微生物的活化与培养-20180915

• 1、明确目的:
• 首先明确微生物种类，培养自养菌，还是 异养菌。 • 其次明确培养目的，是科研，还是生产。 • 实验室一般不过多计算成本；生产上使 用要考虑是种子培养基还是发酵培养基
2、营养要协调:
某种物质适合微生物需要，并非浓度越高越好。过低 不能满足微生物生长的需要；过多轻则造成浪费，重 则抑制微生物生长。 微生物对各种营养要素数量的一般要求比例为： 水>C>N>P>S>其它元素>生长因子 要注意碳氮比（C/N） C/N：培养基中元素碳的量与 元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖的含量与粗 蛋白含量的比值。
⑵选择培养基
• 在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需 要的菌种的生长。 • 抗生素—抑制细菌、放线菌； • 制霉菌素—抑真菌； • 结晶紫、牛胆酸盐—抑G+细菌 • 链霉素—抑制原核生物的生长， • 某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培 养基
⑶鉴别培养基
• 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分 的微生物经培养后呈现出明显的差别，因而有助于 快速鉴别某种微生物。 • 如用以检查饮用水和乳制品中是否含有肠道致病 菌的伊红美蓝（EMB）培养基：蛋白胨10g，乳糖 10g，K2HPO4 2g，2%伊红水溶液20ml，0.325%美 蓝水溶液 20ml，水1000ml。 • 大肠杆菌在此培养基上形成较小、带有金属 光泽的紫黑色菌落， • 产气气杆菌形成较大的呈棕色菌落，肠道致 病菌菌落呈乳白色。
代谢产物含碳量较高的培养基的C/N比要大于代谢产物 含氮量高的培养基。如一般发酵工业中的 C/N为100： 0.5~2，而Glu发酵培养基的C/N为100：11~21。
• 3、理化条件要适宜
• pH值 各大类微生物对pH的要求不同。
• 原核微生物的pH为中性至微碱性（pH7.0~7.6 之间），
三、菌种活化方法
• 不同的保藏方式活化的方式也不同： • 目前国际国内常用的菌种保存方法包括：定期移 植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、 -80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 • （1）定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接 即可。 • （2）液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少 量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后， 再重新转接一次。
• （5）按所培养微生物类群来分
1、按培养基组成成分：
• ⑴天然培养基 • 指利用各种动、植物或微生物原料，其成分难以 确定。 • 如肉汤培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨5g，水 1000ml。 • 常用原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵 母膏、麸皮、牛奶、马铃薯、血清等。
• 天然培养基营养丰富，微生物生长旺盛，来源广 泛，配制方便，但稳定性较差。
⑵合成培养基 是一类化学成分和数量完全知道的培养基，用已 知化学成分的化学额药品配制而成。 如葡萄糖铵盐培养基：葡萄糖2%，K2HPO4 0.7%，KH2PO4 0.3%，MgSO4· 7H2O 0.01%， （NH4）2SO4 0.1%，H2O100 ml。 高氏1号培养基和查氏培养基等 这类培养基化学成分精确，重复性强但价格 昂贵，微生物生长缓慢，一般只适合做科学 研究。 ⑶半合成培养基 指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种 或某些天然成分的培养基。例如，马铃薯蔗糖 培养基。 这种培养基实验室和生产实践中使用最多。
• （5）-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安 瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复 苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50 秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜 的培养基上进行培养。 • （6）液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法 保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管， 应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直 到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安 瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培 养。
