植物多糖的提取、分离和含量测定的研究

论文题目：植物多糖的提取、分离和含量测定的研究

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班级：08级药学1班

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植物多糖的提取、分离和含量测定的研究文献综述

对多糖的研究, 最早是在20 世纪40 年代, 但其作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在60 年代, 经过40 余年的不断发展, 人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识, 使这一学科成为目前生命科学中研究最活跃的领域之一[ 1 ]。越来越多的研究发现多糖对人体具有极大的利用价值, 按其来源可分为三类: 动物多糖、植物多糖和微生物多糖L 其中植物多糖如人参、黄芩、刺五加、红花、芦荟等所含多糖均具有显著的药用功效, 如免疫增强作用, 抗肿瘤作用, 抗辐射作用等L据文献[ 2 ]报道, 已有近100 种植物的多糖被分离提取出来L 这类多糖来源广泛且没有细胞毒性, 应用于生物体毒副作用小,因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。

1 植物多糖的提取分离纯化

多糖的提取分离纯化是指多糖研究中获取研究对象的过程L一般这一过程包括提取分离、纯化和纯度鉴定3 步L其中纯化是多糖研究的关键, 其成功与否、效果的好坏都会直接影响后续研究的可行性与可信度[ 3 ]。

1.1 提取分离

一般植物细胞壁比较牢固, 需在提取前进行专门的破细胞操作, 包括

机械破碎(研磨法、组织捣碎法、超声波法、压榨法、冻融法)、溶胀和自胀、化学处理和生物酶降解L因此常用的提取方法有: 热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法和酶法L 其中前3 种为化学方法, 酶法为生物方法。此外, 更有研究者[ 4, 5 ] 在细胞破壁方面进行研究, 利用超声波、微波等技术有效地提高多糖的提取率和产品质量, 并缩短了反应时间。

1.2 纯化

分离沉淀后获得的多糖提取物中, 常会有无机盐、蛋白质、色素及醇不溶的小分子有机物(如低聚糖) 等杂质, 必须分别除去L 多糖的纯化就是指将粗多糖中的杂质去除而获得单一多糖组分。一般是先脱除非多糖组分, 再对多糖组分进行分级L而脱除非多糖组分是先脱除蛋白质再去除小分子杂质。

1.2.1除蛋白天然植物中多糖与蛋白质

两种高分子成分共存, 且分子量相近, 另外糖常常与蛋白形成糖蛋白

复合物, 使蛋白质的脱除更加困难。但也许正是结合了这部分蛋白质, 多糖才具有众多独特的生理功能, 如各种蛋白质聚糖、糖蛋白具有生理功能一样L常用的除蛋白质的方法有Sevage 法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法、酶法等。Sevage 法为实验室常用法, ,该法以正丁醇与氯仿混合再进行萃取; 蛋白酶法是目前认为较好的方法, 将蛋白质水解再透析去除。

1.2.2 脱色

对于植物多糖可能会有酚类化合物而颜色较深, 对其进行脱色可使其

应用范围更加广泛。常用的脱色方法有: 离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等) LDEA E- 纤维素是目前最常用的脱色剂, 通过离子交换柱不仅达到脱色的目的, 而且还可以分离多糖。

1.2.3 除小分子杂质

通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质,这样得到的就是多糖的半精品。

1.2.4 多糖的分级纯化

采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物, 即是多分散性的L 其不均一性表现在化学组成、聚合度、分子形状等的不同, 分级的方法可达到纯化的目的。可按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等) , 也可按分子所带基因的性质分级(如按电荷性质级的电泳、离子交换层析等) 。柱层析法较为常用, 可分为两类: 1) 只有分子筛作用的一般凝胶柱层析, 如Sephadex、Sephrose、Biogel 等; 2) 离子交换层析, 这种分级不仅按电荷性质不同, 同时也有分子筛的作用, 如带负电荷的多糖可在阴离子型DEA E2纤维EAE2Sephadex柱上达到分级, 酸性多糖可在阳离子型的羧甲基(CM 2Sephadex) 或磺酸乙基(SE2Sephadex) 等凝胶柱上分离L柱层析法常用水、盐缓冲溶液或酸碱液洗脱以得到分级L。检测手段国内仍沿用经典的苯酚-硫酸法, 国外用比旋度、示差折光检测器, 各组分的蜂位自动记录, 分离效果好而且方便[ 6 ]。

