第二章 基因工程的基本原理
基因工程基本原理
基因工程基本原理
基因工程是通过改变生物体的基因组来实现对其性状的调控的技术。
其基本原理包括以下几个步骤：
1. 基因选择：从目标生物体中选择具有所需性状的基因。
2. 基因克隆：将目标基因从生物体中分离出来，通常通过
PCR等方法进行基因扩增。
3. 基因构建：将目标基因插入到载体DNA中，构建重组DNA。
载体可以是细菌、酵母或其他生物的染色体片段，一
般被称为质粒。
4. 基因转导：将重组DNA导入到宿主生物体中。
这通常使用
基因枪、电穿孔和细菌介导等技术来实现。
5. 检验与筛选：对转导后的宿主生物进行筛选，确认目标基因达到预期效果。
这可能需要对基因表达进行检测，例如通过PCR、基因表达测定等方法。
6. 基因表达：在宿主生物中，目标基因会被表达为蛋白质，进而影响其性状。
这可能需要使用特定的启动子、RBS和终止
子等元件来调控基因表达水平。
基因工程的基本原理就是通过这些步骤来实现对基因组的改造，从而达到人为调控生物性状的目的。
这项技术在农业、医学和
生物工程等领域有广泛应用，例如改良植物品种、生产特定药物和生物材料等。
《生物技术概论》1基因工程
二、目的DNA片段的获得
（三）DNA片段的化学合成 1.合成引物 2.合成DNA寡核苷酸连杆 3.合成基因片段
第二节 DNA重组
三、DNA片段的连接
（一）DNA连接酶 （二）DNA片段之间的连接 1. 互补黏性末端片段之间的连接 2.平末端DNA片段之间的连接 3.DNA片段末端修饰后进行连接 4. DNA片段加连杆或衔接头后连接
（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下 一代
第一节 基因工程概述
三、基因工程操作的基本技术路线
第一节 基因工程概述
四、基因工程研究最突出的优点
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物 之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆 菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动 植物中表达。
第二章 基因工程
第一节 基因工程概述
一、基因工程的含义
按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种 性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创 造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含 义。
第一节 基因工程概述
二、基因工程研究的理论依据
（一）不同基因具有相同的物质基础 （二）基因是可以切割的 （三）基因是可以转移的 （四）多肽与基因之间存在对应关系 （五）遗传密码是通用的
质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体 基因组和叶绿体基因组也有少量的基因
第四节 目的基因的制备
二、分离目的基因的途径
（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离 目的基因
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
基因工程的原理与应用例题和知识点总结
基因工程的原理与应用例题和知识点总结基因工程，这个听起来充满科技感的词汇，其实已经在我们的生活中发挥着越来越重要的作用。
它就像是一把神奇的钥匙，打开了生命奥秘的大门，让我们有能力对生物的基因进行改造和重组，从而实现各种奇妙的目标。
接下来，让我们一起深入了解基因工程的原理，并通过一些例题来巩固知识，同时总结其广泛的应用。
一、基因工程的原理基因工程，简单来说，就是在分子水平上对基因进行操作的技术。
它基于几个关键的原理：首先是“中心法则”。
我们知道，遗传信息从 DNA 传递到 RNA，再从 RNA 翻译成蛋白质，这是生命遗传信息传递的基本规律。
基因工程就是要在这个过程中进行干预。
其次，基因是具有特定碱基序列的 DNA 片段。
通过特定的工具，我们能够识别、切割和连接这些片段。
再者，不同生物的基因具有相同的化学本质，这意味着我们可以将一种生物的基因转移到另一种生物中，并使其发挥作用。
而实现基因工程操作的关键工具包括限制酶、DNA 连接酶和载体。
限制酶能够识别特定的碱基序列，并在特定的位点切割 DNA 分子；DNA 连接酶则负责将切割后的 DNA 片段连接起来；载体，如质粒、噬菌体等，能够将目的基因运送到受体细胞中。
二、基因工程的例题为了更好地理解基因工程的原理，让我们来看几个例题。
例 1：假设我们要从一种细菌中获取一个具有抗药性的基因，并将其转移到一种植物细胞中，使其获得抗药性。
首先，我们需要使用特定的限制酶来切割含有抗药基因的细菌 DNA 和植物细胞的 DNA。
然后，用 DNA 连接酶将抗药基因与植物细胞的 DNA 连接起来。
最后，通过适当的方法将重组后的 DNA 导入植物细胞。
例 2：给定一段 DNA 序列，要求找出可能的限制酶切割位点。
这就需要我们熟悉常见限制酶的识别序列，并运用相关知识进行分析。
三、基因工程的应用基因工程的应用范围极其广泛，给人类带来了诸多的好处。
在农业领域，基因工程使得我们能够培育出具有优良性状的农作物。
