细胞器线粒体的分离与观察

细胞器线粒体的分离与观察

高熹1120152430（李安一）

（北京理工大学生命学院16121501班）

摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。

关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。

1 引言

差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。

制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。

悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。

线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。

Giemsa染液为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。

2 实验器材及材料

2.1 实验材料

大鼠肝脏。

2.2 实验仪器

高速离心机，解剖刀剪，小烧杯，冰浴盘，漏斗，尼龙织物，玻璃均浆器。

图1 玻璃匀浆器

玻璃匀浆器的作用：让玻璃管与柱塞之间微小的缝隙和细微的凹凸咬合,将其柱塞转动时,产生碾切作用,使生物细胞和其他较硬的细胞组织被轻易的碾碎。

（1）洗干净，烘干，太脏用酸泡洗。

（2）选择合适的匀浆缓冲液,配置好。

（3）在冰上匀浆,匀的次数依实验样品和目的而定。

（4）匀浆完毕,倒出样品。

2.3 实验试剂

（1）生理盐水。

（2）1％詹纳斯绿B染液，生理盐水配制。

（3）蔗糖－Tris盐酸缓冲液（pH7.4）:0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）,0.1mol/L Tris10ml,0.1mol/L盐酸8.4m,加重蒸水到100ml,加蔗糖到0.25mol/L。蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖,0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）配制如上，加蔗糖到0.34mol/L。

（4）固定液：甲醇－冰醋酸（9：1）。

（5）Giemsa染液：Giemsa粉0.5g，甘油33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内，研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56左右保温2h，令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕色瓶中。用时吸出少量用1/15mol/L磷酸缓冲液作10～20倍稀释。1/15mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）：

1/15mol/L KH

2PO

4

50ml,1/15mol/L Na

2

HPO

4

50ml。

3实验步骤

（1）制备大鼠肝脏细胞匀浆

实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0～4°C的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0~4°C条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆，蔗糖溶液分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。

（2）先将9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心的加入9ml肝匀浆使其覆盖在上层。用冷冻控温高速离心机按照图2顺序进行差速离心。

图2差速离心顺序图

（3）分离物鉴定

细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，在甲醇－冰醋酸溶液中固定15min，充分吹干，滴Giemsa染液（原液10～20倍稀释）染色10分钟。自来水冲洗，吹干，镜检。观察结果。

线粒体：取线粒体沉淀涂片，注意勿太浓密，不待干即滴加1％詹纳斯绿B 染液染色20min，盖上盖玻片镜检。观察结果。

4实验结果

图3 细胞核染色观察图

图4 细胞核染色局部放大图

图5 线粒体染色观察图

图6 线粒体染色局部放大图

图7 借鉴线粒体染色图

5结果分析

图3和图4中我们可以清楚的看到分离成单个的被染成紫颜色的细胞核，易于辨认。而在线粒体染色图5和图6中，线粒体染色可能出现了实验失败，无明显可辨的染色后的线粒体。在图7借鉴的照片中，我们可以看见成单颗装椭圆形的线粒体。

6实验反思

本次实验成败关键在于推片，即制作临时涂片时，可取一片载玻片作推片，将推片自液滴左侧向右侧移动，使液滴均匀地附着在两片之间。细胞核的推片和染色较为成功，可以观察到较好的结果。而线粒体组观察较为模糊不清，分析原因为，染色时候，滴加染液后只计时，没有时刻保持观察样品，室内温度较高，导致染色液干结，干结后影响了观察。后来又用清水冲洗玻片，未有明显改善。

综上，由线粒体染色中较为失败的玻片得出反思，以后实验耗时较长又无需操作的步骤不能放任不管，要时刻观察，避免出现该次试验中染色液变干这种情况的发生。

7参考文献

[1]李万杰, 胡康棣. 实验室常用离心技术与应用[J]. 生物学通报, 2015, 50(4):10-12.

[2]辛华. 细胞生物学实验[M]. 科学出版社, 2001.

[3]王崇英, 高清祥. 细胞生物学实验[M]. 高等教育出版社, 2011.