1.3 多糖的纯度鉴定

经过分级纯化的多糖在测定结构前须进行纯度鉴定。而且多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量, 因为即便是多糖纯品, 其微观也并不均一, 仅代表相似链长的多糖分子的平均分布, 通常所谓的多糖纯品也只是一定相对分子质量范围的多糖的均一组分。目前常用于多糖纯度的鉴定方法有: 凝胶层析法、电泳法、色谱法、旋光度法等L必须指出纯度鉴定须用两种方法以上结果才肯定。

2 植物多糖的表征鉴定

2.1 糖含量测定

确定样品中的糖类含量, 给取样溶解打基础国内多用显色剂- 硫酸法, 根据单糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解, 脱水生成糖醛衍生物, 与酚类、芳胺类等缩和成有色化合物。苯酚2硫酸法生成橙黄色溶液, 在490 nm 处有强吸收; 蒽酮2硫酸法生成亮绿色溶液在620 nm 处有强吸收, 其蒽酮试剂需新鲜配置L咔唑2硫酸法用于测定糖醛酸[ 7 ]。

2.2 分子量测定

多糖的分子量分布比较分散, 所以一般测得的分子量是一种统计平均值。过去常用渗透压法、端基法、粘度法、光散射法等, 这些方法操作复杂且误差较大目前较常用的方法有凝胶过滤法和高效液相色谱法此两种方须

先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。对于分子量小于5 万的多糖可采用质谱法。

2.3 结构分析

多糖的生物大分子结构比蛋白质更为复杂, 这不仅因为组成多糖的单

糖品种繁多, 而且只有一种单糖组成的多糖, 其连接方式的不同以及可能

有的支链也可造成多糖的结构测定非常困难L 多糖的结构有四级的概念:

一级包括糖基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头物构型及糖链有无分支,分支位置与长短; 二级包括多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体; 三级包括多糖一级结构的重复顺序, 由于糖单元的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作用, 导致有序的二级结构空间有规则

而粗大的构想; 四级包括多聚链间非共价链结合形成的聚集体[ 8 ]。

3 植物多糖的应用前景

植物源多糖类化合物由于其独特功能和低毒性, 在临床中显示出越来

越广阔前景, 1997年全球从植物中提取的糖类药物的销售额达73亿美元

[ 10 ]。

3.1 抗肿瘤药物

自从50 年代发现酵母多糖具有抗肿瘤效应以来, 已分离出很多具有抗肿瘤活性的多糖[ 1 ]就多糖的抗肿瘤作用而言, 可将抗肿瘤多糖分为2 大类: 一类是具有细胞毒性的多糖直接杀死了肿瘤细胞, 这类多糖有牛膝多糖、刺五加多糖等; 第二类是作为生物免疫反应调节剂通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞的, 如: 能促进LAK、自然杀伤细胞(N K)活性、诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的多糖, 具有抗肿瘤活性的多糖大多是通过这种途径起作用的, 也就是常说的宿主介导抗肿瘤活性[ 11 ]

3.2 抗病毒药物

大量研究表明, 许多多糖对一些病毒有抑制作用, 如艾滋病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒、乌肉瘤病毒等国际上有研究发现, 一些衍生化的多糖制剂, 如硫酸葡聚糖等对H IV 有抑制作用L 因为硫酸多糖是一类多聚阴离子, 带有负电荷, 能与病毒外

膜糖蛋白上带有正电荷的氨基酸残基相互作用, 且在结构上与细胞表面糖

胺聚糖- 硫酸乙酰肝素相类似, 可以受体竞争抑制方式阻止病毒与寄主细

胞结合, 同时又有许多细胞表面分子的模拟配体, 能够直接与细胞结合,