第二章.基因工程主要技术原理-研究DNA-蛋白质互作的方法
2.6.2 DNasel足迹试验 尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的DNA蛋白质之间 相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准确部 位 。 要 解 答 这 个 问 题 ， 则 需 要 应 用 DNasel 足 迹 试 验 （footprinting assay）。它是一类用于检测与特定蛋白质结合
切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一 种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这 一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长 度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质 结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形 象地称之为“足迹” 。基Βιβλιοθήκη 工程第二章 基因工程技术原理
基因工程
第二章 基因工程技术原理
足迹试验的优点 可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段 之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹试 验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间 的结合位点的分布状况。如同凝胶阻滞试验一样，也可以 加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核 酸序列的特异性。
基因工程
第二章 基因工程技术原理
2.6.4 体内足迹试验
上面所讨论的这三种方法有一个共同的不足之处，即它们都是在体外进 行的试验。因此人们自然会问，这些结果能够确切地反映活细胞内发生 的DNA一蛋白质相互作用的真实情况吗？为了解答这个问题，科学工作 者又设计出了一种体内足迹试验体系。然而究其实质而言，这种技术无
使用竞争DNA，可间接阐明体内的DNA与蛋白质的相互作用。如，使用 一种具有与已知转录因子结合位点的竞争DNA，就可以判断检测到的蛋白 质是否属于此类转录因子，或是与之相关的其它转录因子；如果事先引入 突变，可以检测突变对其与转录因子结合作用的影响。
基因工程的基本原理和技术ppt课件
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
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⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。
粘质沙雷氏杆菌 SmaⅠ（Serratia marcesens）
大肠杆菌 EcoRⅠ （Escherichia coli R）
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T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
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③类型：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
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寻根问底
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
摩尔根证明基因在染色体上，并提出基
因的连锁互换定律。
11
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从
一种生物个体转移到另一种生物个体。
12
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。13
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
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课堂练习
2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
47C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
《基因工程的原理》 讲义
《基因工程的原理》讲义一、什么是基因工程基因工程，简单来说，就是一种在分子水平上对基因进行操作的技术。
它就像是一个极其精细的“基因手术”，通过一系列的技术手段，对生物体的基因进行剪切、拼接、重组和改造，从而实现对生物遗传特性的定向改变。
要理解基因工程，首先得知道基因是什么。
基因是具有遗传效应的DNA 片段，它就像一个神秘的密码本，决定了生物体的各种性状，比如我们的外貌、身高、性格，甚至是容易患上某些疾病的倾向。
