实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR
SYBR Green法优缺点
优点 缺点
容易与非特异性双链DNA结 对DNA模板没有选择 合，产生假阳性但可以通过 融解曲线的分析，优化反应 性--适用于任何DNA 条件 使用方便--不必设计复 对引物特异性要求较高 杂探针 非常灵敏 便宜
TaqMan法
•
TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的 序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引 物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而 淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时， 荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。 但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进 行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有 售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断 积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
• • • •
SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 在延伸结束阶段采集荧光信号。 SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所 以必须在反应结束时做熔解曲线分析。
SYBR Green 熔解曲线分析
PCR反应体系的建立及优化
• SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，
目前，实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于 基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发 等领域。 其中最主要的应用集中在以下几个方面：
1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。 包括 病原微生物或病毒含量的检测、 转基因动植物转基因拷贝数的检测、 RNAi 基因失活率的检测等。
实时荧光定量PCR技术的操作实践
实时荧光定量PCR技术的操作实践实时荧光定量PCR技术是一种在生物医学领域应用广泛的分子生物学技术，主要用于基因表达水平的研究、疾病诊断和生物制品定量等。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术的实验原理、操作实践、结果分析和总结。
实时荧光定量PCR技术的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累与PCR产物形成正比的关系，从而实现对目标基因的定量分析。
实验过程中，荧光信号被实时检测并记录，通过荧光阈值设定，将荧光信号转换为数量，最终实现对目标基因的定量分析。
准备实验材料和设备：包括RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR仪、PCR引物、荧光染料等。
提取RNA：将组织或细胞中的总RNA提取出来，根据需要逆转录成cDNA。
实时荧光定量PCR：将cDNA、荧光染料和特异性引物混合，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。
数据收集和分析：收集荧光信号数据，根据标准曲线计算目标基因的相对表达量。
RNA提取时需选择合适的试剂，根据组织或细胞类型进行优化。
实时荧光定量PCR反应条件需根据目标基因和仪器型号进行调整，以确保最佳扩增效果。
荧光染料的加入要适量，以避免对PCR产物产生影响。
标准曲线的制作要采用已知浓度的样品，以便计算未知样品的相对表达量。
实验数据分析和解读是实时荧光定量PCR技术的关键环节之一。
通过对荧光信号数据的收集和分析，可以获得目标基因的表达量。
在标准曲线上，可以根据已知样品的浓度计算未知样品的相对表达量。
通过比较不同样品中目标基因的表达量，可以研究基因表达水平的差异。
还可以利用相对定量和绝对定量两种方法对目标基因进行定量分析。
在本次实时荧光定量PCR实验中，我们成功地检测了目标基因的表达量，并对其进行了相对定量和绝对定量的分析。
通过比较已知样品和未知样品的数据，我们发现目标基因的表达量在未知样品中明显高于已知样品。
这一结果表明，目标基因在未知样品中的表达水平较高，可能与某种特定条件或因素相关。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
•
X=X0 (1+Ex)n
• n：扩增反应的循环次数
• X：第n次循环后的产物量
• X0：初始模板量 • Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
在扩增产物达到阈值线时:
设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数
利用TaqMan法
数据分析
检测血液中的HBV
分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105
TaqMan法
应用范围
起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
4、Amplisensor
R
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
SYBR Green
SYBR Green 法
