第七章 外源基因的表达及其优化策略

第二节 外源基因在原核细胞中的表达
二、外源基因在原核细胞中表达具备条件
1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统 合成外源蛋白。 2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化 学合成基因，而不能用基因组DNA。 3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基 因的表达。
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
用原核生物作宿主。
原核或噬菌体启动子
SD序列
MCS
终止子
A dividing E. coli
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
-35 Box 和 -10 Box
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
不同启动子的consensus sequences
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列 -35 box：RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’ -10 box（Pribnow Box）：5’-TATAAT-3’
一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动 子，催化所有RNA的合成。
2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。
Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰 基转移酶。
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要 比对基因产物直接控制要慢。
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架 (ORF)。
5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因 的表达产物对宿主菌的毒害。
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
原核生物基因表达载体的组成特征 启动子
核糖体结合位点(SD序列)
终止子 选择标记基因
复制子
原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统 链霉菌受体系统、蓝藻受体系统
第一节
影响外源基因表达的因素
一、阅读框架对转化基因的影响 什么是阅读框架(open reading frame, ORF)? 二、顺式作用元件对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控 1)启动子
2)增强子
3)沉默子
第一节
影响外源基因表达的因素
二、顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控 1)终止子 2)衰减子 3.对DNA结构的影响
第七章 外源基因的表达及其优化策略
第一节 第二节 第三节
影响外源基因表达的因素 外源基因在原核细胞中的表达 外源基因在真核细胞中的表达
第一节
基因表达：
影响外源基因表达的因素
从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息,通过密码子
和反密码子系统,转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白
质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
一、原核生物细胞表达的特点 6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个 翻译起始密码子及同16S RNA 3’末端碱基互补的序列，即 SD序列。
Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一个启始密码子 和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫ShineDalgarno（S-D）序列。
第一节
影响外源基因表达的因素
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及 所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细 胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个 基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达 产物。
第一节
影响外源基因表达的因素
基因表达
遗传信息从DNA到蛋白质的
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞 两部分组成。 宿主细胞分为两大类：
第一类为原核细胞：
大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞： 酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它 们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。
5’ TTGACA 17bp 核糖体结合位点 TATAAT 转录起始位点
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列
原核启动子共有序列的功能
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白
真核与原核生物结构上存在差别
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
大肠杆菌表达载体的基本成分
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成 的序列。 （1）启动子序列 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序 （consensus sequence）。
传递过程——中心法则（central dogma）。
第一节
影响外源基因表达的因素
克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达 外源基因 重组载体 表达载体 在宿主细胞中 表达出蛋白质 导入宿主细胞
提取蛋白
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞
第一节
影响外源基因表达的因素
影响外源基因表达的因素主要有： 阅读框架 顺式作用元件 翻译过程 表达体系
1)核基质结合区：一段与核基质特异结合的DNA序列。
2)绝缘子：对一侧有作用，对另一侧没有。 3)基因座控制区：通过改变染色质结构导致基因转录。
第一节
影响外源基因表达的因素
三、翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响 四、表达系统对表达产物的影响