《细胞工程》第4章(3)动物细胞培养工程4
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急性心肌梗死病人溶栓治疗， 人t-PA基因位于8号染色体p12-q11.2， 全长36594bp，14个外显子，13个内含子， t-PA由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始 酵母表达，不能分离纯化 t-PA突变体，由双链糖蛋白， 现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）
B、β-干扰素（IFN-β）
最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病 毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、 肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为 一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活 性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，
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牢记安全之责，善谋安全之策，力务 安全之 实。202 0年10 月24日 星期六1 0时54 分27秒Saturday , October 24, 2020
•
相信相信得力量。20.10.242020年10月 24日星 期六10 时54分 27秒20 .10.24
谢谢大家！
优化策略
流加工艺的优化
4．5．3 动物细胞培养工艺的放大
A、生物反应器尺寸放大 鼓泡
B、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法
搅拌速率和搅拌器的设计 C、混合
剪切力和细胞损伤 D、工业生产中的动物细胞培养
4．6 动物细胞代谢工程
4．6．1 概述
A、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞 群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化 的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所 构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网 络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳 ，需要对细胞代谢途径进行修饰；
生物合成相关代谢调节和调节网络理论 • 代谢工程 代谢流及节点分析
理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析
B、代谢流及中间产物分析——静态分析 C、代谢控制分析——动态分析
4．6．3 代谢调节的基本类型及其机制
A、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制 合作反馈控制
D、血友病 ——缺少凝血因子Ⅶ（FⅦ）或含量过低疾病
4．8．2 MAb药物（参见下图）
——因为体内同一抗原具多个表位，刺 激机体产生不同抗体（多克隆抗体）
杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具 有高度均一性，抗原识别专一性的MAb， 降低抗原识别交叉反应；
4．8．3基因工程与亚单位疫苗
A、乙肝疫苗（参见下图）
B、代谢控制发酵 （metabolic control fermentetion） ——是指利用遗传学或生物化学方法，人 为地在DNA分子水平上改变和控制微生物 的代谢，使目的产物大量的生成、积累的 发酵； C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出 和形成了“代谢工程”概念；
D、代谢工程 （也称途径工程，pathway engineering）
B、艾滋病疫苗（参见下图） CHO表达疫苗——理论上，有致瘤性
昆虫细胞表达疫苗 ——昆虫细胞-杆状病毒表达系统
（安全性好，容量大，表达效率高）
C、肿瘤疫苗
灭活自体肿瘤细胞
主动 免疫 同种异体的肿瘤细胞
对细胞因子基因修饰， 加强疫苗免疫原性
树突状细胞（抗原提呈细胞） 体内外诱导CTL生成 （细胞毒性T淋巴细胞） 激发特异性抗肿瘤免疫功能
天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞， 大肠杆菌表达，活性低，不稳定， Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化
重组IFN-β 点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸， 如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-β-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化， 分离简单。
C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）
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踏实肯干，努力奋斗。2020年10月24 日上午1 0时54 分20.10. 2420.1 0.24
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追求至善凭技术开拓市场，凭管理增 创效益 ，凭服 务树立 形象。2 020年1 0月24 日星期 六上午1 0时54 分27秒1 0:54:27 20.10.2 4
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严格把控质量关，让生产更加有保障 。2020 年10月 上午10 时54分2 0.10.24 10:54O ctober 24, 2020
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作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2 020年1 0月24 日星期 六10时5 4分27 秒10:54:2724 October 2020
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好的事情马上就会到来，一切都是最 好的来自百度文库 排。上 午10时5 4分27 秒上午1 0时54 分10:54:2720.1 0.24
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专注今天，好好努力，剩下的交给时 间。20. 10.2420 .10.241 0:5410:54:271 0:54:27 Oct-20
4．5 动物细胞培养过程的 放大与优化
4．5．1 动物细胞培养工艺的研究
A、开发重要性： 真核细胞表达产物糖基化，有疗效； 动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病
毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期 长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex
公 司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白 药物，2.6g/人、年×6154美元/g=16000美元，2002年， 销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产 量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优 化生产工艺，提高产量。 B、主要内容：
B、研究
代谢控制分析（MCA）— 动态
方法 代谢网络 生化系统理论（BST）— 最优化原理
定量分析 控制论模型（CM）— 非线性
途径分析——途径定位
C、代谢模型的 发展与优化
细胞代谢模型 计算生物学方法
神经网络 遗传算法
D、逆代谢工程
4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．7．1 动物细胞工程产品制备
A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：
B、造血干细胞治疗癌症 HSC基因（参见下图）
胰岛素依赖型（I）
C、细胞、基因
代谢
治疗糖尿病
紊乱
非胰岛素依赖型（II）
【习题】
1、名词解释，并简要说明它们间关系： 单抗与疫苗 悬浮培养与贴壁培养
流加工艺与灌流工艺 CHO与HNK tPA与EPO（NESP）艾滋病疫苗与肿瘤疫 苗
生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。 C、初步研究：
首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细 胞培养工艺。
4．5．2 动物细胞培养工艺的优化
A、影响蛋白质产量的关键参数， 营养物耗尽；
B、决定细胞浓度 有毒废物的积累 的关键参数 培养物理条件的恶化
提高蛋白质表达水平
C、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制
基因治疗与细胞治疗 CNTF与HSC 2、简述乙肝疫苗发展历程？试规划肝癌疫苗
的 发展策略？
•
树立质量法制观念、提高全员质量意 识。20. 10.2420 .10.24Saturday , October 24, 2020