而基因工程的出现，让我们有了主动去解读和改写这个“密码本”的能力。
不再是被动地接受自然的遗传安排，而是能够按照我们的意愿，去塑造和优化生物的特性。
二、基因工程的基本工具就像进行任何一项复杂的工程都需要特定的工具一样，基因工程也有它必不可少的“工具包”。
1、限制性内切酶限制性内切酶，也被形象地称为“分子剪刀”。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
就好像一把精准的剪刀，能够在长长的 DNA 链条上找到我们想要的位置，然后干净利落地剪断。
不同的限制性内切酶识别的核苷酸序列是不一样的，这就为我们在基因操作中提供了多种选择，能够根据具体的需求来剪切 DNA。
2、 DNA 连接酶有了剪断的操作，自然还需要把断开的 DNA 片段重新连接起来。
这时候就轮到 DNA 连接酶登场了，它像是一个“基因胶水”，能够把两个具有相同末端的DNA 片段连接在一起，形成一个完整的DNA 分子。
3、运载体当我们把想要的基因片段剪切并连接好之后，还需要一个“运输工具”把它们送到目标细胞中去，这个“运输工具”就是运载体。
常见的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
运载体就像是一辆辆小货车，它们能够携带我们精心准备的基因片段，顺利地进入到受体细胞中，并且能够在受体细胞中稳定地存在和复制。
三、基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获取这是基因工程的第一步，也是关键的一步。
目的基因就是我们想要的那段具有特定功能的基因。
八年级生物下册_第七单元第二章第一节《基因工程》课件_济南版
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
转基因技术有哪些优点？(应用)
1、可以定向的改良作物和家畜的品种。
2、可以提高作物的抗虫害能力。
3、可以改变作物的营养成分。 4、可以生产其他药物。
人工合成胰岛素
胰岛素从猪、牛等动物的胰 腺中提取，100Kg胰腺只能提 取4-5g的胰岛素，其产量之低 和价格之高可想而知。 将合成的胰岛素基因导入大 肠杆菌，每2000L培养液就能 产生100g胰岛素！使其价格 降低了30%-50%!
1.获得目的基因（人的生长激素基因) 2.让目的基因与载体（细菌的环状 DNA)巧妙拼接； 3.再把含有目的基因的DNA导入受体 细胞（细菌细胞）； 4.目的基因控制的性状在受体生物的身 上成功表达。（细菌能产生生长激素）
1.基因工程药品 —— 生长激素 治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射 生长激素。而生长激素的获得很困难。以前， 要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底 部摘取垂体，并从中提取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的生长激 素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。 人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长 激素，相当于6万具尸体的全部产量。
转基因西红柿
转基因驱蚊草
基因工程的原理
观察与思考 我们知道生长激素具有促进人体 生长的作用，可以用来治疗侏儒 症。科学家把人的激素基因导入 细菌，从而形成了能够生产生长 激素的“工程菌”
获得目的基因 目的 基因 与运 载体 结合
筛选
大量培养 将含目的基因的DNA分子导入受体细胞
工程菌的培育步骤
2.基因工程药品 —— 干扰素 干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖 蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感 染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对 治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。 传统的干扰素生产方法是从人血液中的 白细胞内提取，每300L血液只能提取出1mg 干扰素。1980~1982年，科学家用基因工程 方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰 素，是传统的生产量的12万倍。1987年上述 干扰素大量投放市场。
《基因工程的原理》PPT课件
是
。
⑸由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是
否出现进药行用抗蛋原白—，抗在体分杂子交水如平果上出的现检杂测交方带法，及表结明果奶是牛什中出现了 么? 抗原蛋白；不出现杂交带，表明奶牛中未出现抗原蛋白
。 ⑹要确定目的让的害基虫因吞（食抗棉虫花基叶因，）观导察入害棉虫花是细否胞具后有，抗是虫否性能状
一、 目的基因的获得
1、目的基因：
在基因操作中使用的外源基因。它是编 码蛋白质的结构基因，如胰岛素基因、 干扰素基因。
2、获得目的基因的方法：
（1）直接分离法—— a.鸟枪法
