第6章--分子生物学技术

（二）措施 ①温度不要过高； ②控制pH值范围(pH值5-9)； ③保持一定离子强度； ④减少物理因素对核酸的机械剪切力； ⑤所用器械和一些试剂需高温灭菌； ⑥提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸 链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
（三）核酸分子抽提的技术设计
1、核酸的释放--破裂细胞，释放核酸。 ⑴高速组织捣碎机捣碎 ⑵玻璃匀浆器匀浆 ⑶超声波处理法 ⑷液氮研磨法 ⑸化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） ⑹生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
➢液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中 进行杂交反应。
（一）膜上印迹杂交
将待测核酸序列结合到一定的支持物 上，然后与存在于液相中的核酸探针进行 杂交的过程称为膜上印迹杂交。 印记的方法： 虹吸印迹法；真空转移法；电转移法
DNA或RNA ↓
电泳分离核酸片段 ↓
转移至固相支持物（印迹技术） ↓
杂交 ↓
第六章 分子生物学 基本操作技术
第一节 核酸的提取 第二节 核酸杂交技术 第三节 PCR技术
第一节 核酸的提取
一、提取核酸的基本步骤
（一）总则 ➢保证核酸一级结构的完整性； ➢其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类
分子的污染应降低到最低程度； ➢核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的
有机溶剂和过高浓度的金属离子； ➢应尽量去除非目标核酸分子。
第二节 核酸杂交技术
一、核酸分子杂交的基本原理
核酸分子杂交 （nucleic acid hybridization）
指具有互补序列的两条核酸单链在一定 条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子。
1、DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素的作用下，核酸双链分
PCR反应的特点
➢ 特异性强：引物与模板结合的特异性及 聚合酶的忠实性。
➢ 灵敏度高：指数增长，从pg (10-12)可扩 增至 mg (10-6)水平
➢ 简便、快速：2-4 小时完成扩增。 ➢ 对标本的纯度要求低：DNA 粗制品及总
主要试剂及其作用： EDTA： ①二价金属螯合剂，抑制核酸酶； ②降低细胞膜的稳定性。 SDS： ①溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜破裂； ②溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
释放出来； ③对RNA、DNA酶有抑制作用； ④与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。
蛋白酶K： 消化DNA酶和细胞中的蛋白质。可与SDS、 EDTA同时使用，仍保持较高活性。 酚： 使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酶活性。 pH8.0的Tris溶液： 使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层 滞留。 酚或酚-氯仿中少许的异戊醇： 减少气泡的产生，利于分相，保持分相的稳 定性。
2、核酸的分离与纯化
将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸 与其他物质分离
非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖 和脂类分子）、非目的核酸分子、试剂
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
➢沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 ➢ 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后
使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）
➢少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双 链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结 构被破坏，形成单链分子的过程。 常用的变性方法： ①热变性；②酸碱变性；③化学试剂变性
2、DNA的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性DNA的两条互补链
可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，
（三）DNA样品的纯化 方法：透析、层析、电泳及选择性沉淀。 琼脂糖电泳适用于0.1-60Kb片段，聚丙烯酰 胺（PAGE）电泳适用于5-500bp大小的片段。
琼脂糖含量％（W/V） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA分离范围（Kb） 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
① 单链核酸的起始浓度：浓度越高，复性 越快。
② 核酸链长度：越长，形成配对的难度越 大，复性也慢。
③ 核酸分子的复杂性：复杂性越高，形成 正确配对的难度也越大，复性越慢。
④ 温度：温度过低则分子运动减慢，少 数碱基形成的局部双链也不易解离。 适宜的复性温度是比Tm低25℃。
⑤ 离子强度：适当的离子强度可中和核 酸分子上磷酸基团所带的负电，减少 双链间的静电斥力，有利于复性。但 离子强度过高也不利于复性。
• 核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA 或RNA片段上带上可检测的标记，可用 来检测样品中未知的核酸序列。
影响核酸分子杂交的因素
① 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越 高，复性速度越快。但双链探针浓度过 高会增加自我复性而影响杂交；浓度过 高也会增加非特异结合，使杂交背景增 强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越 高，配对难度也增大。
此过程称为退火(annealing)。
3、解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环境温度。
增色效应： DNA变性后对 260nm紫外光 收增加的现象。
减色效应： 变性DNA复性 后对260nm紫 外光吸收减少 的现象。
影响复性的因素
5、核酸的储存
DNA：
①溶于pH8.0的TE（tris和EDTA）缓冲液中， 4 ℃或-20 ℃保存；
②长期保存样品中可加入1滴氯仿。
RNA：
①溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70 ℃保存;
②溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液 中，-20 ℃保存。或加1滴0.2 mol/L VRC( 氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃。
二、基因组DNA的分离与纯化
（一）样品准备 • 常见的标本：血液、尿液、唾液、组
织、培养细胞、细菌等。 • 生物组织：最好新鲜组织，若不能马
上提取，应贮存－70℃或液氮中。
（二）DNA提取
1、酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细
胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚 或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇 进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。
2 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺
解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。 高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合 物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽 提的步骤。