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人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。1 0:54:27 10:54:2 710:54 10/24/2 020 10:54:27 AM
——是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的 遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶 的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的 功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作 （包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代 谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络 有目的地被修饰。
4．6．2 基本原理
A、代谢网络理论 • 细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系 统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受 精密调节，又互相协调； • 代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据 可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔 性节点； • 柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对 象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；
细 胞 工 Cell Engineering 程
Chapter 4、动物细胞培养工程
4．1 概述 4．2 生产用动物细胞系 4．3 培养液和培养环境 4．4 动物细胞培养工艺 4．5 动物细胞培养过程的放大与优化 4．6 动物细胞代谢工程 4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．8 动物细胞工程表达产品的应用
A、初级分离——离心、过滤、吸附 B、纯化——色谱法 C、制剂与冷冻干燥
4．7．2 动物细胞工程产品的质量控制
纯度 A、物化指标测定 含量
PAGE SDS-PAGE 液相色谱
B、安全性评介 分子量
C、稳定性
4．8 动物细胞工程表达产品的应用
4．8．1 重组蛋白药物
A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体 Tenecteplase，商品名TNKaseTM，
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安全象只弓，不拉它就松，要想保安 全，常 把弓弦 绷。20. 10.2410 :54:271 0:54Oc t-2024- Oct-20
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加强交通建设管理，确保工程建设质 量。10:54:2710 :54:271 0:54Saturday , October 24, 2020
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安全在于心细，事故出在麻痹。20.10. 2420.1 0.2410:54:2710 :54:27 October 24, 2020
衣壳——衣壳表面抗原（HBsAg）， 核心抗原
——核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸
第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应， 81-82年，美法，85年，中国
第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，81年， 法美，91、92年，中国
第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO细胞表达
累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制
B、酶合成及酶活性的调节机制
酶的阻遏 和酶的诱导
末端代谢产物阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工
多功能酶
4．6．4 代谢工程的研究方法
A、设计思路改变代谢流
扩展代谢途径和构建新的代谢途径
常规方法——分子生物、生化、物化
代谢通量分析（MFA）— 静态
（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名:赫赛汀）
（Zevalin泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，2002年在 美国上市，被批准用于难治复发B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗。）
4．8．4 基因治疗产品
基因治疗（gene therapy）——是指把外界 的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶 细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治 疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方 法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导， 还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细 胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行 细胞治疗。
B、β-干扰素（IFN-β）
最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病 毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、 肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为 一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活 性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，
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牢记安全之责，善谋安全之策，力务 安全之 实。202 0年10 月24日 星期六1 0时54 分27秒Saturday , October 24, 2020
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相信相信得力量。20.10.242020年10月 24日星 期六10 时54分 27秒20 .10.24
谢谢大家！
优化策略
流加工艺的优化
4．5．3 动物细胞培养工艺的放大
A、生物反应器尺寸放大 鼓泡
B、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法
搅拌速率和搅拌器的设计 C、混合
剪切力和细胞损伤 D、工业生产中的动物细胞培养
4．6 动物细胞代谢工程
4．6．1 概述
A、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞 群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化 的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所 构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网 络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳 ，需要对细胞代谢途径进行修饰；
生物合成相关代谢调节和调节网络理论 • 代谢工程 代谢流及节点分析
理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析
B、代谢流及中间产物分析——静态分析 C、代谢控制分析——动态分析
4．6．3 代谢调节的基本类型及其机制
A、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制 合作反馈控制
D、血友病 ——缺少凝血因子Ⅶ（FⅦ）或含量过低疾病
4．8．2 MAb药物（参见下图）
——因为体内同一抗原具多个表位，刺 激机体产生不同抗体（多克隆抗体）
杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具 有高度均一性，抗原识别专一性的MAb， 降低抗原识别交叉反应；
4．8．3基因工程与亚单位疫苗
A、乙肝疫苗（参见下图）
B、代谢控制发酵 （metabolic control fermentetion） ——是指利用遗传学或生物化学方法，人 为地在DNA分子水平上改变和控制微生物 的代谢，使目的产物大量的生成、积累的 发酵； C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出 和形成了“代谢工程”概念；