（2）人工合成法 b.反转录法 c.化射击法）
①分离程序：用限制性内切酶将完 整的DNA分子切成适当长度的片段， 然后通过检测的方法挑选出所需要 的基因。
B、具有多个限制酶切点，以便于目的基 因的表达
C．具有某些标记基因，以便为目的基因 的表达提供条件
D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存， 以便于进行筛选
4、质粒是基因工程最常见的载体，它的 主要特点是( )
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小 ④是蛋白质 ⑤是环状RNA ⑥是环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
想一想需要哪些工具呢？
普通棉花
抗虫棉
探究1：基因工程的基本工具是什么？
一、 基因手术刀：限制性内切酶 二、基因缝纫针：DNA连接酶 三、基因运输车：载体
一、 基因手术刀：限制性内切酶
1、来源： 主要从原核生物中分离纯化 2、功能：（1）识别特定的脱氧核苷酸序列（回文
序列）；（2）并在特异性位点把双链 DNA分子“切割”开。
第一节 基因工程的原理
乳汁中含有人生长激素的 转基因牛(阿根廷)
基因工程DNA的重组概技术念或基因拼接技术
基因工程的基本原理
基因工程的基本原理基因工程的基本原理是在分子水平上直接操作遗传物质，通过改变生物体的基因组成，以获得人们所需的新性状或新产品。
这一技术的核心是DNA重组技术，即将所需的目的基因从供体生物的基因组中分离出来，经过必要的加工和处理后，与载体DNA连接，形成重组DNA分子。
然后将重组DNA分子引入受体细胞，通过筛选和鉴定，获得稳定表达目的基因的重组体克隆。
最后，通过对目的基因的表达和产物的纯化，获得所需的新产品或新性状。
基因工程的基本原理可以概括为以下几个步骤：获得目的基因：这是基因工程的第一步，需要从供体生物的基因组中分离出所需的目的基因。
常用的方法包括化学合成法、PCR扩增法、基因文库筛选法等。
构建重组DNA分子：将目的基因与载体DNA连接，形成重组DNA分子。
载体通常是一种能够自主复制的DNA分子，如质粒、病毒等。
连接过程需要用到限制性内切酶和DNA连接酶等工具酶。
引入受体细胞：将重组DNA分子引入受体细胞，常用的方法包括转化、转染、感染等。
受体细胞可以是原核生物、真核生物或细胞系等。
筛选与鉴定重组体克隆：通过选择性培养基或分子生物学方法，筛选出含有重组DNA 分子的细胞克隆，并进行鉴定。
鉴定方法包括PCR、测序、Southern杂交等。
目的基因的表达与产物纯化：在鉴定出正确的重组体克隆后，需要通过诱导表达或组成型表达等方式，使目的基因在受体细胞中表达。
然后通过对表达产物的分离纯化，获得所需的新产品或新性状。
总之，基因工程是一种在分子水平上直接改造遗传物质的技术，通过改变生物体的基因组成，实现对其性状和功能的定向改造和优化。
这一技术在医学、农业、工业等领域都有广泛的应用前景。
基因工程的原理和技术
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
3、将重组DNA导入受体细胞
转化
• 常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
（1）将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法
（2）将重组DNA导入动物细胞
④利用PCR技术
⑤利用DNA转录
⑥人工合成
A．①②③⑤
B．①②⑤⑥
C．①②③④
D．①②④⑥
3.基因工程又叫基因拼接技术。
(1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之 一是：以目的基因转录的 信使RNA为模板，逆转录 成互 补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA(目的。基因)
(2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、动植物细。胞
显微注射技术
提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵
受精卵移植
1.将重组DNA导入植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法
2.将重组DNA导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效） 3.将重组DNA导入微生物细胞 Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。
目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成 后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是 普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。
②检测目的基因是否转录出了mRNA
方法: 分 子 杂 交
过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂 交带,表明目的基因转录出了mRNA.
