生物类似药糖基化相似性评价中的审评思考

生物类似药糖基化相似性评价中的审评思考糖基化作为一种重要的翻译后修饰，造成了蛋白类药物分子结构上的多样性和异质性，对有效性、安全性和药动学性质都有重要影响。

糖基化是生物类似药和参照药相似性评价的难点之一。

本文以单克隆抗体药物为例，介绍蛋白类药物糖基化表征的常用方法以及审评工作中生物类似药糖基化表征的技术考虑，为研发单位开发生物类似药以及监管机构对糖基化相关的技术审评提供参考。

近年来，蛋白类药物由于在肿瘤、关节炎、糖尿病、心血管疾病等适应证上，显示出了作用靶点特异、疗效突出、安全性好等优点，极大满足了病患需求，已经成为药物研发的最重要领域之一［1］。

然而，蛋白类创新药物由于巨大的研发成本，且价格高昂，严重影响了药物的可及性。

各国监管机构纷纷出台政策法规指导和鼓励生物类似药的研发。

2015年国家药品监督管理局药品审评中心发布了《生物类似药研发与评价技术指导原则》后，国内迎来了生物类似药的研发热潮，目前已陆续有相关产品获批上市。

蛋白类药物由于多数采用哺乳动物细胞表达体系，细胞内存在着复杂的翻译后修饰和酶类反应，造成了表达产物在糖基化分子结构的多样性，生产工艺和细胞株的微小变化都可能导致目的蛋白糖修饰基团结构上的明显差异，因此，生物类似药基本上无法做到与原研产品在糖基化分子结构上完全一致［2－3］。

相对于小分子药物，现有科学研究对单抗等大分子蛋白药物的分子结构与功能的认知仍然存在局限。

目前对大分子药物之间的相似性评价方面往往需要综合药学、动物和人体等试验数据，结构和质量的相似性研究的深度和程度决定了开展人体临床评估的必要性和程度。

各国监管机构鼓励研发企业采用最新的分析技术手段对原研药和生物类似药的结构进行深入研究，证明与原研药的“相似性”。

蛋白糖基化是一种重要的翻译后修饰，造成了蛋白药物糖基化修饰分子结构上的多样性和异质性。

蛋白糖基化对蛋白的免疫原性和有效性有重要影响［4］，被普遍认为是治疗性蛋白药物最重要的关键质量属性( CQA) 之一。

细胞基质和生产工艺的变化都可能影响终产品蛋白的糖基化修饰的组成和结构［5－6］。

因此，研发单位需要对不同研发阶段的蛋白药物进行全面深入的表征，保证生产工艺的一致性、产品的安全性、生物类似药和原研药的可比性。

本文将以IgG 类单克隆抗体为例，介绍蛋白类药物审评工作中糖基化结构表征的重要性以及生物类似药糖基化结构表征的技术考虑。

1 蛋白药物的糖基化结构和功能蛋白糖基化修饰一般为寡糖结构，多数单克隆抗体糖基化修饰为N-连接寡糖。

IgG 型单克隆抗体在Fc 段的Asn-297 均有一个保守的N 糖基化位点，与Fc 段的免疫效应功能密切相关。

除Fc 糖基化外，约20%的IgG 在Fab 区域存在另一个N-连接的糖基化位点，这2 个糖基化位点都位于重链上［7］。

除N-连接的糖基化外，极少数单克隆抗体药物中也存在O-连接的糖基化。

O-连接的糖基化是糖链和蛋白质中的氨基酸( 丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸) 残基中的氧原子的连接，其主要发生在真核生物的高尔基体上。

由于O-连接的糖基化位点无保守序列且糖链无固定的核心结构，其结构更加复杂多变。

本文主要以对单克隆抗体药物最常见的N-连接糖基化为例进行介绍。

N-连接寡糖一般具有“双触角/双分枝”的五糖核心结构，该结构由甘露糖( Man) 和N-乙酰葡糖胺( GlcNAc) 2 种己糖分子组成，不同糖型除核心结构外还另外含有不同数目的糖分子，如岩藻糖( Fuc) 、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖( Gal) 、二等分N-乙酰葡糖胺和唾液酸( Sia) 。

