实验四脾淋巴细胞分离及流式检测 邵
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
B细胞表面标志
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 MACS
2. 根据细胞理化性质 ： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 ， B1 细 胞 为 CD19 和 CD5 双 阳 性 ， 而 B2 细 胞 仅 为 CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
脾
脾（spleen ）位于腹腔的左上方，是机体内最大的淋 巴器官，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆。
脾脏功能
脾在正常情况下，只产生淋巴细胞及单核细胞，但在病 态及大失血后可产生各种血细胞。脾主要功能是参与免 疫反应，脾内的巨噬细胞能吞噬和清除衰老的红细胞， 细菌和异物，产生淋巴细胞，及单核细胞，贮存血液。 胚胎时期可造血。脾脏在胚胎时期是一个重要的造血器 官，出生后能产生淋巴细胞和单核细胞。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
淋巴细胞增殖实验报告
淋巴细胞增殖实验报告一、实验目的本实验旨在通过体外培养淋巴细胞，观察不同刺激条件下淋巴细胞增殖的情况，探讨淋巴细胞增殖与免疫应答的关系，为进一步研究免疫调节机制提供实验依据。
二、实验材料1. 实验动物：昆明种小鼠，体重20-25g，雌雄不限。
2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液、植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、ELISA试剂盒等。
3. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。
三、实验方法1. 淋巴细胞分离：取小鼠颈椎脱臼处死，无菌操作下取出脾脏，加入胰蛋白酶消化，离心洗涤，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
2. 淋巴细胞培养：将分离得到的淋巴细胞用RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10^6个/mL，加入PHA或ConA作为刺激剂，分别设置无刺激组、PHA刺激组、ConA刺激组等。
3. 细胞增殖观察：将培养的淋巴细胞置于CO2培养箱中培养，分别在24h、48h、72h、96h和120h取样，用倒置显微镜观察细胞形态变化，并计算细胞数量。
4. ELISA检测：取培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子（如IL-2、IFN-γ等）含量。
5. 流式细胞术检测：取培养的淋巴细胞，用荧光标记的抗体检测T细胞亚群（如CD4+、CD8+等）和细胞周期分布。
四、实验结果1. 细胞形态观察：随着培养时间的延长，淋巴细胞在PHA或ConA刺激下逐渐转变为淋巴母细胞，细胞体积增大，核仁明显，细胞浆内出现空泡。
2. 细胞增殖：在PHA或ConA刺激下，淋巴细胞数量显著增加，且呈时间依赖性。
3. 细胞因子检测：ELISA结果显示，在PHA或ConA刺激下，培养上清液中IL-2、IFN-γ等细胞因子含量显著升高。
4. 流式细胞术检测：流式细胞术结果显示，在PHA或ConA刺激下，T细胞亚群CD4+和CD8+的比例发生改变，且细胞周期分布发生变化。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)(1)
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
脾细胞提取实验报告
一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。
3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。
二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。
脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。
- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。
- 使用手术刀将脾脏从体内取出。
2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。
- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。
- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。
- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。
- 1000g离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。
3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。
- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。
4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。
五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。
2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。
3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。
4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。
六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。
2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)
lived dead
实验材料：
小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶 平皿，尼龙膜指套、研磨棒
PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）
细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 显微镜（关掉之前，请把光度调到最小！！）
实验步骤
（一）取小鼠脾脏：