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定等
基
基因工程基本原理
基因工程基本原理基因工程是一种利用基因技术改造生物体的方法，包括对生物体的遗传物质基因进行精确修改和重组，以改变其特性和功能。
基因工程的基本原理涉及到DNA的分离、修饰、转化、检测和表达等技术。
下面我将详细介绍基因工程的基本原理。
分离出的目的基因可以进行进一步的修饰。
修饰包括剪切、连接和修复DNA序列，以生成所需的基因构建。
剪切是通过酶切将DNA分子切割成互补的片段，连接是使用连接酶将两个DNA片段连接在一起，修复是通过DNA修复酶修复DNA序列上的缺失或错位。
修饰完成后，通过转化将基因导入到宿主细胞中。
转化的方法有多种，包括化学法、电穿孔法和冷冻法等。
其中，最常见的方法是利用质粒载体将目的基因导入宿主细胞。
质粒是小圆环DNA，可以在细胞中独立复制，并且可以携带外源基因。
通过质粒载体，基因可以进入宿主细胞并被细胞识别和利用。
转化后，需要对转化的细胞进行筛选和检测，以确认是否成功导入了目的基因。
筛选的方法依赖于已导入的目的基因和质粒载体的选择标记。
例如，如果质粒携带了抗生素抗性基因，筛选过程可以通过将细胞培养在含有抗生素的培养基上进行。
检测包括PCR扩增目的基因片段和测序确认等。
最后，导入的基因需要在宿主细胞中表达出来。
在细胞中进行基因表达需要使用相应的启动子、终止子和调控子等调控元件，以确保基因在合适的时间和条件下进行表达。
调控元件通常是与特定的组织类型和环境适应性相关的DNA序列。
通过启动子，目的基因可以在细胞内转录成RNA，然后通过翻译过程转化为蛋白质，从而达到所需的功能或特性。
总之，基因工程通过基因的分离、修饰、转化、检测和表达等步骤，使得科学家能够精确地对生物体的遗传物质进行修改和重组，以改变其特性和功能。
基因工程的原理和技术提供了一种强大的工具，可以用于生物学研究、药物开发、农业改良和环境保护等领域。
《生物技术制药》理论课教案
《生物技术制药》理论课教案第一章：生物技术制药简介1.1 生物技术制药的定义与发展历程1.2 生物技术制药的分类及特点1.3 生物技术制药的重要性及发展趋势1.4 案例分析：我国生物技术制药的现状与展望第二章：基因工程制药技术2.1 基因工程的基本原理2.2 基因克隆与表达2.3 重组蛋白药物的制备与纯化2.4 基因工程在制药领域的应用实例第三章：细胞工程制药技术3.1 细胞工程的基本原理3.2 细胞培养技术3.3 细胞融合与杂交瘤技术3.4 细胞工程在制药领域的应用实例第四章：蛋白质工程制药技术4.1 蛋白质工程的基本原理4.2 蛋白质结构与功能的关系4.3 蛋白质工程在药物设计中的应用4.4 蛋白质工程制药技术的应用实例第五章：抗体工程制药技术5.1 抗体概述5.2 抗体的结构与分类5.3 抗体工程的基本原理5.4 抗体工程制药技术的应用实例第六章：发酵工程制药技术6.1 发酵工程的基本原理6.2 微生物培养与发酵过程优化6.3 发酵工程在制药中的应用实例6.4 现代发酵工程技术的发展趋势第七章：酶工程制药技术7.1 酶工程的基本原理7.2 酶的分离、纯化与改性7.3 酶工程在制药中的应用实例7.4 酶工程制药技术的发展趋势第八章：生物信息学在制药中的应用8.1 生物信息学的基本概念8.2 生物信息学在药物发现与设计中的应用8.3 生物信息学技术的最新进展及未来发展方向8.4 案例分析：生物信息学在生物技术制药中的应用实例第九章：生物技术制药的质量控制与安全性评价9.1 生物技术制药的质量控制要点9.2 生物制品的安全性评价9.3 生物技术制药的监管政策与法规9.4 案例分析：生物技术制药质量控制与安全性评价的实际操作第十章：生物技术制药产业现状与发展前景10.1 生物技术制药产业的现状10.2 生物技术制药产业链的发展10.3 我国生物技术制药产业的挑战与机遇10.4 未来生物技术制药的发展趋势与展望第十一章：生物药物的临床应用与治疗策略11.1 生物药物的分类及临床应用领域11.2 生物药物的治疗策略与给药方式11.3 生物药物的临床疗效评估与监测11.4 案例分析：生物药物在特定疾病治疗中的应用第十二章：生物技术制药的知识产权与商业化12.1 生物技术制药的知识产权保护12.2 生物技术制药的商业化过程12.3 生物技术制药企业的商业模式与战略12.4 案例分析：生物技术制药知识产权与商业化的成功案例第十三章：生物药物的研发与注册13.1 生物药物研发的流程与关键环节13.2 生物药物的临床试验设计与实施13.3 生物药物注册审批的过程与要求13.4 案例分析：生物药物研发与注册的实际操作第十四章：生物药物的储存与运输14.1 生物药物的稳定性要求14.2 生物药物的储存条件与技术14.3 生物药物的运输管理与风险控制14.4 案例分析：生物药物储存与运输的最佳实践第十五章：未来生物技术制药的挑战与机遇15.1 生物技术制药的技术挑战与创新方向15.2 生物技术制药的伦理、法律与社会问题15.3 生物技术制药在全球竞争中的地位与作用15.4 案例分析：未来生物技术制药的发展趋势与展望重点和难点解析本文档为《生物技术制药》理论课的教案，共包含十五个章节，涵盖了生物技术制药的概述、基因工程、细胞工程、蛋白质工程、抗体工程、发酵工程、酶工程、生物信息学、质量控制、安全性评价、产业现状和发展前景等方面的内容。
