凝胶层析法分离纯化蛋白质

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葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

凝胶层析的实际操作
4、上样上样体积不大于6%柱床体积，上样浓度控制再35mg / ml~50 mg / ml，以不大于12cm / h线性流速上样。
5、洗脱用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB溶液，以不大于12cm / h线性流速洗脱
凝胶层析的操作注意事项
1、盐析过程盐溶液加少，盐析程度不够；盐溶液加多，盐浓度过高有可能会导致蛋白变性； 2、蛋白的上样浓度不宜过高（70 mg / ml GE公司凝胶手册数据），否则样品粘稠影响分离效果； 3、样品必须是均匀的溶液体系，没有颗粒，否则容易造成柱子阻塞；
凝胶柱层析分离纯化蛋白质
学习目的
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：凝胶的选择和准备。掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
有效分配系数Kav的意义。
重点：
1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。
2、分配系数与被分离分子量之间的关系。
蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。
凝胶层析的基本原理
凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。
凝胶：一些具有立体网状结构和一定孔径的高分子化合物。
分子大于凝胶孔隙范围的物质：随着溶剂在凝胶颗粒间流动
分子小于凝胶孔隙范围的物质：渗入凝胶颗粒的孔隙中
型号：S-100,S-200,S-300,S-400等
Sephacryl的常见规格（分级范围）
预装柱
车间现有规格 1000~100000
凝胶层析的实际操作

凝胶层析法分离纯化蛋白质

了解凝胶层析分基本原理，学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
三、试剂和材料
1）载体：葡聚糖凝胶G-50 2）样品液：
含蓝色葡聚糖2000[相对分子质量在200万以上，蓝色]，红色水溶性百里香酚蓝[分子质量488.60，红色]
3）洗脱液： 50mmol/L pH3.0 磷酸缓冲液。
（每组200ml。溶液配方：磷酸氢二钠：1.754g；磷酸二氢钠： 0.796g；NaCl：1.752g，用水定容至200ml。配制完成后用盐酸调pH 值为3.0）
凝胶过滤层析原理示意图
一、目的二、原理
1）凝胶层析是基于分子大小不同而进行分离的一种分离方法。 2）将一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用流动相洗脱，则无法进入多孔凝胶颗粒内部的大分子会直接随流动相由凝胶颗粒之间的空隙被洗脱下来； 3）小分子因可深入凝胶颗粒内部而受到很大的阻滞，最晚洗脱下来； 4）中等大小的分子虽可进入凝胶颗粒内部但并不深入，受到凝胶颗粒的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。
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实验步骤
五、收集： 1、用试管进行样品的收集，每管1ml。
2、注意观察层析柱内分离现象，并观察收集管内颜色深浅，以—、+、++等记号记录两种物质洗脱液的颜色。或者用400nm， 550nm测其OD值
六、凝胶柱的处理： 1、凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2~3倍床体积）通过柱即可。
2、如果凝胶有颜色或比较脏，需用0.5 mol/L 的NaOH-0.5 mol/L NaБайду номын сангаасl洗涤，再用蒸馏水洗。
7
实验步骤
三、平衡： 1、将洗脱液与恒流泵相连，用2倍床体积的洗脱液平衡，平衡完成后，检测流出液的pH值是否为3.0。四、加样和洗脱： 1、将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。 2、将400ul的样品沿层析柱管壁小心加入，加完后，在打开底端出口。 3、用少量洗脱液清洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右，按上恒流泵，开始洗脱。

凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质

凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。

2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。

Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。

一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

根据分子大小分离蛋白质的方法

根据分子大小分离蛋白质的方法蛋白质是生命体中非常重要的分子，它们在细胞的结构和功能中起着关键作用。

为了研究蛋白质的特性和功能，科学家们经常需要对蛋白质进行分离和纯化。

分离蛋白质的一个重要方法是根据蛋白质的分子大小进行分离。

本文将介绍几种常用的根据分子大小分离蛋白质的方法。

一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的常用分离技术。

其原理是利用孔径大小不同的凝胶材料，将大分子蛋白质滞留在凝胶中，而小分子溶质可以顺利通过凝胶。

常用的凝胶材料有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。

根据需要选择不同的凝胶孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。

它利用电场作用将蛋白质分子按照大小进行分离。

在聚丙烯酰胺凝胶中，较大的蛋白质分子迁移速度较慢，而较小的蛋白质分子迁移速度较快。

通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

三、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的变性凝胶电泳方法。

尿素是一种强变性剂，可以使蛋白质分子解离成单体，并且具有较好的可溶性。

在尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质分子的迁移速度主要取决于它们的电荷和分子大小。

通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

四、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱是一种利用固定相孔径大小进行分离的色谱技术。

在尺寸排阻色谱中，较大的蛋白质分子无法进入固定相孔径，因此会以较快的速度从色谱柱中洗脱，而较小的蛋白质分子则会在固定相中发生多次扩散，从而保留更长的时间。

通过调整固定相的孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

五、离心过滤法离心过滤法是一种简便快速的蛋白质分离方法。

它利用离心力将大分子蛋白质沉淀在滤膜上，而小分子蛋白质则通过滤膜被洗脱出来。

通过选择不同孔径的滤膜，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

根据分子大小分离蛋白质的方法有凝胶过滤层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻色谱和离心过滤法等。

分离纯化蛋白质的方法

分离纯化蛋白质的方法蛋白质是生命体内最基本的分子，它们参与了生命体内的许多重要生物学过程，如代谢、信号转导、免疫防御等。

因此，对蛋白质的研究具有重要的科学意义。

但是，蛋白质在生物体内的含量很少，且与其他成分相混合，因此需要通过分离纯化的方法来获取纯净的蛋白质样品。

本文将介绍几种常用的分离纯化蛋白质的方法。

1. 溶液层析法溶液层析法是一种常用的蛋白质分离纯化方法。

它基于蛋白质在不同的化学性质和结构特征下在固定相中的不同亲和力，通过不同的溶液组成、pH值、离子强度等条件来分离纯化蛋白质。

溶液层析法的操作简单、效果好，可以分离出高纯度的蛋白质。

但是，它需要对分离材料的性质和蛋白质的性质有深入的了解，以便选择合适的分离条件。

此外，溶液层析法需要大量的分离材料和实验室设备，成本较高。

2. 凝胶层析法凝胶层析法是一种基于蛋白质分子大小、形状和电荷等性质的分离纯化方法。

它利用凝胶作为分离材料，通过分子筛效应、凝胶孔道大小和分子电荷等因素来分离不同大小和电荷的蛋白质。

凝胶层析法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。

但是，它需要长时间的分离过程，而且凝胶的孔径大小和材料的性质会影响分离效果。

此外，凝胶层析法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。

3. 电泳法电泳法是一种通过电场作用将不同电荷的蛋白质分离的方法。

它利用电泳移动速度与蛋白质质量和电荷密度之间的关系，将蛋白质分离纯化。

电泳法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。

但是，它需要专业的电泳设备和实验技能，而且对蛋白质的性质和电泳条件有较高的要求。

此外，电泳法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。

4. 亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与其配体之间的亲和作用来分离纯化蛋白质的方法。

它利用配体与蛋白质的特异性结合来分离纯化目标蛋白质。

亲和层析法具有分离效果好、选择性高、可重复使用等优点。

但是，它需要高纯度的配体和专业的实验技能，而且对蛋白质的性质和配体的选择有较高的要求。

实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质

层析柱的重要参数：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的体积很少时（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。③当样品体积很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘米光程时， 254nm 处透光率为 60 ％，
280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐水。
、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。流速过快，会使色谱峰变形，流速过慢，样品扩散倾向加剧。一般流速控制在30－200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和消除凝胶的吸附作用；
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率，是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi

凝胶层析法分离纯化蛋白质

凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验器材】
层析柱恒流泵紫外检测仪部分收集器试管等普通玻璃器皿
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验试剂】
待分离样品葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【原理】凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
带网入珠内，经珠之间缝隙流出
凝胶过凝滤胶层层析法分析离纯过化蛋程白质示意图
凝胶凝胶基质珠
小分子大分子
凝胶过滤凝胶层层析法析分离过纯化程蛋白质示意图
总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。