工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
Flourescenc
定量原理
Ck 102
Sample
Ck 104
Cycle number
Cycle number
Log of DNA concentration
SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不
荧光定量pcr实验小结
荧光定量pcr实验小结荧光定量 PCR 实验小结荧光定量 PCR（Quantitative Realtime PCR，qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，用于定量检测特定核酸序列的含量。
在经历了多次荧光定量 PCR 实验后，我积累了不少经验，也遇到了一些问题，在此进行一个小结。
一、实验原理荧光定量 PCR 的基本原理是在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
在 PCR 反应过程中，随着产物的增加，荧光信号也会相应增强。
通过检测荧光信号的变化，可以确定 PCR 反应的起始拷贝数。
二、实验准备1、试剂和耗材选择高质量的 PCR 引物和探针，确保其特异性和有效性。
准备合适的 PCR 反应缓冲液、dNTPs、Taq 酶等试剂。
使用无菌、无核酸酶污染的离心管、移液器吸头和 PCR 板。
2、样本制备提取高质量的核酸样本，如 DNA 或 RNA，并确保其纯度和完整性。
对 RNA 样本进行反转录，得到 cDNA 用于后续的 PCR 反应。
3、仪器设备荧光定量 PCR 仪，需要提前进行校准和维护，确保其性能稳定。
三、实验步骤1、反应体系配制根据实验要求，计算并配制合适体积的 PCR 反应体系。
将各组分依次加入离心管中，充分混匀，避免产生气泡。
2、加样使用移液器将反应体系准确地加入到 PCR 板的各个孔中。
加入待测样本和标准品，注意更换移液器吸头，防止交叉污染。
3、上机运行将 PCR 板放入荧光定量 PCR 仪中，设置好反应程序和参数。
启动仪器，开始进行 PCR 反应，并实时监测荧光信号。
四、实验中的关键环节1、引物和探针设计引物和探针的设计直接影响实验的特异性和灵敏度。
要选择合适的序列，避免引物二聚体和非特异性扩增。
可以使用在线设计工具，并结合相关文献进行优化。
2、反应条件优化退火温度是影响 PCR 反应特异性的重要因素，需要通过梯度 PCR进行优化。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
使用高质量的试剂和仪器
高质量的试剂和仪器是实时荧光定量PCR实验的基础，包括 高质量的DNA聚合酶、高灵敏度的荧光探针、可靠的定量 PCR仪等。
选择经过认证的试剂和仪器，并按照说明书正确使用和维护 ，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
优化PCR反应条件
优化PCR反应条件可以显著提高实验 的重复性和准确性，包括调整模板浓 度、引物浓度、循环数等参数。
通过梯度PCR或条件优化实验，可以 找到最佳的反应条件，使扩增曲线更 符合标准曲线的要求。
严格控制实验操作规范
实验操作规范是保证实时荧光定量PCR数据质量的重要环节，包括实验前的准备 、样本处理、加样、扩增和检测等步骤。
基线漂移
01
总结词
基线漂移是指PCR扩增曲线在起始阶段出现非特异性扩增，导致背景信
号过高。
02
详细描述
基线漂移可能是由于模板污染、酶活性降低或反应条件不适等原因引起
的。高背景信号会掩盖特异性扩增信号，导致检测结果不准确。
03
解决方案
在实验过程中，要严格控制操作环境，避免交叉污染。同时，要定期检
查酶活性，确保其处于最佳状态。此外，可以通过软件对扩增曲线进行
03 实时荧光定量PCR常见问 题分析
扩增效率不一致
总结词
扩增效率不一致会导致数据无法准确反映样本中目标基因 的表达水平。
详细描述
扩增效率不一致通常是由于反应条件、引物设计或试剂质量等 问题导致的。这会导致不同样本间的相对表达量出现偏差，从 而影响实验结果的准确性。
解决方案
在实验过程中，要确保反应条件的一致性，包括温度、时间、 循环数等。同时，要选择质量可靠、设计合理的引物和试剂， 并进行预实验以确定最佳的反应条件。
实时荧光PCR简介及结果分析
效率越高 3、标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。 4、各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效
率相近。
实验中样品浓度所遇到问题
原因：样品浓度跨度太大
解决方案：上图显示的样品浓度跨度太大导致信号值显示差异大，我们可以重 新将样品的稀释多个梯度后再进行相关实验验证
实时荧光PCR简介 及检测结果分析
疾控中心检验科
主要内容
1
实时荧光PCR技术基础理论
2
实时荧光PCR结果分析
3
PCR异常曲线解析
一、实时荧光PCR技术基础理论
1、实时荧光PCR技术概论 实时荧光PCR技术产生并成熟于上世纪90年
代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞 跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控， 并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在 短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了 广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的 一项重要技术。
设定三原则： 指数扩增初期、 整体曲线倾斜程度一致、 高于阴性对照的地方
实验结果的总体分析方法：
整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂 污染）；分析是否有因物理或其他因素造成的异常 曲线情况；
阴性对照分析：观察是否存在污染； 阳性对照分析：观察是否在质控范围内。