基因工程基本原理
基因工程基本原理基因工程是一门涉及生物学、遗传学、分子生物学和生物化学等多学科知识的前沿科学，它的发展和应用对人类社会的发展和进步具有重要的意义。
基因工程的基本原理主要包括基因的克隆、基因的表达和基因的编辑三个方面。
首先，基因的克隆是基因工程的重要基本原理之一。
基因的克隆是指将感兴趣的基因从其原有的生物体中分离出来，并通过体外的方法进行复制和扩增。
这一过程需要利用DNA重组技术，将目标基因插入到适当的载体DNA中，然后将这个重组的DNA导入到宿主细胞中，使其进行复制和扩增。
通过基因的克隆，科学家们可以获得大量目标基因的复制体，为后续的基因研究和应用奠定了基础。
其次，基因的表达是基因工程的另一个重要基本原理。
基因的表达是指在宿主细胞中使目标基因得以表达，从而产生所需的蛋白质或RNA。
为了实现基因的表达，科学家们需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并将其导入到宿主细胞中。
在宿主细胞内，目标基因会受到细胞内的调控机制的影响，最终产生出所需的蛋白质或RNA。
基因的表达是基因工程技术在生物医药、农业和工业等领域得以应用的重要基础。
最后，基因的编辑是基因工程的又一重要基本原理。
基因的编辑是指利用特定的技术手段对目标基因进行精确的修饰和改变。
目前，常用的基因编辑技术主要包括CRISPR/Cas9系统、TALEN系统和ZFN系统等。
通过这些技术，科学家们可以对基因序列进行精准的修饰，从而实现对基因功能的精确调控。
基因的编辑技术为基因治疗、作物育种和生物制药等领域的发展提供了有力的支持。
综上所述，基因工程的基本原理主要包括基因的克隆、基因的表达和基因的编辑三个方面。
通过对这些基本原理的研究和应用，科学家们可以实现对基因的精准操控，为人类社会的发展和进步带来更多的可能性。
基因工程技术的不断创新和突破将为人类社会的各个领域带来更多的机遇和挑战，我们有理由相信，基因工程技术的发展将为人类社会带来更加美好的未来。
生物技术概论_基因工程
PvuII等酶切产生的平末端
5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’
3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’
PvuII 37℃
5’…G-C-T-C-A-G-OH 3’…C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G…3’ HO-G-A-C-C-T-C…5’
4、限制性内切核酸酶反应系统 反应底物 内切酶 反应缓冲液 适当的温度
5、酶切方法
单酶切方法
一个酶切反应体系 （20μ L）： 离心2S→保温1-3h（30 度或37度） →终止反应
无菌重蒸水：13μ L， 缓冲液（10×）：2μ L 底物DNA： 4μ L
（65水浴中保温1015min，或乙醇沉淀处 理，或者先用酚处理后再
（2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐 平末端
功用：DNA重组中促使载体与DNA连接
具互补粘性末端片段之间的连接
具平末端DNA片段之间的连接
DNA片段末端修饰后进行连接
DNA片段加连杆后或加衔接头连接
二、 基因克隆载体
基因克隆载体的含义
能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持
什么是限制性内切酶？
命名原则？
由1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
1、用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母 （小写，斜体）组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
（二）基因工程研究的理论依据（为何可对基因进行
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PCR 技术
基本原理 (PCR—Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应) 一个DNA经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个分子DNA 扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的 核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 。
