴上有三根
弹性管，细胞进行注射，从而使细胞在管中行进，细胞同时也受到外界信
号的影响，这种信号可以来自磁场、电场或光场。
当细胞运行到仪器的另
一端时，它们会被照亮，通过一台摄像机可以拍摄到高清晰度的照片，然
后在计算机上进行分析处理。
流式细胞术广泛应用于早筛检、医学诊断、药物发现、药理学实验和
抗生素耐药性研究等方面，它能够更加精确、快速地进行细胞分析。
此外，流式细胞术也可以用于分析抗原抗体，免疫细胞介导的反应，以及细胞因
子如细胞因子和表面受体等的表达情况。
这种技术还可以用来监测血液中细胞水平的变化，如血小板、红细胞、白细胞等。
流式细胞术基本原理_
流式细胞术基本原理_流式细胞术（flow cytometry）是一种通过激光照射、细胞荧光标记和单个细胞分析的技术，用于研究和识别细胞的性质和功能。
它可以分析多种类型的细胞，包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。
流式细胞术具有高通量、快速并且可以同时分析多个参数等优势，因此被广泛应用于生物学研究、临床诊断和治疗等领域。
1.激光照射：流式细胞仪使用一束高能激光照射通过细胞悬液。
通常使用的激光有紫外线、蓝色、绿色和红色等多种波长。
激光束通过透镜系统聚焦，使细胞悬液中的细胞逐个经过照射点。
2.细胞荧光标记：在流式细胞仪实验前，细胞需要进行荧光染色，以便能够准确地测量和分析不同细胞参数。
荧光标记通常是通过将细胞与特定的标记分子（包括化学荧光染料、抗体或融合蛋白等）结合。
这些标记物可以与细胞的特定结构（如表面抗原、内源性蛋白等）相互作用，从而使细胞在流式细胞仪中发出荧光。
3. 光散射和荧光检测：经过激光照射后，细胞会散射光线。
光散射可以分为两种类型：前向散射（forward scatter，FSC）和侧向散射（side scatter，SSC）。
FSC反映细胞的大小，而SSC反映细胞的复杂性和内部结构。
同时，通过引入适当的滤光片和光学分束器，可以同时检测细胞所发出的荧光信号。
流式细胞仪通常具有多个荧光探测器，可以同时检测多个荧光染料。
4.数据分析：通过流式细胞仪获得的数据是复杂的多维数据，需要进行后续的数据分析和解释。
常见的数据分析方法包括数据精炼、数据规范化、聚类分析、细胞子群分析等。
可以通过计算机软件对数据进行处理和可视化，以获得有关细胞种群组成和特征的更深入的理解。
流式细胞术在许多研究领域和临床应用中发挥着重要作用。
例如，通过流式细胞术可以定量检测一些细胞亚群的数量和频率，用于检测和监测疾病的发生和发展，如肿瘤、免疫性疾病等。
此外，流式细胞术还可以用于筛选新药的有效性和安全性评估，以及研究细胞信号转导、基因表达和细胞分化等生物学过程。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
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▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
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2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞术工作原理
流式细胞术工作原理流式细胞术又称为流式细胞分析（FACS），是一种用于快速测定和分析细胞及其组分的工具和技术。
它通过对单个细胞的多重参数进行单细胞测量和分析，可对不同种类和状态的细胞进行区分和识别，从而为细胞学、免疫学、实验室诊断和药物研发等领域提供了重要的实验手段和数据支持。
流式细胞术工作原理基于一定的光学原理和电子信号转换技术，其主要步骤包括样本准备、流式细胞仪检测和数据分析等三个部分。
下面将详细介绍各个部分的工作原理：1. 样本准备样本准备是流式细胞术的第一步，它主要是为了将待测细胞或细胞组分转化成能够被流式细胞仪检测和分析的样品，其中包括以下几个步骤：（1）细胞收集：这是流式细胞术的前提条件，它要求待测细胞必须单个存在，不能形成团块或粘连。
通常采用利用酶或化学试剂将细胞从组织、器官、培养基或体液中分离出来进行收集。
其中细胞来源各不相同，可以是血液、骨髓、组织癌变、分离免疫细胞等等。
细胞处理在流式细胞学中是个棘手的问题。
该过程既需要最大程度地维持细胞的原始形态和性质，又不影响流式细胞仪对细胞的检测和分析。
样本处理的方式包括细胞染色、标记、吸释样本预处理等方法，处理条件严格，样品要求高纯度，无污染。
细胞染色是为了能够让细胞在仪器中产生不同的光谱信号。
染色剂的种类有非常多，它们包括活细胞染色剂、细胞膜染色剂、DNA染色剂、标记抗体等。
一般情况下，染色前细胞都要进行适当的处理，如调节pH值、添加细胞破解液等，扩大染色剂与待测细胞的作用。
2. 流式细胞仪检测流式细胞仪是用于测量和分析单个细胞的主要工具和设备，它是由激光器、光学器件、检测单元和计算机组成的。
在具体工作中，样品通过采用压力推动等技术被强制通过一个光学器件中的微细通道，流式细胞仪则通过这个微细通道对其进行检测和分析。
具体步骤如下：（1）激光器发出激光：激光是流式细胞仪最核心的光源，它可以发射可见光、激光、紫外线等光谱范围内的单色光束。
光线经过反射器作用，形成光束。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。
操作步骤包括细胞表面标记的检测和细胞内细胞因子的检测。
流式细胞技术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。
流式细胞仪由液流系统、光学系统和电子系统三部分形成。
流式细胞技术基本原则：1.并使各种液体和漂浮细胞样本新鲜，尽快顺利完成样本制取和检测；2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或edta处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态；3.对新鲜实体瘤非政府可以采用或单胺酶消化法，机械收编法和化学集中法去赢得足够多数量的单细胞悬液；4.对石蜡上皮组织非政府应先切开若干40-50um薄的蜡片，经二甲苯重熔至水后，再用前述方法制取单细胞悬液；5.单细胞悬液的细胞数不该多于个。