小鼠颈椎脱位处死（注意安全）； 用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮肤 暴露腹腔，再找到脾脏，劲量剪除脾脏周围组织；
• • • •
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
注意： 细胞总数和细胞活力可以一起做 细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数 细胞活力=活细胞数/总数x100%
1.颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住 鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离 2.摘取脾脏：用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮 肤暴露腹腔，再找到脾脏，尽量剪除脾脏周围组织 3.研磨脾脏：在培养皿中加入3mlPBS，将脾脏放入过滤网制成的指套中， 再放入培养皿中，用注射器的活塞棒或研棒将脾脏研碎。将含有脾脏细 胞的PBS移入15ml离心管。再取3mlPBS冲洗培养皿后移入15ml离心管。
（三）计算细胞浓度
将上述细胞悬液做一定倍数（10倍左右）的稀释（小鼠脾 脏细胞一般为1x107-2x108）； 混匀稀释后，取10uL加至细胞计数板中(不要有气泡），计 数细胞计数板中4大方格细胞总数； 计算细胞总数：
细胞浓度=4个大方格细胞总数/4*104*稀释倍数。
细胞总数=细胞浓度x细胞悬液的体积
脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。
人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。
淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。
本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。
实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
注意避免气泡的产生。
2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。
离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。
3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。
轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。
此步骤的目的是去除红细胞和血浆。
4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。
注意避免两种液体混合。
离心管中的液体应该形成明显的两层。
5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。
离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。
6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。
加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。
7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。
8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。
同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。
结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。
在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。
为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。
本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。
二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。
2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。
3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。
ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。
B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。
ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。
iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。
C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。
ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。
iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。
iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。
D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。
ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。
三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。
2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。
3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。
四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。
然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。
可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。
2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。
脾脏淋巴细胞分离方法
