基因工程

酵母菌的表达系统

生物工程一班

覃懿

学号：200810902058

内容摘要：

基因表达式是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术至北大的各种的目的基因的重组蛋白质，在分析基因表达的调控、基因结构与功能、基因治疗已经生物制药的领域均取得了令人阵风的成果。其中酵母表达系统拥有转录有加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外援蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。

关键词：酵母菌、表达、基因、系统

酵母的生长代谢特征与大肠杆菌有许多像是之处，但在基因表达调控模式尤其是转录水平上与原核细菌有着本质的区别，因此酵母菌是研究真核生物表达调控的理想模型。外源基因在酵母中高效表达的关键是选择高强度的启动子，改变受体细胞基因基底水平转录的控制系统。下面主要以酿酒酵母为例做阐述。

0．酵母菌表达体统的特点

首先酵母是真核生物，毒性比细菌小；其次酵母繁殖速度快，能进行高密度培养，并且能够耐受较高的流体净压，因此，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力；第三，酵母菌表达的外源蛋白可分泌到细胞外并可以使某些蛋白质糖基化而更加稳定，便于产品的分离纯化；第四，酵母菌（主要是酿酒酵母）的分子生物学研究已取得重大进展，已完成了基因组DNA的序列分析，它具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，因此，酵母作为基因工程的表达系统特别是在大分子真核生物基因表达方面得到日益广泛的应用]。自从Hitzeman等在1981年用酵母细胞表达人干扰素基因获得成功后，随后又成功地表达了其它多种原核和真核生物的基因[124]。

但是酵母表达系统也有其局限性。由于表达的外源蛋白的聚合体存在而影响产率；由于信号肽加工不完全、内部降解等因素造成表达产物结构上有差异的现象，即表达产物不均一现象，为酵母表达基因工程产物的纯化和工业化生产带来了困难。

1．酵母菌启动子的基本特征与选择

用于启动转录蛋白质的结构基因的酵母菌II型子有基本区域和调控区域两部分组成，基

本区包括TATA盒和转录起始位点。

在酿酒酵母中，转录起始位点位于TATA盒下游30~120bp的区域内，但非洲酒裂酵母的mRNA合成位点紧邻TATA盒，与高等真核生物的启动子结构十分相似。这两种来源的启动子在启的动基因转录方面具有交叉活性，但其转录起始位点的选择与宿主系细胞的性质密切相关。例如，非洲裂解酵母的基因在酿酒酵母细胞中的转录起始位点位于其正常转录起始位点的下游，而酿酒酵母的基因在非洲裂解酵母细胞的转录却在其TATA盒的邻近区域开始，也就是说，同一个基因的转录产物在两种宿主细胞中的大小并不一致，这种现象有可能直接影响mRNA的翻译过程，因此启动子与受体细胞之间的合理匹配对异源基因在酵母菌中的表达起着重要做用，一般而言，II型 mRNA聚合酶启动mRNA合成的最佳位点位于TATA盒下游40~140bp区域内。酵母菌启动子的调控区位于基本位于上游几百碱基对的区域内上游激活序列（UAS）和上游位阻序列（URS）等顺式元件组成。这些元件均为相应的反式蛋白调控因子的作用位点，并激活或关闭有TATA盒介导的基因转录，而反式蛋白调控因子的表达及其活性状态的该表又受到特异性分信号分子的影响，由此构成酵母菌基因表达的时空特意调控网络。

获得强启动子可以从已有的启动子中构建杂合启动子。例如，将酿酒酵母的乙醇脱氢酶II基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛—3—磷酸脱氢酶基因（GAP-DH）所属启动子的下游基因本区重组在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子。ADH2 启动子为葡萄糖阻遏并可用乙醇诱导，而GADPH启动子是酿酒酵母细胞中表达最强的组成型表达启动子。用这个杂合启动子表达人胰岛素与超氧化歧化酶的融合基因，克隆菌在富含葡萄糖的培养基上迅速生长，但不表达融合蛋白；当葡萄糖耗尽后，融合蛋白获得高效表达。

2．酵母菌启动子的可调控表达系统

外源基因的定时可控性表达对重组微生物高产异源蛋白至关重要，尤其当高浓度的表达产物对受体菌有毒性作用时，重组细胞必须在生长到一定密度后才能诱导外源基因的表达。目前广泛使用的酵母菌课控性启动子表达系统有半乳糖启动子（GAL）、酸性磷酸启动子（PHO）等。