流式细胞的具体实验步骤基本是细胞表面标记的检测和细胞内细胞因子的检测两部分。
一、细胞表面标记的检测1.试剂平衡至室温。
准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）；2.写编号纸并编号；3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血，震荡，室温避光20分钟。
加血前摇匀血样；4.加入溶血素1ml，震荡后室温避光10分钟；5.离心，转， 5分钟。
弃上清，震荡；6.加入pbs洗液2ml，震荡，离心，转， 5分钟。
弃上清，震荡；7.加入pbs l。
上机前4度保存；8.上机。
二、细胞内细胞因子的检测1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）；2.写下编号纸并编号；3.取出pma（1∶），bfa（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠pbs稀释储存液；4.提振：挑全血或pbmcs（细胞数在0.5-1 ）50l/管，再重新加入50l rpmi展开吸收一倍，重新加入刺激剂pma，离子霉素和bfa，搅匀。
流式细胞术基本原理(完整)PPT参考幻灯片
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
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4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢适用于高速分选和 多色分析
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术（FACS）是一种广泛应用于生命科学领域的高通量细胞分析和分选技术。
其基本原理和实用技术如下：
一、样品准备
在进行FACS之前，需要将细胞悬浮液或组织细胞碎片通过过滤器过滤，以得到单个细胞的悬浮液。
随后将悬浮液加入到含有一定细胞标记物的荧光染料中，使得细胞表面有区分不同群体的标记，例如细胞表面抗原。
荧光染料可以是分子量小的化合物、抗体标记分子、蛋白质标记分子等。
二、设备设置
FACS设备由荧光激发器、荧光检测器、样品流动池和高压流速控制系统等部件组成。
通过设置荧光染料所需要的激发波长和收集的荧光波长，将荧光激发器和荧光检测器调整至适当的位置。
对于每个荧光染料，需要设定收集的波长范围和门控系统。
三、样品检测
将样品导入样品流动池，以产生细胞流动并通过荧光激发器。
在每一个单独的荧光染料发射峰之前，设立门道，用于筛选荧光信号并选择相应的背景噪音水平。
样品流过荧光激发器时，所产生的荧光信号将被荧光检测器收集。
四、数据分析
利用计算机软件处理和分析获得的荧光信号数据，得到针对不同细胞类型、各种特征和功能的排序和分析。
通过流式细胞仪可以实现单个细胞的荧光测量和分类，将这些数据转化为数值和图像，并对细胞进行进一步的单个细胞功能、结构和组成分析等。
综上所述，流式细胞术已成为现代细胞学、免疫学、生物学等领域中的一种必不可少的技术。
其基本原理和实用技术结合起来，可以让科研工作者更深入地了解细胞的结构、功能、组成以及色素、蛋白
质等分子的表达规律，全面、准确地分析和研究生命体系，推进科学研究和医学进步。
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术（Flow cytometry）是一种被广泛用于生物学和医学领域的细胞分析和排序技术。
该技术采用激光离子流和散射光学的原理，快速测定单个细胞的生物学和物理特性。
该技术不仅可以进行细胞计数、大小、形态特征、表面结构、细胞周期、代谢活性、细胞分化和生长状态等分析，还可以进行单细胞分选和纯化以及细胞染色体分析等研究。
基本原理流式细胞术的原理是通过射流将单个细胞迅速送入激光束中，该激光束激发细胞中的荧光染料和标记物或散射光学特性，进而检测细胞的光学信号，并进行信号转换和数字化处理，最终得到单个细胞的特异性指标。
流式细胞术的主要组成部分包括样品处理系统、流式细胞分析系统和数据分析系统。
样品处理系统：将细胞样品经过预处理、染色或标记，使其适用于流式细胞分析。
常用的样品预处理方法包括：细胞分离、染色、去除细胞碎片和去除红细胞等。
对于需要分选的细胞，还需要使用细胞排序技术分离目标细胞。
流式细胞分析系统：该系统包括激光、光电倍增管、光学透镜、光学滤波器、样品输送系统和电子系统等。
通过激光激发样品中的荧光染料或标记物，分析细胞的光学特性。
常用的荧光染料包括：FITC、PE、APC、PerCP、Cy5等。
常用的标记物包括：抗体、细胞因子、小分子荧光探针、DNA荧光探针等。
通过修改流式细胞分析仪的配置，可实现不同荧光染料和标记物的测定。
数据分析系统：流式细胞仪测定数据的处理和分析是采用计算机系统完成的。
数据分析的常用指标包括：细胞计数、细胞孔径（大小）、荧光强度（比例和强度）、散射特性等。
一般情况下，在细胞的某个特定荧光标记物上测定的强度与其他群体相比，该指标被用来区分并描述细胞。
流式细胞术的应用流式细胞术被广泛应用于生物医学研究和诊断中。
以下是一些常见的应用领域：1. 分析细胞表面和胞内蛋白表达：通过荧光共轭的抗体和标记物来测定单个细胞膜和胞内蛋白的表达量和分布，从而确定细胞分化状态和生理状态。
流式细胞术的工作原理及其临床应用
流式细胞术的工作原理及其临床应用一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测和分析单个细胞的技术，广泛应用于生物学、医学和生物技术等众多领域。
本文将对流式细胞术的工作原理进行详细介绍，并探讨其在临床诊断和治疗中的广泛应用。