四种蛋白纯化方式的原理及优缺点的简述

一.分子筛（凝胶层析）原理：用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使蛋白质分离。

优点：1.洗脱条件简单，往往只需要一种缓冲溶液，可以使用任何缓冲液。

2.实验操作相对简单3.条件温和，对蛋白活性保持率高4.既可以对标签蛋白纯化也可以对非标签蛋白纯化。

缺点：1. 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。

2. 层析柱装填困难3.对上样量有要求4.测定柱效困难5.反复使用层析柱困难二.亲和层析原理：亲和层析是一种吸附层析，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH 值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。

优点:1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。

2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。

此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。

此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。

缺点：1.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。

2. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。

三.离子交换层析原理：离子交换层析根据样品表面电荷不同进行分离纯化的技术，根据不同蛋白样品在同一Ph条件下所带电荷正负以及带电荷量不同而将不同蛋白样品分离。

凝胶层析法分离蛋白质实验报告

凝胶层析法分离蛋白质实验报告凝胶层析法分离蛋白质实验报告一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析法分离蛋白质，掌握凝胶层析法的基本原理和方法，了解凝胶层析在蛋白质分离中的应用。

二、实验原理凝胶层析法是一种基于分子大小不同的分离技术。

它利用凝胶颗粒的孔径大小，将不同大小的分子进行分离。

当蛋白质溶液通过装有凝胶颗粒的层析柱时，不同大小的蛋白质分子会根据其大小分别进入凝胶颗粒的不同孔径，从而实现在一个连续的流洗过程中将不同大小的蛋白质分离开来。

三、实验步骤1.准备实验材料：凝胶颗粒（如Sephadex G-25或G-75）、层析柱、蛋白质样品（如牛血清白蛋白）、缓冲液等。

2.将凝胶颗粒装入层析柱中，注意不要压实，保持颗粒松散。

3.加入缓冲液，使凝胶颗粒充分膨胀。

4.将蛋白质样品加入到层析柱中，注意不要加太多，以免影响分离效果。

5.打开流出口，使缓冲液缓慢流过层析柱，收集流出的溶液。

6.记录每管收集的溶液体积和蛋白质含量，绘制洗脱曲线。

7.收集分离后的蛋白质。

四、实验结果与分析1.洗脱曲线的绘制与分析实验中，随着缓冲液的流过，不同大小的蛋白质分子会依次被洗脱出来。

通过观察每管收集的溶液体积和蛋白质含量，我们可以绘制出洗脱曲线。

洗脱曲线显示了不同大小的蛋白质分子被洗脱出来的时间和顺序。

通过洗脱曲线，我们可以分析不同蛋白质分子的性质和大小。

2.分离效果评估通过比较实验前后的蛋白质样品，我们可以评估凝胶层析法的分离效果。

在凝胶层析法中，不同大小的蛋白质分子被分离出来，从而可以得到多个不同的蛋白质组分。

通过观察每个组分的蛋白质含量和性质，我们可以评估凝胶层析法的分离效果。

五、结论本实验通过凝胶层析法成功地分离了蛋白质样品中的不同组分。

实验结果表明，凝胶层析法是一种有效的蛋白质分离方法。

通过调整凝胶颗粒的孔径大小和缓冲液的成分，可以进一步优化分离效果。

在生物化学、生物工程和生物医药等领域，凝胶层析法被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离和纯化。

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March分离纯化蛋白质的方法及原理（一）利用分子大小1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。

方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：如何加快透析过程（1）加大浓度差，及时更换透析液（2）利用磁力搅拌器常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。

而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。

结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来（二）利用溶解度差别4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。

5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析（三）根据电荷不同6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。

电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。

所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。

7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。

实验6 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质

实验6 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。

脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。

前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。

所以，要根据具体情况选择使用。

前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。

（二）试剂与器材（1）Sephadex G-25。

（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。

（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。

用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。

将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。

（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。

（5）1.5cm×20cm层析柱。

（6）黑、白比色磁盘。

（三）操作（1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。

将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右，关闭出口。

待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。

（2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。

凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。

凝胶过滤法分离蛋白质实验报告

凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。

二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。

高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。

当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。

由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。

从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。

三、试剂与仪器0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒四、实验步骤1.凝胶溶胀2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。

