血管性血友病因子裂解酶抗原及活性与年龄及性别的关系分析

血管性血友病因子裂解酶抗原及活性与年龄及性别

的关系分析1

董宁征，季顺东，阮长耿

苏州大学附属第一医院，江苏苏州（215006）

E-mail：changgengruan@

摘要：目的：通过检测健康体检者血浆中ADAMTS13的抗原及活性，比较不同性别和年龄组间ADAMT13的抗原及活性的差别，分析ADAMTS13与年龄及性别的关系，为ADAMTS13相关疾病的判断提供依据。方法：用Frests-VWF73试剂盒检测血浆中ADAMTS13的活性；用夹心酶联免疫反应试剂盒（ELISA）检测ADAMTS13抗原含量。结果：各年龄组ADMATS13 的活性均值无显著差异；而ADAMTS13抗原量随年龄的改变而改变，21-40岁年龄组最高，为109.7 ± 23.3 % ，在60岁以上组及低龄组（16-20岁）显著降低；ADAMTS13的抗原及活性水平在男女性别间无显著差异。

关键词：血管性血友病因子裂解酶; 抗原; 活性；年龄；性别

血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13) 是一种调控血管性血友病因子（vWF）结构与功能的金属蛋白酶，其作用于vWFA2区 842位酪氨酸与843 位蛋氨酸之间的肽键，将VWF 单体裂解为相对分子量为170 × 103和140 × 103的两个片段[1]。

ADAMTS13活性的变化与多种生理病理状态下相关，ADAMTS13活性的缺乏，系血栓性血小板减少性紫癜（TTP）发病的主要机制，也是诊断TTP的重要标准。ADAMTS13抗原及活性在不同年龄正常人群的分布情况，及其与性别的关系，国内外研究资料甚少，国外仅有文献报道ADAMTS13活性与年龄的关系[2]。本文旨在研究ADAMTS13与年龄及性别的关系，为临床疾病的判断提供依据。

1. 对象及方法

1.1 研究对象

健康体检者共 87 例，年龄l6～78岁，平均年龄(45.3±21.4)岁；男性44例，年龄16～78岁，平均(45.0±21.6)岁；女性43例，年龄l7～75岁，平均年龄(42.6±21.2) 岁，均无血栓性疾病史。正常人混合血浆取自40例献血员。

1.2方法

1.2.1 血样标本采集和保存:

取静脉血, 使用0.129mol/L的枸橼酸钠抗凝，采集后均3000rpm离心5分钟，分离血浆，分装后冻存-30℃备用。

1.2.2 ADAMTS13 活性的测定[3]

应用Frets-VWF73试剂盒（购自日本Peptide Institute）检测ADAMTS13的活性。根据试剂盒使用说明进行操作，使用前依次加入37µl DMSO和117µl水溶解荧光标记的ADAMTS13底物Frets-VWF73，用反应缓冲液（5 mM Bis-Tris, 25mM CaCl2, 0.05%Tween-20,

1本课题得到国家自然科学基金资助项目（30470732）教育部博士点基金（k5122501）苏州大学附属第一医院血液学“135工程”重点学科开放课题基金（135XY0406）的资助。

pH 6.0）稀释正常人混合血浆和待测样本（1:25稀释），加入96孔板，每孔100 µl，随后每孔再加入100µl的底物（终浓度为2 µM）。检测荧光，连续检测１h,每5分钟测一次。以不同比例稀释的正常人混合血浆作标准曲线，计算待测样品ADAMTS13的活性水平。

1.2.3 ADAMTS13抗原的测定[4]

用三抗体夹心ELISA法（试剂盒由比利时Leuven大学血栓研究室提供）检测ADAMTS13抗原水平。具体方法如下，使用抗ADAMTS13单克隆抗体2G3（4µg/ml）包被96孔板，4℃过夜。以一定比例稀释的正常人混合血浆作标准曲线。50µl患者血浆按1/4，1/8，1/16稀释，加入每孔。37℃孵育1h。一抗为2株生物素标记的抗ADAMTS13单克隆抗体13F7、8C10，混合后浓度1µg/ml，室温孵育1h。加1/15000稀释的辣根过氧化物酶标记的Avidin（Sigma公司，美国），室温孵育1小时。使用邻苯二胺显色。1.5M的硫酸终止反应。酶标仪读取490nm条件下的吸光度值。计算待测样品ADAMTS13的抗原水平。

1.2.4 统计学方法

以SPSS6.0 软件, 以ANOV A进行组间比较检验, 各组结果以⎯x ± s 表示。

2.结果

2.1 不同年龄组正常人血浆中ADAMTS13抗原和活性的测定

87例健康体检者中， ADAMTS13抗原最低值为60.8 % mU/ml，最高值为141.%，平均值为90.8 ± 24.2%；活性平均值为82.1± 14.8 %，最低值为 46.3%，最高值为119.0%。正常人群中ADAMTS13抗原及活性均无极端值出现。

不同年龄组人群血浆中ADAMTS13的抗原及活性测定结果见表1及图1。各年龄组ADMATS13 的活性均值无显著差异；而ADAMTS13抗原量随年龄的改变而改变，21-40岁年龄组达到最高值109.7 ± 23.3 % ，在60岁以上组及低龄组（16-20岁）抗原量显著降低,与21-40岁年龄组相比，差异显著，p<0.01。

表1：不同年龄组正常人血浆中ADAMTS13抗原和活性（⎯x±s）

年龄组例数 ADAMTS13活性 %ADAMTS13抗原 %

16 - 20 20 80.8 ± 15.9 76.0 ± 12.8△△

21 - 40 29 81.1 ± 14.3 109.7 ± 23.3

41 - 60 15 77.9 ± 16.7 99.3 ± 22.4

> 60 23 87.3 ± 12.4 74.5 ± 11.4 △△△△与21-40岁年龄组相比p＜0.01，差异显著。

Fig1: ADAMTS13 antigen and activity in different age groups

**与21-40岁年龄组相比p＜0.01，差异显著。

2.2 不同性别组血浆中ADAMTS13抗原和活性的测定

ADAMTS13抗原量及活性水平与性别的关系见图2，男性血浆中ADAMT13的抗原及活性水平均分别为87.1 ± 21.9 % 和80.8 ± 14.3 %，低于女性人群（抗原和活性分别为94.7 ±26.8 % 和86.1 ± 17.2 %，但性别间的差异无统计学意义。

Fig. 2 . ADAMTS13 antigen and activity in females and males

3. 讨论

ADAMTS13活性的改变见于多种生理及病理条件，活性明显降低见于大部分TTP患者（ADAMTS13基因突变或机体产生抗ADAMTS13的抗体），新生儿、肝炎、慢性肾功能不全、急性炎症、外科大手术后及老年人也可见ADAMTA13活性的降低[2]，其活性的增高见于ITP患者[5]。而ADAMTS13抗原的变化仅见于遗传性及获得性TTP患者[6]。不同年龄组