我们将概述流式细胞术的基本原理和技术特点，包括细胞染色、荧光信号检测和数据分析等方面。
然后，我们将深入探讨流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学等领域中的临床应用，以及其在疾病诊断、预后评估、疗效监测等方面的重要作用。
我们将对流式细胞术的未来发展趋势进行展望，以期为读者提供全面而深入的了解。
二、流式细胞术的工作原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速定量分析和分选细胞的技术。
其工作原理主要基于流式细胞仪的精确设计和操作。
待检测的细胞经过预处理，如荧光标记、固定和破膜等，使其带有可检测的荧光染料或抗体。
这些细胞随后被导入到流式细胞仪中，通过喷嘴形成单细胞悬液，并以一定的流速通过检测区域。
在检测区域，细胞经过激光束的照射，激发出荧光信号。
这些信号被光电倍增管等光电转换器接收，并转化为电信号。
电信号经过放大、数字化处理后，由计算机系统进行记录和分析。
流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、内部结构、DNA 含量、蛋白质表达等。
这些参数的分析主要基于荧光信号的强度和波长，以及细胞的电学特性，如电阻抗。
流式细胞术还可以结合分选技术，将特定类型的细胞从混合细胞群体中分离出来。
这主要通过在流式细胞仪的出口处设置电磁场或静电场，对带有特定荧光信号的细胞进行偏转，从而实现细胞的分选。
流式细胞术的工作原理是将单个细胞在液流中快速通过激光束，通过检测和分析荧光信号，实现细胞的定量和定性分析，以及细胞的分选。
这种技术具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，广泛应用于生物医学研究的各个领域。
三、流式细胞术的临床应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）作为一种高度灵敏且多功能的细胞分析技术，在临床医学领域的应用日益广泛。
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
Counts
Event #
FL1 FITC
1
10
2 700
3 720
4
15
……
0…………10…………100…………1000 FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
FL-2(-)
FITC 单标
PE 单标
FL-2(PE)
FL2 - %FL1 FL-1(FITC)
FL1 - %FL2 FL-1(ion
FL-1(FITC)
After Compensation
FL-1(FITC)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
临床流式细胞术在免疫学中的应用
临床流式细胞术在免疫学中的应用免疫学作为一门研究机体免疫系统的学科，在医学领域中具有重要的地位。
而临床流式细胞术作为一种用于分析和鉴定细胞的工具，已经广泛应用于免疫学研究中。
本文将重点探讨临床流式细胞术在免疫学中的应用。
一、流式细胞术的基本原理流式细胞术是一种基于流式细胞仪的细胞分析方法，利用荧光标记的抗体与细胞表面和胞内分子相互作用，通过光散射和荧光信号来鉴定和分析细胞。
它广泛应用于免疫表型分析、免疫功能检测、细胞分选和细胞生物学研究中。
二、流式细胞术在免疫表型分析中的应用免疫表型分析是通过检测细胞表面和胞内标志物的表达水平来研究细胞类型和状态的方法。
流式细胞术通过标记不同的抗体来检测细胞表面和内部蛋白的表达，进而可以快速、准确地确定细胞的免疫表型。
三、流式细胞术在免疫功能检测中的应用免疫功能检测是通过评估细胞的功能状态来研究免疫系统功能。
流式细胞术可以通过检测细胞的分泌物、细胞因子的表达和细胞内信号通路活性等指标，来评估细胞的功能状态，从而帮助医生诊断疾病和制定治疗方案。
四、流式细胞术在细胞分选中的应用细胞分选是将混合细胞群中的特定亚群细胞分离出来的方法。
流式细胞术通过标记特定蛋白或标志物的抗体，结合流式细胞仪和细胞排序设备，可以实现快速、高效地分离出目标细胞，用于进一步的实验研究。
五、流式细胞术在细胞免疫学研究中的应用细胞免疫学研究主要研究细胞的免疫应答和免疫调节机制。
流式细胞术可以用于研究细胞的增殖、凋亡、细胞周期和细胞死亡等生物学过程，帮助深入了解免疫系统的功能和调控机制。
六、流式细胞术的发展和应用前景随着科技的不断进步，流式细胞术在免疫学中的应用也在不断扩展。
高维度流式分析、多参数细胞分选和新一代流式仪器的发展，有望为免疫学研究提供更为精细和全面的数据，加速疾病的诊断和治疗进展。
总结：临床流式细胞术作为一种流行于免疫学中的细胞分析方法，广泛应用于免疫表型分析、免疫功能检测、细胞分选和细胞免疫学研究中。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术（flow cytometry）是一种常用的细胞分析和分选技术，通过对悬浮细胞进行连续的、高通量的单细胞多参数分析，能够准确地获得细胞的多种信息，如大小、形态、表面标记物、蛋白质表达水平、细胞周期等。
流式细胞术的原理基于光学系统和流式细胞仪的相互配合。
其基本原理如下：1. 细胞样品制备：将待分析的细胞样品进行预处理，如去除细胞碎片、异物、血细胞混杂等，使其成为适合流式细胞仪分析的单细胞悬浮液。
2. 光源和染料：流式仪器利用一束单色、高能、激光光源对悬浮细胞进行照射。
细胞内染料的选择取决于研究目的，如荧光染料可用于标记特定蛋白质、细胞器或细胞表面受体。
3. 光学系统：经过光源照射后，激光光线经过特定的滤光片进行滤波，以选择特定波长的荧光信号。
光线通过一个透镜经过流式细胞仪的进样通道瞬间击中正在流动的细胞。
击中细胞的激光光线会被散射，产生前向散射光和侧散射光。
4. 散射光检测：前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）是流式细胞仪最基本的检测参数。