使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。

待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。

3.样品处理4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。

打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。

凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。

5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。

并观察柱上的色带，待黄色的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。

6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。

五、实验现象结果及其讨论颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。

接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。

原因：1.开始时，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为缓冲液。

凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理

凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理一、凝胶过滤层析的概念和原理凝胶过滤层析是一种常用的生物化学分离技术，主要用于蛋白质的精细纯化和分离。

其原理是利用凝胶颗粒的孔隙结构，根据蛋白质的大小和形状差异，使不同分子量和形状的蛋白质在凝胶颗粒的孔隙中发生不同程度的阻滞和流动，从而实现蛋白质的分离和纯化。

二、凝胶过滤层析的操作步骤1. 样品加载：将待纯化的蛋白样品均匀地加载到预先平衡的凝胶柱或凝胶板上。

2. 洗脱：用缓冲液通过凝胶柱，洗去未结合的蛋白和其他杂质。

3. 洗脱物收集：收集洗脱液中的目标蛋白。

4. 分析和检测：对收集的蛋白样品进行分析和检测。

三、凝胶过滤层析的优点和适用范围1. 分辨率高：凝胶过滤层析能够分离不同分子量的蛋白，分辨率较高。

2. 操作简单：操作过程不需要高昂的设备和特殊技能，相对容易进行。

3. 适用范围广：适用于各种不同分子量和性质的蛋白质的纯化和分离。

四、对凝胶过滤层析的个人理解和观点凝胶过滤层析作为一种生物化学分离技术，在蛋白质纯化领域有着广泛的应用。

它的原理简单易懂，操作相对容易，且适用范围广，因此备受科研人员的青睐。

在生物制药和基因工程等领域，凝胶过滤层析也发挥着重要的作用，为蛋白质的纯化和分离提供了有效的技术手段。

总结：凝胶过滤层析作为一种重要的蛋白质纯化技术，具有分辨率高、操作简单、适用范围广等优点。

通过对凝胶过滤层析的深入理解和掌握，能够为生物化学研究和生物制药领域的发展提供有力支持。

通过本文的深度探讨，相信您对凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理有了更深入的了解。

希望本文能够帮助您更全面、深刻和灵活地理解这一主题。

凝胶过滤层析属于分子量分馏技术，是一种物理性质分离方法。

它基于蛋白质在凝胶柱内孔隙中的迁移速度的差异，可以将混合物中的不同分子量的蛋白质分离开来。

对于高分子量的蛋白质来说，凝胶柱内的孔隙会成为一个障碍，从而使它们在柱内停留的时间更长，而低分子量的蛋白质会更容易通过孔隙，因此在经过相同时间的洗脱后，不同分子量的蛋白质就可以被有效地分离开来。

凝胶层析生化实验报告

一、实验目的
1. 了解凝胶层析的原理和方法。
2. 掌握凝胶层析的操作技能。
3. 通过凝胶层析分离和纯化蛋白质。
二、实验原理
凝胶层析是一种基于分子大小差异的分离技术，其原理是利用凝胶的多孔性，使不同大小的分子在凝胶柱中以不同的速度移动，从而实现分离。凝胶层析可分为凝胶过滤和凝胶排阻两种类型，其中凝胶过滤适用于分离分子量相近的物质，凝胶排阻适用于分离分子量差异较大的物质。
本实验采用凝胶过滤法，以葡聚糖凝胶为固定相，通过凝胶柱对蛋白质混合物进行分离。
三、实验材料
1. 蛋白质混合物：含有多种蛋白质的溶液。
2. 葡聚糖凝胶磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
4. 其他：层析柱、恒流泵、紫外分光光度计、收集器等。
四、实验步骤
1. 准备凝胶柱：将葡聚糖凝胶加入层析柱中，使其自然沉降至底部，形成凝胶床。
3. 本实验中，蛋白质分子量分布较广，说明蛋白质混合物中存在多种分子量的蛋白质。通过凝胶层析，可以将这些蛋白质分离和纯化。
七、实验总结
本实验通过凝胶层析分离和纯化了蛋白质混合物，成功实现了蛋白质的分离和纯化。通过实验，掌握了凝胶层析的原理和操作技能，为今后的实验研究奠定了基础。
六、实验讨论
1. 凝胶层析的分离效果受多种因素影响，如凝胶的种类、洗脱液的pH、流速等。在本实验中，选用Sephadex G-100凝胶，以磷酸盐缓冲液（pH 7.4）为洗脱液，流速为1.0 mL/min，可得到较好的分离效果。
2. 凝胶层析具有操作简单、分离效果好、不影响蛋白质活性等优点，在蛋白质分离和纯化中具有广泛的应用。
五、实验结果与分析
1. 洗脱曲线：随着洗脱的进行，蛋白质分子量逐渐增大，洗脱峰的位置逐渐向后推移。根据洗脱峰的位置，可以判断蛋白质的分子量。

“凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质”生化实验报告

凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXX 温度：20℃实验目的：①理解凝胶过滤层析的原理。

②掌握装柱、平衡、上样、柱效检验的方法。

③学会分析洗脱峰峰型。

试验方法与过程：1.装柱①固定层析柱，柱内装1/2双蒸水，双蒸水下降到1/4时，关闭出口。

②搅拌凝胶浆液，用玻璃棒引流缓慢倒入层析柱，打开出口，让凝胶沉降。

③装至柱内有2/3凝胶，上层保留至少0.5cm的水。

2.平衡双蒸水平衡柱，管口上接恒流泵、下管接检测仪入口，控制流速。

观察紫外检测仪平衡后A280应小于0.01.然后调整流速为2ml/min，暂停恒流泵。

3.加样吸取5%丙酮溶液500ul，沿柱壁缓慢加入，控制出水口管的高度使使样品缓缓进入胶内，用1ml双蒸水冲洗壁上的样品，在加入3-4ml双蒸水后关闭盖子。

4.洗脱凝集打开恒流泵开关，监视紫外检测仪的情况，待丙酮全部流出后加入，加入蛋白质混合物，监视紫外检测仪情况，开始出现上升即开始收集流出液。

蛋白质样品全部流出后，用双蒸水冲洗凝胶。

原始数据：图一：从左到右第一个峰为丙酮，第二第三个峰分别为混合物中的两种蛋白质。

结果处理与分析：①根据图像得As略大于1，说明装柱压力不足，可能滤网内有空气进入。

②由于是先加入丙酮再打开色谱分析软件，所以不能分析到分配系数Kd。

③在图一黑色箭头所指处色谱曲线出现了抖动，可能是因为在丙酮洗脱过程中打开了层析柱上口，导致空气进入。

④加入样品后出现两个峰，说明混合样品中有两种大小不同的物质被分离出来。

讨论：1.注意事项：一定要保证凝胶柱上层有液体覆盖，不能使之暴露于空气中；保证所灌凝胶中没有气泡，当有气泡和凝胶有明显分层时3，应在灌胶过程中及时用玻璃棒搅拌去除气泡及使不均匀的凝胶重悬后重新沉淀。

2.经验和心得：用滴管向凝胶柱内加入双蒸水和样品时，一定要沿管壁边旋转边缓慢加入，防止加入时产生压力太大，使凝胶柱上表面不平整；用滴管比用移液枪加样品好，因为滴管产生的压力小。

实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

得到较好的分离效果？
Thank You!
装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。
加样时移液器垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起。实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。
吸附层析(absorption chromatography)
低分子量蛋白、多肽的分离
3,000~70,000 中低分子量蛋白、多肽的分离 4,000 ~150,000 中高分子量蛋白的分离 5,000 ~400,000 高分子量蛋白的分离 5,000 ~800,000
重点1
凝胶层析的原理分子筛效应
比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，首先流出。
亲和力生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原－抗体、酶－底物、激素－受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。分离原理在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离纯化。
1. Incubate crude sample with the immobilized ligand
混合物随流动相经固定相(网状孔径)的
层析柱时，混合物中各组份按其分子大
小不同而被分离的技术。
固定相（凝胶）
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致。
☻葡聚糖凝胶（Sephadex） ☻琼脂糖凝胶（Sepharose）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质

凝胶层析法分离蛋白质实验报告

凝胶层析法分离蛋白质实验报告实验目的：通过凝胶层析法对不同分子量的蛋白质进行分离纯化，掌握凝胶层析的基本原理和操作方法，并熟悉蛋白质纯化过程中的注意事项和常见问题。