反应体系 DNA模板；dNTPs；+Tris·HCl缓冲液；引物；DNA聚 合酶
基因的分类：结构基因 调控基因
原核生物基因结构
—— 操纵子(operon) 机制
启动序列 (promoter)
编码序列
其他调节序列
操纵序列 (operator)
真核生物基因结构
真核生物的结构基因不仅在两侧有非编码区， 而且在基因内部也有许多不编码蛋白质的间隔 序列，即内含子（intron），编码区则成为外 显子（exon）。
实时荧光定量PCR （Real-time PCR）
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针 为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时， Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光 基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链 ，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全 同步。
2.3 中心法则与基因表达调控
2.4 自然界的基因转移和重组
2.1 核酸的结构与功能
核酸：就是由许多核苷酸按照一定的顺序连接 所组成的多核苷酸，它的主要功能是充当遗传 信息的载体。
脱氧核糖核酸: DNA
戊糖
碱基
核苷酸的基本组成
DNA的结构和功能
DNA的一级结构与功能
结构式
DNA的二级结构与功能
1 螺旋直径2nm 2 链间有螺旋形凹槽，较 小的为小沟（1.2 nm）， 较大的为大沟（2.2nm） 3 碱基间距为0.34nm 4 结构重复周期3.4nm 5 每轮碱基数为10 6 碱基平面与纵轴垂直。
RNA的结构与功能
信使RNA（messenger RNA，mRNA） 核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）
lacZ
lacY
lacA
DNA
mRNA
The LAC operon
Protein
β -Galactosidase
Permease
Transacetylase
31
②CAP正调控
真核生物基因的表达调控
DNA水平的调控
转录水平的调控 (transcriptional regulation) 转录后水平的调控 (post transcriptional regulation) 翻译水平的调控 (translational regulation) 翻译后水平的调控 (protein maturation)
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种， 以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
定量PCR（Q-PCR）还有半定量semi quantitative PCR。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是 在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅 DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
DNA单链之间、一条DNA和一条RNA链 之间主要存在序列互补配对区域，不管 是整条链互补，还是部分序列互补，均 可能重新形成整条双链或部分双链，这 即为核酸分子杂交（hybridization）。
2基.2因基的因结与构基因组
基因（gene）：能够编码一段多肽或功能RNA 的一段核苷酸序列。
基因的基本特性：基因可自我复制 基因决定性状 基因可以突变
基因工程的基本原理
A 重组DNA技术的理论基础
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学 1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA
分子遗传学 1953年 沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学 1973年 伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体外拼接
蛋白质的生物合成
• 氨基酸活化
肽链的起始 •
肽链的延伸 • 肽链的终止
• 新合成多肽链的折叠和加工
2.3.2 基因的表达调控
转录水平上的调控 mRNA加工成熟水平上的调控 翻译水平上的调控