判断扩增曲线是否良好的指标： 1、曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，基线平而
左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指 数期很短-线性图；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关 系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点-对数图。
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量pcr的方法实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR），也称为荧光定量PCR，是一种常用于检测和定量DNA或RNA的分子生物学技术。
相比传统的PCR方法，实时荧光定量PCR具有更高的灵敏度、准确性和特异性，能够量化目标核酸序列的含量。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应的进行和荧光信号的检测与实时监测。
PCR反应是通过逐渐升高的温度循环，使DNA链解链、引物与模板相互结合，合成新的DNA链，不断扩增目标序列的过程。
荧光信号的检测是通过加入特定的荧光探针，在PCR反应过程中的每个循环都量化目标序列的含量，并以荧光信号的强度来表示。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的方法及其一般步骤。
1. 样品处理与提取：首先需要从待测样品中提取出目标DNA或RNA的模板，并进行适当的处理。
比如，可以使用细胞裂解液或提取试剂盒来裂解和纯化细胞或组织中的核酸。
2. 反转录：对于需要检测的RNA目标，需要先将其反转录为cDNA。
这一步骤通常使用反转录酶和适当的引物，在一定的温度条件下合成cDNA。
反转录反应通常在37-42C进行。
3. 扩增反应体系制备：根据实验需要和反应装置的规格，配制好PCR反应的体系。
体系中的成分通常包括模板DNA（cDNA或DNA模板）、引物（前向引物和逆向引物）、荧光标记探针（如TaqMan探针）、聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTPs等。
4. PCR扩增条件设置：根据模板DNA的长度和序列特性，设置PCR反应的温度和时间条件。
通常，PCR反应的温度包括初始变性（95C）、扩增（56-72C）和延伸（72C）等多个循环。
5. 荧光信号的检测与实时监测：PCR反应过程中，可以通过专用的实时荧光定量PCR仪器进行检测和监测。
这类仪器常常能够实时记录PCR反应的荧光信号强度，并产生实时的反应曲线图。
根据荧光信号的强度变化，可以推断目标DNA 或RNA的含量。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结实时荧光定量PCR技术是一种用于测定DNA样本中特定序列的数量和表达水平的分子生物学技术。
它能够在PCR反应进行过程中实时监测PCR 产物的扩增情况，通过检测荧光信号的强度和PCR循环次数来确定起始模板的数量。
该技术具有高灵敏度、准确性和广泛的应用领域，被广泛用于基因表达分析、病原微生物的定量检测和分子诊断等领域。
在使用引物和探针系统进行实时荧光定量PCR时，引物通过与模板DNA序列的互补配对，在PCR扩增过程中结合并扩增目标序列，而探针是一种荧光标记的序列，通过与目标序列的特定区域配对来检测PCR产物的扩增。
当目标序列存在于DNA模板中时，引物与探针结合扩增会释放出荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过监测荧光信号的强度和PCR循环数，可以推导出起始模板的数量。
SYBR Green是一种无标记引物的特殊荧光染料，可以与扩增产物的双链DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应中，SYBR Green会通过与扩增产物结合形成复合物，并发出荧光信号。
由于SYBR Green能与任意DNA结合形成复合物，所以在使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR 时，需要进行特异性验证和内参基因的设计，以确保准确测量目标序列的数量。
在实时荧光定量PCR技术中，还需要进行标准曲线法来定量PCR产物的数量。
标准曲线法是通过制备一系列已知浓度的标准DNA模板并进行PCR反应，测量荧光信号的强度和标准DNA模板的浓度之间的关系，建立一个标准曲线。
然后，通过测量待测样品PCR反应的荧光信号强度，根据标准曲线来计算待测样品中目标序列的起始模板数量。
总结来说，实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、准确度和广泛应用的分子生物学技术，可以实时监测PCR反应中荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。
它的基本原理包括使用引物和探针系统或SYBR Green 染料来检测PCR反应产物的扩增，并通过荧光信号强度和PCR循环数来推导起始模板的数量。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
缺点
实时荧光定量PCR 原理-------标准曲线
绝对定量的标准样品：
已知拷贝数的质粒DNA
相对定量中的内标
• 内标通常是β -actin、GAPDH基 因等看家基因. • 在细胞中的表达量或在基因组 中的拷贝数恒定，受环境因素 影响小. • 内标定量结果代表了样本中所 含细胞或基因组数量.
,是对未知样品
的绝对量(拷贝数)进行测 定的方法; 应用于病毒病原菌定量检 测,转基因拷贝数分析等
相对定量,并不是测定基 因的绝对量,而是分别测 定目的基因和参比基因的 量,再求出对于参比基因 的目的基因的相对量,最 后再进行样品间相对量的 比较 应用于mRNA表达量解析.