脾脏淋巴细胞分离⽅法⼩⿏脾脏淋巴细胞分离⽅法需要提前准备的材料：提前⾼压灭菌：⼿术器械，200⽬尼龙⽹，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养⽫，75%酒精，100ml烧杯，⽆菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离⼼管，4mlEP管，离⼼机等。
1、配制的percoll⼯作液：配制15 ml100%percoll液（简称⼯作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备⽤。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml⼯作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml⼯作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml⼯作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml⼯作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml⼯作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml⼯作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备⽤找⼀只15ml离⼼管，从低到⾼（20% percoll液→70%percoll液）依次装⼊，装好备⽤。
3、⼩⿏脾脏细胞分离（1）颈椎脱⾅处死⼩⿏。
75%酒精浸泡10min（2）⽆菌条件下取出⼩⿏脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放⼊2ml离⼼管中剪碎。
（3）将200⽬尼龙⽹置于六孔板上，⽤注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离⼼管中，1500rpm 10min，弃上清。
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验是一种常用于免疫学研究的技术。
该技术通过分离人或动物的淋巴组织，提取淋巴细胞，可以进行多种免疫学实验，如细胞增殖、细胞毒性等。
淋巴细胞分离技术最早是由Ficoll-Paque首创的。
本次实验中，我们基于Ficoll-Paque梯度离心分离技术，通过在人血液样本中离心沉淀淋巴细胞，进而提取出淋巴细胞。
实验步骤如下：首先，我们从志愿者的血液中提取出血浆和白细胞。
接着，我们添加PBS缓冲液，缓慢倒入Ficoll液，最后加入血浆和白细胞混匀后，将试管进行离心。
在离心的过程中，血液中的重质量分别在上下两个相邻稠度梯度之间分离开，从而使淋巴细胞与Ficoll液相互分离，最终沉淀到离心管梯度底部。
接下来，我们将离心管倾斜45度，使用洁净的滴管吸取淋巴细胞。
我们将沉淀的细胞用PBS缓冲液多次洗涤，去除残留的红细胞和粒细胞等杂质，从而得到较为纯净的淋巴细胞。
分离出的淋巴细胞可以用于多种免疫学实验，包括细胞东西分析、细胞毒性测定、细胞增殖、T细胞识别和细胞培养等。
由此可见，淋巴细胞分离技术是一种非常有用和重要的免疫学技术。
本次实验中，我们还可以从中总结一些技术经验。
例如，血浆和白细胞必须充分混合，并且Ficoll液需要缓慢倒入，以免对细胞造成伤害。
此外，在离心的过程中，需要保持离心时间、离心速度的一致性，同时在取样时要保持管子的倾斜角度不变，以确保淋巴细胞沉淀到尽量下面的梯度面上。
综上所述，淋巴细胞分离实验是一项十分重要的免疫学实验，能够提供纯净的淋巴细胞供科研家们进行相关实验。
同时，淋巴细胞分离技术在使用过程中要注意多方面的因素，保证实验结果的准确性和稳定性。
分离脾脏组织细胞及胞内流式的protocol
分离脾脏组织细胞及胞内流式的protocol1.准备六孔板，1xPBS溶液，50ml离心管，15ml离心管, 1.5ml管子，70um滤器,把淋巴细胞分离液拿到室温放着2.杀小鼠，分离脾脏和肺组织，肺用OCT包埋，至于-80度保存，脾脏放入六孔板3.用10ml注射器的头将其研碎，匀浆4.将其转移到装有70um滤器的50ml离心管中5.在15ml离心管底部铺上一份淋巴细胞分离液，与细胞悬液之比为1:26.500g, 15度，升降速为0，分离15分钟7.吸取乳白色细胞层，至于1.5ml离心管中8.加入PBS重悬，500g离心15分钟，重复两次9.配置10%培养基，将细胞悬浮其中待用10.500g, 离心10分钟，弃上清11.加入2ml 1xPBS重悬，离心，重复洗2次，并转移至2ml离心管中12.在离心过程中，配置穿孔液，还有固定液，表面抗体的稀释液13.从重悬细胞中吸取部分细胞作为Blank，吸取部分做表面抗体单染：比如CD4、IFN-γ、IL-414.表面染色标记各流式样品和CD4单染样品，4度避光孵育20-30分钟15.加入1ml 1xPBS中和抗体，离心，CD4单染样品加入流式染色液避光放置16.流式样品和IFN-γ、IL-4单染在避光条件下，各加入100ul IC Fixationbuffer，轻轻弹一弹，室温避光孵育20分钟17.每管加入2ml 1xpermeabilization buffer,300g 室温离心5min，弃上清18.2ml 1xpermeabilization buffer 重悬，300g 室温离心5min, 弃上清19.用1xpermeabilization buffer配IFN-γ、IL-4抗体，分别加入到每管中，单染只加一种抗体即可，室温避光孵育20-30分钟20.每管加入2ml 1xpermeabilization buffer,300g 室温离心5min，弃上清21.每管加入2ml 1xPBS,300g 室温离心5min，弃上清22.加适量1xPBS（300-500ul）重悬，避光放置等待上机检测23.软件分析结果。
流式细胞术操作步骤
流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。
淋巴细胞的分离与淋巴细胞活性检测
实验四 淋巴细胞分离 淋巴细胞活性检测
【实验目的】
1.学习单个核细胞分离的基本方法，熟悉本 实验的原理与用途。
2.熟悉E玫瑰花环形成的原理；了解E玫瑰花 环形成的实验方法。
【实验原理】
外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，可根据其与 其他细胞形态、体积和密度的不同进行分离。利用聚蔗糖— 泛影葡胺分层液作密度梯度离心，可将不同比重的血液组分 按其密度不同作相应密度梯度分布，达到分离目的，收集到 淋巴细胞。
正常人和动物的T淋巴细胞表面具有能与红细胞（RBC） 表面糖肽相结合的受体（E受体），即CD2分子，是T细胞所 特有的表面标志。在体外一定条件下T细胞能直接与RBC结合 ，形成玫瑰花样细胞团，称为E玫瑰花环。常用于检测T细胞 的数量、活性及分离T细胞。
9.取1滴悬液涂片，晾干后加瑞氏染液1滴，盖上 盖玻片，镜检。
10.结果判断：凡能结合3个以上SRBC者即为E花 环阳性细胞。计数200个淋巴细胞，算出花环 形成细胞的百分率。 Ea花环正常值为25%～40%。