原核生物基因的表达调控
调节基因 调控基因
①阻遏蛋白的负调控 结构基因
lacI
PlacI
Plac Olac
主要用于mRNA的PCR扩增
5'
5'
5' 3'
5' 3'
3' 5'
CC..C 3' 限 制 酶 3'GG..G 识别序列
AAA...A 3' mRNA
引物1 RT RNaseH
限制酶 AAA...A 3' 识 别 序 列 3 'T T T . . . T
5' AAA...A 3' TTT...T
5'
AAA...A 3' TTT...T
5'
TTT...T
TdT + dGTP
5'
TTT...T
RT
5'
5'
3'
3'
5'
RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转 录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。
DNA变性
核酸的理化性质
在某些理化因素下，DNA分子互补碱基之间的氢键断 裂，致使DNA双螺旋结构松开，变成单链，即为DNA变性 （denaturation）。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿 素、甲醛等。
核酸变性后，在260nm处的吸收值上升，这叫增色效 应(hyperchromic effect)。增色效应常可用来衡量DNA变 性的程度。
基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产 ——生化工程学原理
基因工程的基本原理
D 基因工程的支撑技术
核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术
第二节 基因工程的分子生物学基础
2.1 核酸的结构与功能 2.2 基因与基因组
DNaseI超敏感位点 基因座控制区（LCR） 核基质结合区（MAR）
真核生物基因表达调控的特点和种类
真核生物DNA水平上的基因表达调控
真核生物转录水平上的基因表达调控
顺式作用元件和反式作用因子
真核基因他水平上的调控
染色质结构与调控 基因丢失 基因扩增 基因重排 DNA甲基化状态与调控
RNA的加工成熟、翻译水平的调控、翻译后水平的调控
终止子（terminator）基因结构中能够促进转 录终止的DNA序列，在RNA水平上通过转录出的
终止子序列形成茎环结构而终止。Fra bibliotek基因组
基因组（genome）：单倍体细胞中的全套染色体 上所有基因的总和。
原核生物的基因组
基因组小 多顺反子mRNA 非编码区少 基因重叠 不含内含子
真核生物基因组
转运RNA（transfer RNA，tRNA）
mRNA
1. mRNA的转录和翻译发生在 同一个细胞空间，这两个过程 几乎是同步进行的 。 2. 半衰期短。 3. 许多原核生物mRNA以多顺 反子的形式存在。 4.原核生物mRNA的5’端无帽子 结构，3’端没有或只有较短的 多聚（A）结构。 5. 原核生物常以AUG（有时 GUG，甚至UUG）作为起始密 码子
5S rRNA 36种蛋白质
高等动物核糖体（80S）
40S亚基
60S亚基
18S rRNA 33种蛋白质
28S rRNA
5.8S rRNA 49种蛋白质 5S rRNA
tRNA
二级结构
三级结构
核酸的理化性质及其应用
一般理化性质
DNA为白色纤维状固体 RNA为白色粉末状固体 紫外吸收：260nm A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
• 真核细胞mRNA的合成和功 能表达发生在不同的空间和时 间范畴内。 • 单顺反子形式存在。 • 5’端存在“帽子”结构。 • 绝大多数具有多聚(A)尾巴。 • 真核生物几乎永远以AUG作 为起始密码子。
rRNA
E.coli核糖体（70S）
30S亚基
50S亚基
16s rRNA 21种蛋白质
23S rRNA
基因工程
基因工程的基本原理
B 基因的分子生物学
基因工程的基本原理
C 基因工程的基本原理
提高外源基因的剂量——分子遗传学原理 筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、
增强子、操作子、终止子、上游调控序列等 ——分子生物学原理
修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序 列、mRNA非编码区、密码子等 ——分子生物学原理
2接.4合自作然用界的基因转移和重组
细菌之间通过菌毛相互接触时，质粒便可从一 个细胞转移至另一细胞，这种类型的DNA转 移称为接合作用（conjugation） 。
转化及转导
转化作用（transfromation）
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞 或培养的受体细胞获得新的遗传表型。