（1）温度控制表达系统

酿酒酵母PHO5基因通常在培养基中游离磷酸盐耗尽时被诱导高效表达，将PHO5启动子与ɑD-干扰素基因重组，转化子在高磷酸盐的培养基中30℃迅速生长，当将之转移到不含磷酸盐的培养基中，其合成干扰素的能力提高100-200倍。PHO5基因的编码产物是PHO5基因表达的正调控子，其温度敏感性突变基因ph04TS的编码产物在35℃时失活，因此含有ph04TS-PHO5型启动子的克隆菌在35℃时能正常生长，但不表达外源基因。当培养温度下降到23℃时，ph04TS基因表达的正确调控因子促进PHO5启动子的转录启动活性，进而诱导其下游外源基因的表达。、

酿酒酵母的a型和α型两种单倍体由位于交配类型遗传位点的MATa和MATα等两个等位基因共同决定。

具有MATa-hmlα2-102-sir3-8TS基因型的酵母细胞在25℃培养时，应具有a交配类型，

因为此时仅有MATa基因能表达,hmlα2-102为Sir蛋白所阻遏；但当这种细胞生长在35℃时，MAT和HML均能表达，只有α2基因被阻遏，因此细胞呈现α交配类型。当外源基因于a特异性基因的启动子控制之下时，a交配型的受体细胞在25℃时可表达这基因，但在35℃式不表达；相反，如果外源基因与α特异性基因的启动子重组，则它仅在35℃时表达，而在25℃时不表达。

（2）超诱导表达系统

当酿酒酵母生长在无半乳糖或葡萄糖存在的培养基中时，其GAL1、GAL7、GAL10启动子受到阻遏；加入半乳糖或葡萄糖时，启动子活性被诱导1000倍。

半乳糖的诱导作用与GAL4基因和GAL80蛋白质的性质密切相关，GAL4编码一种调控蛋白，能与GAL1、GAL7、GAL10启动子上游的UAS特异性结合，GAL80蛋白则是GAL4因子的拮抗剂。在一般情况下，GAL4基因表达的水平较低，限制了半乳糖诱导作用的程度，这种情况当外源基因克隆在含有半乳糖的启动子的多拷贝质粒上时表现的尤为突出。在此系统中过量表达原来属于组成型表达的GAL4基因并不能解决问题，因此此时GAL启动子已转入组成型表达状态。

将野生型的GAL4基因置于GAL10启动子调控之下，并将这个基因表达序列整合在酿酒酵母的染色体DNA上，可以提高半乳糖的诱导效果。

3．外源基因在酵母菌中表达的限制性因素

(1)重组异源蛋白低产率的主要原因是稳定态的mRNA的水平降低，而非表达产物的产物的不稳定性。例如将α-干扰素基因插在野生型PGK表达单元内部，即PKG结构基因终止密码子下游处16bp处，则融合基因转录出的mRNA中含有人α-干扰素的编码序列。

（3）mRNA的翻译活性是外源就基因低水平表达的第二大限制因素。

（4）密码子的偏爱性控制基因表达的产物丰度模式在真核生物细胞中也相当普遍。在酿酒酵母中，高丰度蛋白质中96%以上的氨基酸参加是有25个密码子编码的，它们对应于异常活跃的高组分tRNA，而为第组分tRNA识别的密码子基本上不使用。利用DNA技术将野生型PKG基因中的高成分密码子分别更换使用频率较低的兼并密码子，则突变基因表达水平的降低程度与突变密码子占编码序列中密码子总的比例成正相关，其中更换164个密码子PKG突变基因的表达水平比野生型的PKG下降为10%。

（5）在使用酵母菌启动子和终止子等基因表达调控元件的前提下，异源基因的表达水平与稳定态mRNA的半衰期密切相关。如果外源基因mRNA的半衰期足够长，那么即便它含有许多对于与酵母菌低成分tRNA密码子，受影响的只是重组异源蛋白的合成速率，不至于大幅度降低蛋白质最终含量。但外源基因在酵母菌中的低效率表达恰恰表现其mRNA 不稳定性上。外源基因在较短的半衰期内，由于密码子与tRNA的不对应性，蛋白质的生物合成速率下降，导致最终异源蛋白的合成总量减少。

酵母菌PKG基因mRNA的半衰期随着简并密码子的更换程度而缩短，含有164个突变