FSC反映细胞的大小和形态，SSC则反映细胞的复杂度和内部结构。
5. 荧光信号检测：流式细胞仪在经过细胞后会收集产生的荧光信号。
通过特定的荧光滤光片，选择出目标染料所发射的波长范围，并通过光电倍增管转化为电信号。
这些电信号被记录下来，并转化为数据。
6. 数据分析：流式细胞术生成的数据会在计算机中进行分析和解读。
通常会用分析软件对荧光信号进行解析，进一步分析细胞表型、蛋白质表达、细胞周期等信息。
通过上述原理，流式细胞术能够快速准确地进行细胞的高通量分析和分选，为生物学、医学等领域的研究提供了重要工具。
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---原理、操作及应用
生物化学与分子细胞生物学系 流式实验室 地址：西7楼107室 电话：63846590-776423
教学参考书
• 实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4
• 临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。 2005.8 • 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出 版社。2008.2 • 实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学 出版社。2010.9 • 流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10
Long pass
Short pass
Band pass
• 透射光路
FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统
• 全反射光路
PerCP-Cy5.5 PE
SSC
FITC PE-TexasRed
PE-Cy7
FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统
1.2.3 电子系统
• 光电检测器
将光信号转换成电子信号。
– 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 – 现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、 633nm和355nm、405nmUV；
（ 二 ） 光 束 成 行 系 统
细胞流动方向
FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样 本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； – 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流 式细胞仪一般只用于分选。
BD公司分析型流式细胞仪
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
（三）光收集系统
• 滤光片的组成
– 长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过； – 短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过； – 带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。
460 500 540 460 500 540 460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
10 psi 10.2 psi
10 psi
10.8 psi
• 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。 • 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
1.2.2 光学系统
（一）激发光源 ：激光器
• 气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)； • 染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激 光器，发出550-650nm可变波长激发光； • 半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器。
500-549nm，绿色荧光（Green）； 585-615nm，橙色荧光（Orange）； ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。
标记抗体的荧光素
荧光素分子 FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647 发射光波长 （nm） 520 575 675 660 670 767 519 665 中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
1.3.1 散射光信号
（一）前向散射光FSC
FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内， 亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。
（二）侧向散射光SSC
• SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散 射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
（三）散射光的作用
1979年 国家科委重点项目：
研制国内第一台激光流式细胞仪
1982年 国内第一台三参数激光流式细胞