• 真核微生物喜欢偏酸性的环境（pH在4.5~6.5 之间）。
• 同时还要考虑到在代谢过程由于菌体的代谢 而引起的pH的变化，通常在培养基中加入一 些缓冲剂（K2HPO4、KH2PO4），以维持pH 的恒定。
• 渗透压 等渗
• 氧化还原电位
（三）培养基的类型
• 培养不同营养类型和营养要求的微生物要采 用不同的培养基。 • （1）按培养基化学组成分 • （2）按培养基的物理状态来分 • （3）按培养基的功能来分 • （4）按培养基的用途分
多细胞真菌-霉菌
单细胞真菌-酵母
工业上重要的酵母菌
啤酒酵母(酒精、啤酒 等),假丝酵母(单细胞 蛋白、柠檬酸、脂肪酸、 石油脱蜡)
第一节 微生物活化
• 一、基本概念 • 菌种活化就是将保藏状态的菌种转入适宜的培养 基中培养，逐级扩大培养得到纯而壮的培养物， 即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。 • 为什么要进行菌种活化？ • 菌种保存时的条件往往和培养时的条件不相同， 所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境，菌种发 酵用一般需要2-3代的复壮过程。
例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢 又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水 分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
放线菌
形状和大小：细胞呈长丝状，菌落呈放线状，介 于细菌和真菌之间，菌丝直径0.2～1.2微米，与 杆菌接近； 生长和繁殖：低等的(如诺卡氏菌)通过菌丝断裂 繁殖； 高等的(如链霉菌)在孢子丝成熟后分化 成许多孢子，孢子在适宜的环境中吸收水分，膨 胀、萌发，成为新的放线菌。
• ⑶半固体培养基 •
固化剂
• 理想固化剂具备的条件： 1）不被微生物液化、分解和利用 2 ）在微生物生长的温度范围内保持固体状态， 凝固点温度对微生物无害 3）不会因消毒、灭菌而破坏 4） 配制方便，价格低，透明性好 • 固化剂：琼脂、明胶、硅胶
琼脂（AGAR）
主要组成：琼脂糖和琼脂胶两种多糖 来源：石花菜等红藻加工 特性： 绝大多数微生物无法降解琼脂（极少数菌 除外） 琼脂 45℃固化，约100℃才融化 灭菌过程中不会被破坏，且价格低廉 培养基中的添加量： 加0.5%琼脂，可以获得半固体培养基 加入1.5%-2.0%琼脂，即成固体培养基 加8%琼脂，则成硬固体培养基
（二）培养基的配制原则
培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确） 自养微生物：培养基成分是无机物 异养型微生物：培养基成分必须含有机物
营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）
浓度过高——微生物的生长起抑制作用， 浓度过小——不能满足微生物生长的需要。 物理化学条件适宜（条件适宜） 根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）
明胶（GELATIN）
• 组成：多种氨基酸 • 来源：动物皮、骨、韧带煮熬 • 特性：
• 被许多微生物作为氮源而利用
• 明胶20℃凝固，28～35℃融化 • 适用面很窄：只能在20-25℃作凝固剂 • 但可用于特殊检验
硅胶（SILICA GEL）
• 无机硅酸钠(Na2SiO3)和硅酸钾(K2SiO3)与盐 酸和硫酸中和反应时凝结成的胶体 • 特性：
• 完全无机
• 硅胶一旦凝固后，就无法再融化 • 自养菌的研究分离：培养基的固化剂
固体培养基：菌落
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
半固体培养基：
无动力
有动力(弥散)
(是否运动)
3、按培养基的功能来分
• ⑴增殖培养基 • 在培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养 物质，以增加这种微生物的生长速度，逐渐淘汰 其他微生物。 • 如要分离到利用石蜡油进行发酵的酵母菌， 在培养基中加入石蜡油，就可达到目的。 • 此类培养基常用于菌种筛选。
3、砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→ 封口→保藏 措施：无营养、缺氧、干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：1~10年 4、冷冻干燥保藏 方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→ 低温冻结（-25— -40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→ 真空封口→检查真空度→保藏 措施：低温、干燥、缺氧、有保护剂 适用：各大类 保藏期：5~15年或更长