实验原理：凝胶层析法是一种蛋白质纯化方法，其基本原理是利用凝胶的三维结构和孔径大小对不同分子量的蛋白质进行分离纯化。

常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶凝胶等。

在实验中我们采用了聚丙烯酰胺凝胶，其孔径大小是可以控制的，所以利用不同孔径大小的凝胶对不同分子量的蛋白质进行分离。

通常，具有较大分子量的蛋白质被排除在凝胶顶端的孔径较小的区域，而具有较小分子量的蛋白质则可以渗透入较小孔径的凝胶中，因此存在于较深的凝胶层中。

实验步骤：1.准备干燥的聚丙烯酰胺凝胶片，并将其装入凝胶层析柱中。

2.通过密封顶部的小孔，加入显色剂和柠檬酸盐缓冲液制成试样，注意不要将试样直接滴入凝胶中。

3.将制备好的样品通过重力作用，缓慢流经凝胶柱，待所有样品渗透完毕后，收集洗脱出来的蛋白质。

4.将收集得到的蛋白质样品通过SDS-PAGE电泳分析其分子量和纯度。

实验结果：在本次实验中，我们以三种分子量不同的蛋白质作为样品，分别是Bovine Serum Albumin（分子量为66kDa）、Egg Albumin（分子量为44kDa）以及Cytochrome C（分子量为12.4kDa）。

结果显示，我们的分离纯化效果较好，三个分子量不同的蛋白质在凝胶中得到了良好的分离。

而通过SDS-PAGE电泳也证实了每个样品的分子量与预期相符，并且纯度较高。

1.凝胶层析柱和样品的pH值要一致，避免蛋白质发生脱变性。

2.样品加入凝胶层析柱后，立即加入缓冲液，避免样品直接流入凝胶中。

3.收集洗脱出来的蛋白质时要注意，不要将不同分子量的蛋白混杂在一起，否则会影响后续的分析结果。

本次实验还让我们掌握了SDS-PAGE电泳的原理和操作方法，并通过其分析了凝胶层析后的蛋白质纯度和分子量，这对我们的研究工作和生物科学的进一步探索起到了重要的作用。

凝胶层析纯化蛋白的原理

凝胶层析纯化蛋白的原理凝胶层析是一种常用的蛋白质纯化方法，它基于蛋白质在凝胶柱中的分配行为进行分离和纯化。

这种方法适用于从复杂混合物中纯化蛋白质，并且可以根据蛋白质的分子大小、电荷、亲疏水性等特性进行选择性分离。

本文将介绍凝胶层析纯化蛋白的原理及其应用。

首先，凝胶层析的原理是基于蛋白质在凝胶柱中的分配行为。

凝胶柱是由交联聚丙烯酰胺或琼脂糖等材料制成，具有一定的孔隙结构。

当样品溶液通过凝胶柱时，不同大小、电荷和亲疏水性的蛋白质将以不同的速率通过柱体，并在柱体中产生不同的分离效应。

大分子蛋白质会在柱体表面被阻滞，小分子蛋白质则会进入柱体内部，从而实现了对蛋白质的分离。

其次，凝胶层析的原理还包括了分配系数的影响。

分配系数是指蛋白质在固定相和流动相之间的分配比例，它受到蛋白质分子大小、电荷、亲疏水性等因素的影响。

在凝胶柱中，蛋白质会根据其分配系数在固定相和流动相之间进行平衡分配，从而实现了蛋白质的分离和纯化。

最后，凝胶层析的原理还涉及了柱体的选择性。

不同类型的凝胶柱具有不同的孔隙大小和化学性质，因此可以选择性地分离不同特性的蛋白质。

例如，大小排阻柱适用于分离大分子蛋白质，离子交换柱适用于分离带电蛋白质，亲和层析柱适用于分离特定亲和键的蛋白质等。

通过合理选择凝胶柱，可以实现对特定类型蛋白质的高效分离和纯化。

总之，凝胶层析纯化蛋白的原理是基于蛋白质在凝胶柱中的分配行为、分配系数的影响以及柱体的选择性。

这种方法可以根据蛋白质的特性实现高效的分离和纯化，是一种重要的蛋白质分离技术。

在实际应用中，可以根据样品的特性选择合适的凝胶柱，优化分离条件，从而实现对目标蛋白的高效纯化。

希望本文的介绍对您了解凝胶层析纯化蛋白的原理有所帮助。