实时荧光定量技术的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧
光信号累积实时监测整个PCR进程，最后
通过标准曲线对未知模板进行定量分析的
方法
实时荧光定量PCR 原理----------实时原理
常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产 物进行定量和定性分析。 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时 检测PCR扩增反应中每一
PCR的反应的三个主 要步骤
变性，将双股的DNA加热 后转为单股DNA以做为复 制的模板. 复性 是令引物于一定的 温度下附着于模板DNA两 端。 延伸 在DNA聚合酶的作用 下进行引物的延长及另一 股的合成。
• 合成的原料及水。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR的几种方法介绍
绝对定量
绝对定量的方法相对简单.
未知浓度的样品与标准品同时进行反应，将扩增曲 线得到的Ct值代入标准曲线，就可以得到未知样品 的绝对量。
实时荧光定量pcr技术原理与应用
实时荧光定量pcr技术原理与应用
实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）是一种可以快速、准确测量靶基因拷贝
数目的分子生物学技术。
它结合了传统的PCR技术与荧光探
针技术，利用荧光信号的强弱来反映目标基因的表达水平。
实时荧光定量PCR的原理是，首先通过PCR技术对目标基因
进行放大，然后在PCR反应过程中添加一种含有荧光探针的
试剂。
荧光探针通常由两个部分组成，一个是与目标基因特异性结合的引物，另一个是带有荧光染料与荧光信号猝灭基团的探针序列。
当荧光探针与目标基因的引物结合时，荧光信号被猝灭；当探针与目标基因的模板序列结合并被PCR酶依次截
断时，荧光信号被释放出来。
荧光信号的强弱正比于目标基因在PCR过程中的拷贝数目。
实时荧光定量PCR广泛用于基因表达分析、疾病诊断、基因
突变检测等领域。
通过该技术可以定量测量目标基因的表达水平，比较不同条件下基因表达的差异，研究基因调控机制。
此外，实时荧光定量PCR还可以应用于微生物检测，如检测细菌、病毒、真菌等的数量和变异情况。
这项技术具有快速、高灵敏度、高特异性、高重复性等优点，因此在生命科学研究和临床应用中得到广泛应用。
总之，实时荧光定量PCR技术通过结合PCR和荧光探针技术，可以实现对目标基因拷贝数目的快速、准确测量。
它在基因表达研究、疾病诊断和微生物检测等领域发挥着重要作用。
实时荧光定量PCR原理操作及其应用
实时荧光定量PCR原理操作及其应用实时荧光定量PCR的原理是通过PCR反应循环进行DNA扩增，同时使用特定的荧光探针进行反应监测。
通常使用SYBR Green I染料或荧光探针（例如TaqMan探针或Molecular Beacons）来标记扩增的目标序列。
SYBR Green I染料可以与双链DNA结合，并产生荧光信号，使荧光信号量和PCR产物量成正比。
而荧光探针则与靶标区域特异性杂交，并在PCR 反应中产生荧光信号。
1.DNA/RNA提取：从样品中提取目标DNA或RNA，确保提取的质量和纯度满足后续PCR反应的需求。
2.引物设计：设计和合成适当的引物，用于扩增目标序列。
引物应该具有高特异性，确保只扩增目标序列，而不出现非特异性扩增。
3.qPCR反应体系：配置PCR反应体系，包括引物、模板DNA/RNA，核酸酶、聚合酶、缓冲液和荧光探针（如果使用）。
4.PCR反应程序：设置PCR反应程序，通常包括初步变性、扩增和检测阶段。
PCR循环次数根据目标序列的丰度和检测灵敏度来确定。
5.监测荧光信号：在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度。
根据荧光信号大小可以计算目标序列的拷贝数。
1.基因表达分析：通过qPCR可以定量检测和分析基因在不同生物样品（如组织、细胞）中的表达水平。
2.病原体检测：qPCR可以快速检测和定量病原微生物（如细菌、病毒、真菌）的DNA或RNA，用于临床诊断和流行病学调查。
3.突变分析：qPCR可以检测和定量基因突变，用于遗传病的诊断和研究。
4.体外诊断：qPCR可以用于检测和定量很多疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志物、心脏病标志物等，用于疾病的早期诊断和疗效评估。
5.生物学研究：qPCR可以用于研究和分析基因调控、DNA修复、细胞周期等生物过程，以及研究新的基因和基因功能。
总之，实时荧光定量PCR技术可以实时、准确和敏感地定量检测并扩增DNA或RNA的特定序列，具有广泛的应用前景，对于许多研究和诊断领域都具有重要意义。
实时荧光定量PCR技术
简述实时荧光定量PCR技术1.实时荧光定量PCR技术的原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。
荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理而实现的。
当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。
定量原理：实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。
理想的扩增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。
在PCR 反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并由此推断起始模板含量[2-3]。
实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。
其中Rn+表示每点测量的荧光强度，代表反应管含有模板DNA；Rn-表示荧光基线强度，代表反应管不含有模板DNA，其在理想情况下是一条平线，只具有背景荧光数值；△Rn的值表示PCR过程中，探针降解的量，也即PCR产物的量。
基线(baseline)是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
图1 实时荧光定量PCR的标准扩增曲线荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的10倍，即：Threshold=10SD(cycle 3-15)，一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
广西临床检验中心