11.注意事
试管C。
5.Hank´s液洗2 次（加Hank´s液对倍稀释,2000 rpm 离心10min，对半弃上清液，重复一次）。 6.洗完后留下管底0.1ml液体，即为淋巴细胞悬液。 7.加入0.1 ml SRBC,500 rpm离心5 min。低速离心后 能迅速形成E花环，称为Ea花环（active T rosette）。 8.小心吸去上清，留0.1 ml，轻轻吹匀，加0.8%戊二 醛2滴混匀后固定2-3 min。
流式检测小鼠脾细胞的原理
流式检测小鼠脾细胞的原理主要基于对细胞表面的特异性免疫
分子和荧光标记抗体的结合，再通过激光光束对细胞进行扫描和检测，以及分析荧光信号的特性来确定细胞的类型。
具体的实验原理如下：
1. 脾脏细胞免疫细胞流式细胞术基于激光光束对细胞进行扫
描和检测的原理。
2. 通过单光子激光器激发细胞中的荧光染料，检测和分析荧光信号的特性，从而确定细胞的类型。
3. 荧光标记的抗体可以与细胞表面特定的免疫分子结合，并通过流式细胞仪的检测器测量这些标记染料的荧光信号，从而确定不同细胞类型的比例和表达水平。
以上信息仅供参考，如需获取更多详细信息，建议查阅流式检
测相关的权威资料或文献。
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可重复滤过
超净台下操作全过程 4
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7
实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
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可重复滤过
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（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数。
计数时需要遵循一定的方向逐格进行以免重复或遗漏，对压线细 胞采用数左不数右，数上不数下的原则。
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul 混PBS吹打匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
设定对照（代表）
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
1. No stain 2. 单染CD3 3. 单染CD4 4. 单染CD8
陷人麻醉状态，3～5min死亡。 ❖ 5．注射麻醉法：应用戊巴比妥钠注射麻醉致死。 ❖ 6 ．吸入二氧化碳：此法安全、人道、迅速，被认为是处理啮齿类的理想方
法，国外现多采用此法。可将多只动物同时置入一个大箱或塑料袋内，然后 充入CO2，动物在充满CO2的容器内l～3min内死去。
实验二报告分析
实验结果的呈现方式：结合图进行文字描述
预实验结果
Control
50ul PBS+ 0.5ul Ab
50ul PBS+ 2ul Ab
APC-CD3 T cells
PE-CD19 B cells 分析数据时建议只放一组实验组，各人可自行安排
实验小鼠处死方法
❖ 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
❖ 2．空气栓塞法：主要用于大动物的处死，用注射器将空气急速注入静脉，可 使动物致死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相 混致血液呈泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻塞其分支，进 入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快 致死。
❖ 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 ❖ 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
实验讨论：1. 根据结果的描述，进行归纳总结， 3. 实验影响因素探析 4. 实验误差原因分析 5. 进行合理化的建议
阴性实验结果的原因分析 1. 指出最可能的原因 2. 思考补救措施
抗原和抗体反放是否会出现结果？
弧形沉淀及沉淀倾斜的原因分析？
2. 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
（五）流式细胞术染色
事先准备好
1.收集细胞：取细胞总数约1x106-5x106脾脏细胞于1.5ml EP 管中（在 管盖上标记好组别），1500rpm， 4℃，5min（离心机需预冷）
2.染色：小心用枪吸去上清，再加入50ul预混抗体的PBS（ CD3抗体 100倍稀释； CD4抗体200倍稀释； CD8抗体500倍稀释），将细胞吹 打混匀，避光，4℃15-20min
实验四：小鼠脾脏单个核 细胞的分离
实验五：流式细胞术 检测淋巴细胞表面标记
邵红霞
舒望琴
熟悉细胞分离的基本原理 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法
解剖图
胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前 上方，覆盖在心脏前上方的白 色组织。通常小鼠鼠龄越小， 胸腺体积相对越大。
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体 积较大，长条形态，属于外周免 疫器官。外周血中淋巴细胞可经 再循环注入脾脏等外周免疫器官 的特定区域，所以富含各类免疫 细胞。
细胞总数和细胞活力可以一起做
活细胞
细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数
细胞活力=活细胞数/总数x100%
死细胞
自动化细胞计数器Luna™ 韩国Logos Biosystems公司
一块计数板/2组
在5×104 – 1×107 细胞/ml的浓度范围 3-60 µm的细胞直径范围内
注意事项
1. 通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细胞 作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
3. 弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为 小鼠脾脏单个核细胞悬液。
4. 取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）
5. 以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度
注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力
每只小鼠脾脏细胞一般为1x107-2x108