第十章 蛋白质沉淀法

在沉降过程中起主导作用(如在废水处理中)。 异向聚集：由Brownian运动所造成的碰撞导致。 同向聚集：而由对流运动所造成的碰撞导致。
9. 沉淀动力学
沉淀过程步骤：
A、初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合； B、晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒； C、扩散限制生长，晶核在Brownian扩散作用下生长，生成
早在50年前，Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇来完成蛋白质沉淀经 典实验的。他们应用低温乙醇分级沉淀人血浆的办法制备了白蛋白溶 液，并通过冷冻干燥将乙醇从成品中去除，所得产品成功地救治了 1941年珍珠港空袭后的幸存者。除此以外，免疫球蛋白、血纤维蛋白 原等其他许多蛋白质都是利用上述方法进行沉淀的。
1 概述
优点 A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有
利，收率越高； B、原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生产工艺、
降低生产费用； C、使中间产物保持在一个中性温和的环境； D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降
解，提高产物稳定性； E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的
最常用(NH4)2SO4。优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低， 在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。
次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。
5 盐析法
B、无机盐添加方式
5 盐析法
C、温度T T 影 响 Cohn 方 程 中 的 值 。
蛋白沉淀法与饮食文化
1）、豆腐的由来：“来其”、“黎其”，汉朝淮 南王刘安
2）、一人得道，鸡犬升天
问题
问题： A、1941-12-7, 7:59am
珍珠港事件 --- 烧伤 --- 蛋白流失，感染 B、急性肾炎 ----- 蛋白流失
人血清白蛋白
第十章 蛋白质沉淀法
1、概述 2、蛋白质溶解 3、蛋白质溶液的稳定因素 4、蛋白质沉淀方法分类 5、盐析法 6、|pH水 – pI| Value调节法 7、有机溶剂沉淀法 8、亲水聚合物沉淀法 9、沉淀动力学 10、Applications
式中, So为当（K/e2） 0 时S的外推值；e为水-有机 溶剂混合物的介电常数； K为常数(水的介电常数的 吸收系数)。
7 有机溶剂沉淀法
有机溶剂的种类：
丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。
机理：
A、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常 数降低，而使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝 集和沉淀。
1 概述
定义 常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量平 衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不溶性 颗粒，沉降析出。沉淀具有浓缩与分离的双重作 用。
与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化， 当然也存在化学反应的沉淀或结晶。
区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出， 沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。
B、有机溶剂使pro溶剂化，使原来与pro结合的水被溶剂所取代， 从而降低了pro溶解度。这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮 的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力强，也解释不了丙 酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变 性，而盐析脱水时不造成pro变性。
C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂， 可见作用有机溶剂使pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联。
限制因素降低到最少。
缺点： A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉
淀法所产品纯度通常都比结晶法低； B、过滤较困难
2 蛋白质溶解
蛋白质溶解：相似者相溶
aa的亲水性和疏水性：
有利因素：亲水性，包括氢键、极 性基团、离子化侧链、亲水aa所 占的%等。如白蛋白
不利因素：疏水性，包括暴露的疏 水基团、疏水aa所占的%等。如 纤维蛋白原。
B 、 “ β” 分 级 盐 析 法 ： 在一定I下，改变溶 液的pH值及温度达到 沉淀的目的。
C、应用：一般的初步 分离用第一种方法， 进一步纯化时用第二 种方法。
5 盐析法
影响因素
A、无机盐种类
感胶离子序(Hofmeister序列): In 1888 ， Hofmeister 对 一 系列盐沉淀蛋白质的能力 进行了测定研究。
9. 沉淀动力学
溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学 过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集 作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：
A、热运动（Brownian运动）； B、对流运动，由机械搅拌产生； C、差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。 第A、B两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第③种机理
T ， ；T ， 。 Why? 一般…， 现在…
D、溶液pH
5 盐析法
pH 影 响 Cohnx 方 程 中 的 值 。
见图
图有何用？
6 等电点沉淀法
等电点沉淀法中的pH值作用于 β值而隐含在Cohnx公式中， pI 值通 常 在 pH4~6 范 围内变 化，一般用无机酸（如盐酸、 磷酸和硫酸）作沉淀剂。
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亚微米大小的核，这一步速度很快； D、流动引起的生长，这些核通过对流传递（搅拌）引起的
碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在 较低的速度下进行的。 E、絮体的破碎，破碎取决于它们的大小、密度和机械阻力。 F、聚集体的陈化，在陈化过程中，絮体聚得大小和阻力平 衡。
10 Applications
阴离子排序为：柠檬酸根3- > 酒 石 酸 根 3- >F- > IO-3 > H2PO-4 > SO-4 > CH3COO> Cl- > ClO-3 > Br- > NO-3 > ClO-4 > I- > CNS-;
对阳离子排序为： Th4+ > Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
8 非离子型聚合物沉淀法
某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常用的是 PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合程度的产 品 都 是 有 效 的 ， 通 常 在 蛋 白 质 沉 淀 中 使 用 PEG-6000 或 PEG-4000。
B、[乙醇]：通常随[乙醇]上升，pro溶解度下降。如血纤维 蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当 乙醇浓度为40%时达到最小。
C、pH值：在确定了[乙醇]以后，pro最低溶解度出现在蛋白. 的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。
D、[pro]：避免使用很稀的浓度，因pro在高浓度下才较稳定。
3 蛋白质溶液的稳定因素
1)、水化层(hydration shell)
tight hydration shell(0.35g water/1g pro)
loose hydration shell(2g water /1g pro)
2)、静电排斥
zeta电势
Nernst Potential—胶核表面电位(不可测)
水化层
静电排斥
4 蛋白质沉淀方法分类
1）、盐析法 2）、有机溶剂沉淀法 3）、 |pH水 – pI| Value调节法 4）、亲水聚合物沉淀法 5）、聚电解质絮凝法 6）、高价金属离子沉淀法 7）、亲和沉淀法
5 盐析法
机理：A、zeta potential；B、hydration shell
5 盐析法
计算: Cohnx经验公式
式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)；I 为离子强度；m为盐的摩尔浓度； β值为蛋白质在纯水中(I=0时)的 假想溶解度对数值，是pH值和温 度的函数，在蛋白质pI时最小；Ks 为盐析常数，与温度和pH值无关。
5 盐析法
方法: A、 “Ks”分级盐析法：
在一定pH值及温度下， 改变盐浓度（即I） 达到沉淀的目的。
8. 非离子型聚合物沉淀法
优点： A、体系的温度只需控制在室温条件下； B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集； C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性； D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。
缺点： A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超
滤和液-液萃取来解决； B、价格较昂贵。
在蛋白质疏水性比较大和结合 水比较小时这种类型的沉淀 更有效。为了提高等电点法 的沉淀能力，常将其与盐析 法、有机溶剂法或其他沉淀 法一起使用。
最大缺点：无机酸会引起较大 的蛋白质不可逆变性的危险。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 有机溶剂沉淀法
同盐析一样，随着沉淀 剂——有机溶机浓度的上 升，蛋白质溶解度也呈指 数规律下降。
计算公式：
式中，S-溶解度；c-PEG浓度；β-常数，受溶液条件的影 响(如pH值和离子强度)；K-常数，由pro大小和PEG的类 型决定。
适应条件：上式适用性广，但在低浓度蛋白质，如1.5g/L和 高浓度蛋白质，如75g/L和150g/L时，实验结果会偏离线 性。这时方程需校正
8. 非离子型聚合物沉淀法
Stern Potential—(不可测)
Potential—滑面电位(可测,mobility)
电位
Nernst电位
ionic strength
3)、|pH水 – pI| Value |pH水 – pI| Value