糖链的长度、分叉形式和单糖序列的变化导致了糖基化修饰的复杂性。

根据不同的连接方式使得N-糖基化的五糖核心结构分为高甘露糖型、杂合型和复杂型3 种类型( 图1) 。

与其他糖蛋白相比，多于2 个触角/分枝的结构在单抗分子中通常不多见，且唾液酸含量也较低［8］。

单抗的Fc 段与其受体FcRs 结合发挥抗体依赖细胞介导的细胞毒作用( antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC) 、激活C1q 发挥补体依赖的细胞毒作用( complement dependent cytotoxicity，CDC) ，与新生Fc 受体( neonatal Fc receptor，FcRn)结合介导清除作用，糖基化修饰通过影响Fc 段功能区的结合来调节ADCC，CDC 以及药物半衰期［4］，无糖基化修饰的IgG 则由于缺失了与C1q 和FcRs 的结合能力而不能引发ADCC 和CDC 作用。

Fab 段和Fc 段特定的糖基化修饰还会诱发免疫原性。

已有研究证明，核心岩藻糖基化、末端半乳糖、唾液酸的含量可以显著影响抗体Fc 段介导的效应功能，进而影响抗体药物的疗效、安全性和药动学性质［9－10］。

2 糖基化的生物学表征如前所述，抗体结构中的糖基化修饰基团对抗体的功能有重要影响。

抗体结构中糖基化基团修饰类型和程度以及不同的翻译后修饰水平造成了抗体糖基分子结构的异质性，其可以通过改变抗体构象等方式，影响抗体的生物活性［11］。

因此，对抗体相关的生物活性测定是糖基化修饰结果分析判别的方法之一，也是生物类似药相似性评价的重要组成部分。

活性测定按方法原理不同可以分为2 类: ①测定受体和靶蛋白的结合。

②测定受体/靶蛋白结合后的生物效应。

常见的测定抗体功能/活性的试验方法有无细胞参与的结合试验、有细胞介入的结合试验、细胞活性试验，这3 种方法就其技术上来讲，虽然其稳定性、灵敏度、重现性逐步降低，但相应的对抗体体内活性的预测和参考价值是逐渐递增的，因此一般鼓励研发单位建立细胞模型的生物活性测定方法。

需要注意的是，由于抗体结构上或试验细胞体系上的差异，同一种活性测定方法对同靶点的不同抗体药物可能并不完全适用，需要在方法移植/转移前进行系统的方法学验证。

参照药和生物类似药的受体/靶蛋白结合动力学参数可能存在差异，生物类似药的研发机构在方法设计上应全面考虑，不建议使用某一剂量下的活性数据评价二者的相似/不相似，建议考察量效反应的整体性特征。

另外，采用活性方法评价生物类似药也有一定的局限性。

生物活性测定方法本身灵敏度不高，不一定能够发现生物类似药和参照药的区别; 活性方法建立在抗体药物的作用机制的基础之上，并不是每一种机制都适合用来开发生物活性方法。

因此，仅靠活性方法并不能充分确定生物类似药的相似性。

研究单位通常在生物类似药的开发过程中，采取系统灵敏的理化分析手段检测产品之间糖基化修饰基团和结构上的差异，结合相关的活性方法一起进行生物类似药与参照药的相似性评估，证明二者的糖基化单糖组成与含量、糖链结构、相关活性的综合相似性。

3 糖基化修饰结构的理化方法表征蛋白糖基化中的寡糖为非模板合成，结构极其复杂，糖基化结构表征难度远超核酸和氨基酸序列表征。

FDA，EMA 生物类似药相关的指导原则都鼓励研发单位采用最新的分析技术手段，对生物类似药和原研药的糖基化修饰位点、程度以及寡糖的组成进行深入比较研究［12－13］。