适用于从标本中制备高分子量的DNA样 品--可得200kb左右的DNA。
3 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙
（四）DNA的浓缩
1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋 外敷PEG至合适量。
2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到 正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重 复几次可显著减少DNA体积。
（六）DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率，去除回
收DNA样品中的污染物。 电泳到DEAE-纤维素膜：500bp-5kb的DNA片 段回收率较好，纯度高。但不适用于分子 量超过10kb和单链DNA。 透析袋电洗脱： 低熔点琼脂糖凝胶：有机溶剂提取法、玻 璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。
常用的探针标记物： 放射性同位素（3H、32P、35S、125I）；
非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根 过氧化酶、碱性磷酸酶等）。
三、核酸分子杂交信号的检测
➢放射性同位素标记探针： 放射自显影。
➢非放射性同位素标记探针： 偶联反应+显色反应。
四、核酸分子杂交技术
➢固相杂交：结合于某种固相支持物上的待 测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂 交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。
洗去未杂交探针 ↓
杂交信号检测
限制性酶切割 DNA分子
限制片段 琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA
至膜上（尼龙膜或 硝酸纤维素滤膜）
凝胶
滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
Southern 印迹杂交
杂交、显影
Southern 印迹杂交
Southern 印迹杂交
Southern 印迹杂交
醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅， DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
4 异丙醇沉淀法： 基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代
乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶 状态）。
5 表面活性剂快速制备法： 用Triton X-100或NP-40表面活性剂破
碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙 醇沉淀或透析。
Northern 杂交
原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分 离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经 过杂交，分析mRNA的大小及含量。
应用：半定量分析mRNA的含量；确定 mRNA分子的大小。
方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量 →变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂 交→洗膜→压片→洗片→图像分析
② 离子强度：高离子强度溶液中，有利于 杂交分子形成。
③ 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进 行杂交。
④ 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯 酸可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而 加速杂交反应。
⑤ 杂交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸杂 交的Tm。含30%—50%甲酰胺的杂交温度能 降低到30—42℃。较低的杂交温度，使探 针更稳定，并能更好地保留非共价结合的 核酸。
Tm值与核酸含量的关系 ① <20bp Tm = 4(G≡C)+2(A＝T) ② >20bp Tm = 69.3+0.41(G≡C)%
4、杂交
• 来源不同的两条单链核酸分子通过碱 基互补形成异源双螺旋分子，称为核 酸分子杂交。
• 杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、 DNA与RNA之间的杂交。
4、核酸的鉴定
⑴浓度鉴定
浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液--紫外分光 光度法。
DNARNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释倍数×5040
低浓度核酸溶液--溴化乙锭荧光光度法。
⑵纯度鉴定
DNA:OD260/OD280=1.8；OD260/OD230>2.0。 RNA:OD260/OD280=1.7-2.0；OD260/OD230>2.0。 ⑶完整性鉴定--凝胶电泳法
↓←
核酸酶S1（专一降解未杂交 的DNA和RNA单链）
酶解
↓
杂交体系纯化
↓
脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳
↓
放射自Leabharlann Baidu影
待测RNA样品
↓ ← 单链RNA探针
液相杂交
↓
RNA-RNA杂交双链
↓←
RNA酶（专一降解未 杂交的RNA单链）
酶解
↓
杂交体系纯化
↓
脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳
↓
放射自显影
第三节 PCR技术
聚合酶链式反应： 在引物指导下由 酶催化的对特定 克隆或基因组 DNA序列进行的 体外扩增反应。
4、预杂交
为了减少探针与广泛存在的非互补 核酸的非特异性结合，在杂交前可用封 闭物将这些非特异位点封闭。在杂交前 的这些处理过程称为预杂交。
常用于预杂交的封闭物
① 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA 或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后， 除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们 可被吸附到所有其它区域，使整个背景 覆盖一层。由于它们与探针无同源性， 在杂交反应中可大大减少探针的非特异 性结合，使背影清晰。
② 高分子化合物：某些高分子化合物具有 封闭膜上非特异位点的能力。一般常用 Denhard’t溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小 牛血清白蛋白、聚蔗糖。
二、核酸探针
指能与特定核酸序列发生特异性互补 的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带 有特殊的标记物。
核酸探针的类型：
寡核苷酸探针、基因组DNA探针、cDNA 探针、RNA探针、单链DNA探针。
Western印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并
染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗 原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴 别滤膜上的蛋白质。
斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
适于核酸样品定量检测。
（二）原位杂交
用标记的已知核酸序列为探针，使其与 细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法 称为原位杂交。
原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、 RNA-RNA杂交。
取材 ↓
组织、细胞固定 ↓
预杂交 ↓
杂交 ↓
放射自显影或免疫酶法显色 ↓
观察结果
菌落杂交法
（三）液相杂交
1. RNA酶保护分析法 2. 核酸酶S1保护分析法
待测RNA样品
↓ ←单链DNA探针（M13体系合成）
液相杂交
↓
DNA-RNA杂交双链