第十二章+酵母基因工程
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不宜于食品等蛋白生产
巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
毕赤酵母表达系统的特点
➢含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因） 启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达
➢表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表 达。
➢发酵工艺成熟，易放大。
➢培养成本低，产物易分离。
➢外源蛋白基因遗传稳定。
➢作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的 亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷 酸化等翻译后修饰加工功能。
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低
• 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统
表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物
序
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵 母 菌 (Yeast) 是 一 群 以 芽 殖 或 裂 殖 方 式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势：全基因组测序，基因表达调控机理清楚，
遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
第十二章 酵母基因工程
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 母中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导 入另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷，标
志着酵母表达系统建立 1981 Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。 1983 我国首次用酵母菌表达HBV HBsAg基因。 1996 完成第一个真核生物--酿酒酵母全基因组测
• 幻灯片 24
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用
可应用于生物催化剂、细胞吸附剂、活疫苗、 环境治理、蛋白质文库筛选、高亲和抗体、 生物传感器、抗原／抗体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
幻灯片 5
第二节 常用酵母表达系统
一、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
表达系统
酿酒酵母中的2环状质粒：
野生型，双链、环状，
6kb，拷贝数50-100。
A
IRs: 反向重复序列，同源重组
FLP: 编码产物驱动IRs同源重组
REP: 编码产物控制质粒稳定性
B
STB: REP结合位点
耐受铜离子
cup1 蔗糖转化酶
耐受高浓度蔗糖
suc2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤
克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
幻灯片 26
• ＧＰＩ锚定区域与细胞蛋白的Ｃ-端共价相连， 为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。ＧＰＩ锚定 蛋白的Ｃ-端包含疏水多肽，当细胞蛋白被合成， 前体蛋白通过羧基末端的疏水序列锚定在内质 网膜上，其余蛋白则位于内质网的内腔中。在 极短的时间内，疏水序列在转酰氨基酶作用下 ω位点裂开并同时被ＧＰＩ锚置换，然后蛋白 被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细胞 膜外。在蛋白水解酶作用下，分泌信号序列被 切除，细胞蛋白被ＰＩ-ＰＬＣ从细胞膜上释放 以ＧＰＩ锚定形式与葡聚糖共价相连并被转运 至细胞壁外。
三、裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表达 系统
外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和 活性。 研究较少。
四、酵母菌的转化方法 原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电击转化法
原生质体转化法
在Ca2+和PEG存在下，转化子可达原生质体 总数的1-2%。 特点： 1个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，这种 共转化的原生质体占转化子总数的25-33%； 对线型和环状DNA的吸收没有特异性。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA， 二者相差80倍。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、 内部降解、多聚体形成等
幻灯片 7
解决内部降解的方法
在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白 胨或酪蛋白水解物；
将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋 白酶的活性；
利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因 的表达。
如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3
选择压力：不完全培养基 如：YNB、无机盐培养基
显性标记基因
编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因 编码产物 遗传表型
aph 氨基糖苷转移酶 抗G418
cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素
dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺
铜ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ子螯合物
3）电击转化法
酵母菌完整细胞或原生质体可在电击下 吸收质粒DNA。 特性：
转化率高，达105/g D操N作A方；便； 适用范围广。
五、用于转化子筛选的标记基因 营养缺陷型互补基因 显性基因
营养缺陷型互补基因
宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变 如：LEU-、TRP-、HIS-、URA-
载体：携带相应的合成基因
巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
毕赤酵母表达系统的特点
➢含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因） 启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达
➢表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表 达。
➢发酵工艺成熟，易放大。
➢培养成本低，产物易分离。
➢外源蛋白基因遗传稳定。
➢作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的 亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷 酸化等翻译后修饰加工功能。
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低
• 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统
表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物
序
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵 母 菌 (Yeast) 是 一 群 以 芽 殖 或 裂 殖 方 式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势：全基因组测序，基因表达调控机理清楚，
遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
第十二章 酵母基因工程
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 母中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导 入另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷，标
志着酵母表达系统建立 1981 Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。 1983 我国首次用酵母菌表达HBV HBsAg基因。 1996 完成第一个真核生物--酿酒酵母全基因组测
• 幻灯片 24
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用
可应用于生物催化剂、细胞吸附剂、活疫苗、 环境治理、蛋白质文库筛选、高亲和抗体、 生物传感器、抗原／抗体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
幻灯片 5
第二节 常用酵母表达系统
一、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
表达系统
酿酒酵母中的2环状质粒：
野生型，双链、环状，
6kb，拷贝数50-100。
A
IRs: 反向重复序列，同源重组
FLP: 编码产物驱动IRs同源重组
REP: 编码产物控制质粒稳定性
B
STB: REP结合位点
耐受铜离子
cup1 蔗糖转化酶
耐受高浓度蔗糖
suc2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤
克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
幻灯片 26
• ＧＰＩ锚定区域与细胞蛋白的Ｃ-端共价相连， 为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。ＧＰＩ锚定 蛋白的Ｃ-端包含疏水多肽，当细胞蛋白被合成， 前体蛋白通过羧基末端的疏水序列锚定在内质 网膜上，其余蛋白则位于内质网的内腔中。在 极短的时间内，疏水序列在转酰氨基酶作用下 ω位点裂开并同时被ＧＰＩ锚置换，然后蛋白 被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细胞 膜外。在蛋白水解酶作用下，分泌信号序列被 切除，细胞蛋白被ＰＩ-ＰＬＣ从细胞膜上释放 以ＧＰＩ锚定形式与葡聚糖共价相连并被转运 至细胞壁外。
三、裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表达 系统
外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和 活性。 研究较少。
四、酵母菌的转化方法 原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电击转化法
原生质体转化法
在Ca2+和PEG存在下，转化子可达原生质体 总数的1-2%。 特点： 1个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，这种 共转化的原生质体占转化子总数的25-33%； 对线型和环状DNA的吸收没有特异性。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA， 二者相差80倍。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、 内部降解、多聚体形成等
幻灯片 7
解决内部降解的方法
在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白 胨或酪蛋白水解物；
将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋 白酶的活性；
利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因 的表达。
如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3
选择压力：不完全培养基 如：YNB、无机盐培养基
显性标记基因
编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因 编码产物 遗传表型
aph 氨基糖苷转移酶 抗G418
cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素
dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺
铜ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ子螯合物
3）电击转化法
酵母菌完整细胞或原生质体可在电击下 吸收质粒DNA。 特性：
转化率高，达105/g D操N作A方；便； 适用范围广。
五、用于转化子筛选的标记基因 营养缺陷型互补基因 显性基因
营养缺陷型互补基因
宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变 如：LEU-、TRP-、HIS-、URA-
载体：携带相应的合成基因