为制订相似性评价的接受标准，研发单位应采用足够批次的参照药与生物类似药进行比较研究。

FDA 建议用于相似性评价的样品批次一般不低于10 批，并尽可能覆盖产品间的差异，如不同货架期、不同规模的产品，参照药的批次应考虑纳入欧、美不同产地来源等。

蛋白的糖基化修饰结构分析可根据测试样品分子量大小一般分3 个水平进行，即完整蛋白( top) 和亚单位蛋白( middle-up) 、糖肽( bottom-up) 、游离寡糖。

3.1完整蛋白和亚单位水平色谱、电泳和质谱技术目前已经广泛用于完整蛋白水平的糖基化修饰分析，可以提供完整蛋白的分子量大小等信息。

亚单位蛋白水平的分析通常采用化学还原单抗分子中的二硫键或者蛋白酶酶切等方法，通过制备分子量较小的亚单位，以便对单抗分子中的变异体进行分离，提高质谱的灵敏度。

完整蛋白和亚单位的水平分析中常见技术包括RPLC-MS，CE /CIEF，MS ( MALDI 或ESI) 和凝集素糖蛋白识别芯片等，一般均具有快速、方便、重现性好等优点，广泛用于不同开发阶段的生物类似药和参比品主要糖型结构的比较分析，还可以用于单抗重链之间寡糖的对称性分析［14］。

完整蛋白和亚单位水平的分析并不能提供糖基化修饰结构的精细信息。

完整蛋白和亚单位的质谱法测定容易受到蛋白同位素峰的影响，对单一同位素峰的灵敏度较低，只能提供抗体的平均分子量信息，即使高分辨率质谱也不能获得更多信息。

因此，从完整蛋白和亚单位水平很难进行精细的翻译后修饰的检测，也难以获得准确的糖型( 尤其是低丰度糖型) 及糖基化位点的相关信息。

3.2糖肽水平糖肽水平的分析通常用胰酶等蛋白酶对完整蛋白进行的酶解，产生分子量大约为0. 5 ～5 kDa 的小肽，采用色谱或电泳分离后再进行MALDI-MS 或ESI-MS 分析。

因为其提供的肽段丰富，可以提供氨基酸序列、糖基化、微小的化学和酶修饰等信息。

糖肽水平的质谱分析不仅可以提供糖基化位点信息，还可以借助串联质谱( MS /MS) 技术对糖肽序列、寡糖组成进行解析。

基于上述优势，以质谱技术为基础的糖肽分析在抗体批次间一致性评估、生物类似药和参照药相似性评估方面已经广泛应用。

需要说明的是，糖肽水平的分析应该归属于糖基化修饰的定性分析，鉴于单抗产品复杂的糖基化修饰，还需要进一步借助寡糖的定量分析手段进行表征。

3.3游离寡糖分析游离寡糖的分析方法已经进行了广泛的研究，企业界和学术机构都有大量的文献报道［15－16］。

通常采用酶法或化学试剂法使寡糖从完整蛋白中游离出来，以便进一步对寡糖组成和含量进行深入分析。

对N-连接寡糖常用酰胺酶如肽N-糖苷酶F( PNGase F) ，其可定向切割N-乙酰葡糖胺( GlcNAc) 与蛋白结构中的天冬酰胺的酰胺键，使寡糖脱离以便进一步分析。

如果蛋白结构中含有N-连接和O-连接糖基化，通常采用肼解反应或还原性β-消除反应［17］。

对游离寡糖的分析通常有 3 种方法: ①配有脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法( HPAECPAD)。

②直接质谱分析( MS) 。

③配有荧光检测器或质谱检测器的高效毛细管电泳法( HPCE) 。

寡糖结构中无生色团，常采用荧光试剂标记后进行光谱检测，如毛细管电泳分析中N-寡糖的分析常使用激光诱导荧光检测技术，使用8-氨基-萘-1，3，6-三磺酸( APTS) 作为标记物。

亲水相互作用色谱( HILIC)使用2-氨基苯甲酰胺( 2-AB) 或2-氨基苯甲酸( 2-AA) 对寡糖进行标记［18－19］。

质谱法虽然可以直接对寡糖进行检测，但采用化学标记后进行质谱检测能极大提高离子化效率，并可提供更多的片段结构信息［20］。