第五章 植物组织培养技术实验方案

第五章植物组织培养技术

一、植物组织培养中的基本概念

(1) 植物组织培养技术:

在无菌培养的条件下，将离体的植物器官（根，茎，叶，花，果实等）、组织（形成层，花药组织等）、细胞（体细胞，生殖细胞等）以及原生质体等培养在人工配制的培养基上，并给予适当的培养条件，使其长成完整植株的过程。

(2) 理论依据：

植物细胞的全能性，即指植物机体的每个细胞都含有该物种全套的基因组，具有发育成完整个体的潜力。

(3) 外植体：

从活体植株上切下的，用于组织培养的细胞、组织和器官。一般包括茎尖、根、茎、叶、花、种子等器官以及他们形成的体细胞胚等材料。

(4) 分化：

在个体发育过程中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程称为细胞分化。

(5) 脱分化：

已经高度分化的植物器官、组织或细胞，在切割损伤和培养物内外因素的共同作用下，逐渐丧失原来的分化结构和功能，最后形成无组织的细胞团或愈伤组织的过程。

(6) 愈伤组织：

在人工培养基上由外植体脱分化形成的一团无序生长的薄壁细胞。（具有细胞分裂能力）。

(7) 再分化：

已经脱分化的细胞在一定条件下，又可经过愈伤组织或胚状体，再分化出根和芽，形成完整植株，这一过程叫作再分化。

(8) 不定芽：

在高等植物正常的个体发育中，芽一般是只从茎尖或叶腋等的一定位置生出。所以这种象顶芽、腋芽、副芽等均在一定部位生出的芽，称为定芽。与此相反，凡从叶、根、或茎节间等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。

(9) 胚状体：

在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。

二、植物组织培养过程（菊花为例）

1、培养基的配制:

方法：培养基干粉配制法

称取培养基干粉42g加水加热煮沸溶解后定溶至1L，按照需要的浓度分别加入激素。

（其中生根用的植物激素NAA为0.2mg/1000ml）

用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调节pH至5.8。将配好的培养基迅速分装至150ml组培瓶中，拧上盖子，放入灭菌锅121℃，灭菌20min。

2、菊花接种与培养：

（1）取材：

取菊花生长旺盛的嫩枝。

（2）消毒：(省略)

①流水冲洗后，加少许洗衣粉刷洗，流水冲20分钟；

②放入70﹪～75%酒精中摇动2~3次，持续30秒，无菌水冲洗2~3次，用无菌吸水纸吸干;

③在2﹪~10%的次氯酸钠溶液中消毒8~10分钟，无菌水冲洗2~3次，无菌吸水纸吸干。

接种：减去嫩枝3-4厘米（带有3-4片嫩叶）接到培养基中（注意：不能将一片叶子接入进去并务必要提前做好杀菌、消毒、灭菌措施）

培养：将无菌苗培养到光照培养箱中，条件温度：25度、光照：12小时，每隔一周观察幼苗生长情况

（3）愈伤组织与不定芽的诱导培养

选用合适的培养基分别对植物材料进行愈伤组织和不定芽的诱导。

（4）继代培养

继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程，目的在于繁殖出相当数量的无菌苗。

（5）生根培养

当无菌苗长到2～3cm时，选用生根培养基剪取无菌苗转接至生根培养基中进行生根诱导培养。

（6）炼苗、移栽

炼苗：当无菌苗根系长出约3cm，把无菌苗进行炼苗适应外界环境。先在外界环境闭瓶锻炼3天，再开瓶锻炼3天（以培养基上开始长出菌为宜）。

移栽：去净培养基，可先在灭过菌的珍珠岩或蛭石上培养使根系发达再转移到土壤中。

【注意事项】

1、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；

2、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；

操作不当引起的杂菌污染实验结果，

被杂菌污染培养基

3不要将一片叶子接入到培养基中

拓展实验：选取不同外植体诱导愈伤组织和不定芽

不同外植体的培养基激素配比如下：

叶片：6—BA : 2mg/L

NAA: 0.5mg/L

将叶片切成0.5cm*0.5cm小块

茎段：6—BA : 3 mg/L

NAA: 0.2 mg/L 将嫩枝切成1cm 茎段

腋芽：6—BA : 3 mg/L

NAA: 0.2 mg/L 将嫩枝切成1—2cm带腋芽的茎段

最后调节PH值至6.0

（1）20天后，菊花不同外植体培养情况，见图5：

图5 20天后菊花不同外植体形态

（从左往右分别为：叶片愈伤、茎段愈伤、腋芽培养形态）（2）50天后，菊花不同外植体培养情况，见图6

图6 50天后菊花不同外植体形态

（从左往右分别为：叶片愈伤、茎段愈伤、腋芽培养形态）