单克隆抗体技术相关总结

单克隆抗体技术相关总结

、前言

1975 年，Kohler 和Milstein 发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。

虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。

鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了丁香园里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。

、动物的免疫

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方

案：

初次免疫1×10７/0.5ml ip （腹腔内注射）

↓ 2～3 周后

第二次免疫1×10７/0.5ml ip

↓ 3 周后

加强免疫（融合前三天）1×10７/0.5ml ip 或iv （静脉内注射）

↓

取脾融合

2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│ （一般0.8 ～1ml 0.2ml/ 点）

↓ 3 周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

│（ip 剂量不宜超过0.5ml ）

↓ 3 周后

第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip

│ （5～7 天后采血测其效价，检测免疫效果）

↓ 2～3 周后

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip 或iv

↓3 天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

论坛资源：

免疫小鼠的选择！（求助）单抗加强免疫到融合最多几天？

单抗小鼠尾静脉免疫

（求助）单抗babl/c 小鼠的免疫方案

请教）用质粒免疫制备单抗

单抗制备最后一次加强免疫方法（求助）如何用包涵体免疫小鼠制备单抗

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（求助）免疫的鼠意外怀孕了，还能继续免疫吗？

（交流）首次采用脾内免疫，第二次加强用完全佐剂还是用不完全佐剂好呢？

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（求教）制备单抗的蛋白用量问题

（求救）脂多糖免疫小鼠的方案

（求助）小鼠免疫方法

（求购）单克隆抗体制备中的动物免疫

（求助）单抗加强免疫到融合最多几天？

三、骨髓瘤细胞的选取

骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度，最好106 个细胞/ml ；④生长速度快，繁殖时间短。

目前常用的Balb/c 小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：① S194/5XXO?BU?1；②SP2/0—Ag14（简称SP2，常用）；③P2—X？?—Ag8?6?5?3（简称653）；④ FO以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15 烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma ，MOPC ）并经过培育形成一株8- 氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。

骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤

细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。很多书上说为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8 －氮鸟嘌呤，我个人认为没有这个必要，因为加入8-AG 之后，骨髓瘤细胞一般状态都不会很好，这样一来对于融合的影响更大。

论坛资源：

（请教）sp2/0 骨髓瘤细胞的处理

（求助）骨髓瘤细胞sp20 的生长特点？

求助：小鼠骨髓瘤细胞培养

（原创）SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞株

（求助）小鼠骨髓瘤细胞sp20可以用MEM 后DEME 培养吗？请教骨髓瘤细胞系相关问题，谢谢！

（求助）骨髓瘤细胞sp2/0

（请教）用作细胞融合的骨髓瘤细胞系有哪些

（求助）Sp2/0 细胞复苏及培养需注意哪些事项？

（总结）肿瘤细胞培养图片汇总

（求助）细胞培养时遇到的问题

（求助）加入过量谷氨酰胺对细胞有没有的影响

请教关于sp2/0 细胞的培养

（求助）在做单抗前，SP2/0 细胞是否需要筛选一下四、关于饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell ）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57 鼠，昆明小白鼠等。1．材料