D、代谢工程 （也称途径工程，pathway engineering）
B、艾滋病疫苗（参见下图） CHO表达疫苗——理论上，有致瘤性
昆虫细胞表达疫苗 ——昆虫细胞-杆状病毒表达系统
（安全性好，容量大，表达效率高）
C、肿瘤疫苗
灭活自体肿瘤细胞
主动 免疫 同种异体的肿瘤细胞
对细胞因子基因修饰， 加强疫苗免疫原性
树突状细胞（抗原提呈细胞） 体内外诱导CTL生成 （细胞毒性T淋巴细胞） 激发特异性抗肿瘤免疫功能
天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞， 大肠杆菌表达，活性低，不稳定， Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化
重组IFN-β 点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸， 如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-β-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化， 分离简单。
C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）
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4．5 动物细胞培养过程的 放大与优化
4．5．1 动物细胞培养工艺的研究
A、开发重要性： 真核细胞表达产物糖基化，有疗效； 动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病
毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期 长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex
公 司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白 药物，2.6g/人、年×6154美元/g=16000美元，2002年， 销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产 量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优 化生产工艺，提高产量。 B、主要内容：
B、研究
代谢控制分析（MCA）— 动态
方法 代谢网络 生化系统理论（BST）— 最优化原理
定量分析 控制论模型（CM）— 非线性
途径分析——途径定位
C、代谢模型的 发展与优化
细胞代谢模型 计算生物学方法
神经网络 遗传算法
D、逆代谢工程
4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．7．1 动物细胞工程产品制备
A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：
B、造血干细胞治疗癌症 HSC基因（参见下图）
胰岛素依赖型（I）
C、细胞、基因
代谢
治疗糖尿病
紊乱
非胰岛素依赖型（II）
【习题】
1、名词解释，并简要说明它们间关系： 单抗与疫苗 悬浮培养与贴壁培养
流加工艺与灌流工艺 CHO与HNK tPA与EPO（NESP）艾滋病疫苗与肿瘤疫 苗
生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。 C、初步研究：
首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细 胞培养工艺。
4．5．2 动物细胞培养工艺的优化
A、影响蛋白质产量的关键参数， 营养物耗尽；
B、决定细胞浓度 有毒废物的积累 的关键参数 培养物理条件的恶化
提高蛋白质表达水平
C、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制
基因治疗与细胞治疗 CNTF与HSC 2、简述乙肝疫苗发展历程？试规划肝癌疫苗
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树立质量法制观念、提高全员质量意 识。20. 10.2420 .10.24Saturday , October 24, 2020
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人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。1 0:54:27 10:54:2 710:54 10/24/2 020 10:54:27 AM
——是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的 遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶 的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的 功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作 （包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代 谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络 有目的地被修饰。
4．6．2 基本原理
A、代谢网络理论 • 细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系 统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受 精密调节，又互相协调； • 代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据 可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔 性节点； • 柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对 象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；
细 胞 工 Cell Engineering 程
Chapter 4、动物细胞培养工程
4．1 概述 4．2 生产用动物细胞系 4．3 培养液和培养环境 4．4 动物细胞培养工艺 4．5 动物细胞培养过程的放大与优化 4．6 动物细胞代谢工程 4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．8 动物细胞工程表达产品的应用
A、初级分离——离心、过滤、吸附 B、纯化——色谱法 C、制剂与冷冻干燥
4．7．2 动物细胞工程产品的质量控制
纯度 A、物化指标测定 含量
PAGE SDS-PAGE 液相色谱
B、安全性评介 分子量
C、稳定性
4．8 动物细胞工程表达产品的应用
4．8．1 重组蛋白药物
A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体 Tenecteplase，商品名TNKaseTM，
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衣壳——衣壳表面抗原（HBsAg）， 核心抗原
——核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸
第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应， 81-82年，美法，85年，中国
第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，81年， 法美，91、92年，中国
第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO细胞表达
累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制
B、酶合成及酶活性的调节机制
酶的阻遏 和酶的诱导
末端代谢产物阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工
多功能酶
4．6．4 代谢工程的研究方法
A、设计思路改变代谢流
扩展代谢途径和构建新的代谢途径
常规方法——分子生物、生化、物化
代谢通量分析（MFA）— 静态
（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名:赫赛汀）
（Zevalin泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，2002年在 美国上市，被批准用于难治复发B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗。）
4．8．4 基因治疗产品
基因治疗（gene therapy）——是指把外界 的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶 细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治 疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方 法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导， 还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细 胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行 细胞治疗。