二、常用的菌种保藏方法 1、斜面保藏法 方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏 措施：低温4℃; 适用：各大类 保藏期：1~6个月 用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间 2、石蜡油封藏法 方法：斜面或半固体接种→培养→加无菌液 蜡高出培养基1cm→4~15℃保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期：1~2年
• 工业上重要的放线菌: • 龟裂链霉菌（土霉素）,金黄色链霉菌（金霉素）, 灰色链霉素（链霉素）,红链霉菌（红霉素）,红小 单胞菌（庆大霉素）,委内瑞拉链霉菌（氯霉素）, 卡那链霉菌（卡那霉素）
真菌
真菌是通过产生大量的孢子来繁殖后代的，霉菌的直立菌丝 顶端生有孢子，蘑菇的菌褶处也生有孢子，孢子随风飘散，在适 宜的环境条件下，能发育成一个新个体。单细胞的酵母菌还可进 行出芽生殖。孢子生殖和出芽生殖都是无性生殖。
• 有些培养基具有选择和鉴别双重作用。 • 麦康凯培养基：蛋白胨20g，乳糖10g， 牛胆酸盐1.5g，NaCl 5g，溴甲酚紫5ml溶 液，水1000ml。 • 胆盐能抑制革兰氏阳性菌（选择性）， • 乳糖，溴甲酚紫能帮助区别肠道菌和 肠道致病菌。
5、甘油悬液低温冷冻保藏法 方法：菌种培养→15~30%甘油缓冲液悬浮 →加入保藏管中→置-80℃冰箱保藏 措施：低温（-80℃）、保护剂（15%~50% 甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年 6、液氮保藏法 方法：菌种培养→保护剂悬浮→加入保藏 管中→置液氮瓶中 措施：超低温（-196℃）、保护剂 适用：各大类 保藏期：>15年
第二节 微生物培养
思考:
培养微生物需要解决的两个问题是什么？ 1、为其提供合适的营养条件和环境条件 培养基、培养条件
2、防止杂菌的入侵 无菌技术
(获得纯净培养物）
一、 微生物培养基（MEDIUM）
源自文库
• （一）培养基 • 定义：指人工配制的适合微生物生长繁殖或积累 代谢产物的营养基质。 • 不同微生物、不同的营养要求有不同的培养基 • 特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大 营养要素，且应比例适当，配成后须立即灭菌。 五要素：碳源、氮源、生长因子、无机盐和水
2、按培养基的物理状态来分
• ⑴液体培养基 • ⑵固体培养基
•
在培养基中加入凝固剂即为固 体培养基。常用凝固剂有琼脂、明 胶、硅胶等，以琼脂最为常用，一 般用量为1.5%-2%。
将少量的凝固剂加入液体培养 基，即为半固体培养基。琼脂的用 量在0.2%-1%之间。主要用于观察微 生物的动力，有时用来保藏菌种。
伊红美兰乳糖培养基(EOSIN METHYLENE BLUE)
蛋白胨 10g
乳糖
K2HPO4
5g
2g
伊红Y
美兰 水
0.4g
0.065g 1000ml
pH 7.2
EMB(EOSIN METHYLENE BLUE)
Left: Escherichia coli cells. Right: E. coli colonies on EMB Agar.
• （3）沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙 土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后 再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培 养后再转接斜面。 • （4）真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用75%酒精棉 花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水， 在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一 下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解 菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
微生物的活化及培养
2018年9月10日
细菌
工业上重要的细菌： G+：枯草芽孢杆菌、乳酸杆 菌等; G-： 醋酸杆菌、大肠杆菌。 产品：淀粉酶制剂，乳酸，乙酸，氨基酸等
细菌的结构
细菌的繁殖 细菌主要是以二分裂 的方式进行增殖（如 右图）
芽孢 有些细菌在一定
的条件下，细胞里面形 成一个椭圆形的休眠体， 叫做芽孢。芽孢的壁很 厚，对干旱、低温、高 温等恶劣的环境有很强 的抵抗力。（抗逆性极 强） 注：不是繁殖体