1984年 国家科委组织科研成果的鉴定验
1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖；
1985年--1990年 灵敏度、信噪比、更多
流式分选仪研制开发； 计算机四参数软件；
样品制备、医学生物学
流式细胞仪的分类
（三）阈值 Threshold
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰 信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较 小的死细胞。 • FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
5%
32%
默认阈值
升高阈值后
1.3.2 荧光信号
（一）荧光： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的 细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
• 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
粘连 细胞 死细胞
死细胞 或碎片
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– – – – – 流式细胞术简介 流式细胞仪的结构组成 流式细胞仪的光信号检测 流式细胞术数据的存贮、显示与分析 流式分选
• 二、流式细胞术操作与技巧 • 三、流式细胞术在生物医学中的应用
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
1.3 流式细胞术光信号检测
光信号的类型 • 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
• 荧光信号
– 自发荧光 ：微弱 – 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
1.2.1 液流系统
• 鞘流技术：根据层流原理发 展起来的技术，可以实现两 种液体的同轴流动，样本细 胞流位于轴心稳定流动，外 面包裹有鞘液(sheath)。 • 流体动力学聚焦：稳定的液 流从截面积较大的部分流入 截面积较小的部分后，有一 个聚焦收缩作用，细胞流直 径被约束在10-20um，避免 了多个细胞重叠进入检测区。
• 前置放大电路
将信号等比例放大，输出电脉冲信号。
• 模数转换器
将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。
• 数据处理系统
计算机系统数据采集、分析。
（一）光电检测器(photodetector)
• 光电二极管(photodiode) 光灵敏度低，测定强信号（FSC）； • 光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。
PMT
前向散射光 光电二极管
（二）电信号两种放大方式
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析 处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin) 对数(logarithmic; log)
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号 变异范围较大，多使用对数放大。
鞘液
鞘液
细胞流
激光照射点 流体动力学聚焦示意图
（一）流动室和液流驱动系统
• 流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。 流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。
进样孔
鞘液Sheath 荧光信号 激光束
流动室结构图：单细胞发生器
液流驱动系统
（二）进样速率控制
Gallios 三激光十色，分 析型
CyAn三激光九色，分析型
MoFlo XDP 高端分选型
1.2 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统
• 光学系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
• 细胞分选系统
– 喷嘴 – 电偏转板 – 样本收集器
（三）rea/Height
Pulse Height
Volts
Pulse Area
0
Pulse Width
Time
Creation of a Voltage Pulse
Quantification of a Voltage Pulse
光信号
电信号
核酸荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响； PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 • 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱 基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 • DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链 上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想 的DNA定量染料。 • Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。 • PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 • AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。