对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
广西临床检验中心
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
广西临床检验中心
标准曲线分析
斜率、截距、相关性
广西临床检验中心
数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
广西临床检验中心
TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
实时荧光定量PCR技术详解及总结
实时荧光定量PCR技术详解及总结实时荧光定量PCR技术的原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号变化。
在PCR过程中，当荧光标记的探针与待扩增模板的特定序列结合时，荧光信号增加。
通过实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化，可以定量计算起始模板数量。
与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。
实时荧光定量PCR技术在现代生物学研究中有广泛的应用。
首先，它被广泛应用于基因表达分析。
通过检测特定基因的mRNA水平，可以揭示基因在生物体内的表达情况及其调控机制。
其次，实时荧光定量PCR技术在病原微生物的检测和分析中也发挥了重要作用。
例如，可以利用实时荧光定量PCR技术检测病毒、细菌等病原微生物的存在，并确定其数量，这对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。
此外，该技术还常用于遗传多态性的分析、基因突变的检测、DNA甲基化的检测等。
相对于传统PCR技术，实时荧光定量PCR技术具有多项优势。
首先，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度。
实时荧光定量PCR技术可以实时监测扩增反应的进程，不仅可以提供扩增过程中的荧光信号变化曲线，还可以精确计算起始模板数量，从而实现对少量模板的高灵敏度检测。
其次，实时荧光定量PCR技术具有更高的准确性。
实时荧光定量PCR技术通过测量荧光信号，可以排除PCR反应中的假阳性结果，并准确计算起始模板的数量，从而提高了实验结果的准确性。
此外，实时荧光定量PCR技术的操作流程简单、快速，并以其高通量特点被广泛应用于高通量筛查和生物信息学研究中。
总结而言，实时荧光定量PCR技术是一种重要的分子生物学技术，它通过结合PCR扩增和荧光探针技术，实时监测和定量DNA扩增过程中的荧光信号变化，以实现对目标DNA序列的高灵敏度、高准确性的定量分析。
该技术在基因表达分析、病原微生物检测、遗传多态性分析等领域具有广泛应用。
实时荧光定量PCR技术的发展和应用，为生物学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。
实时荧光定量PCR的原理
(3).目前合成价格较贵. (4).不能做熔解曲线分析.
原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
理想的PCR反应： X=X0*2n (扩增效率=1) 实际的的PCR反应： X=X0* (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
Ct=
-log X0 + log M log(1+Ex)
(5)
Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线 性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出 样品中所含的模板量
原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
原理概述
5.非特异性荧光染料SYBR Green的优缺点
优点：
(1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (4).可做熔解曲线分析 (5).便宜
缺点： (1).对引物特异性要求较高 (2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其 是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出; 需要不断的优化反 应体系,降低非特异性扩增.
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增 和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。
实时荧光定量pcr实验报告
实时荧光定量pcr实验报告篇一：实时荧光定量PCR方法简介实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。
如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
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目录 • 实时定量PCR基本原理
• 实时定量PCR实验材料
• 实时定量PCR实验方法
• 实时定量PCR实验结果
实时定量PCR基本原理
1 实时定量PCR的定义 2 实时定量PCR标准曲线
实时定量PCR的定义 • 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精 确的对起始模板的定量分析
整理方程式得:
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
• 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：
log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
实时定量PCR标准曲线
• 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
106 105
104
103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
定量原理
• 浓度的对数值与循环数呈 线性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数（Ct值） 就可分析样品中起始模板 量定量PCR的实验步骤来自1 标准菌株DNA的提取
2 3 4 5 6 7 QPCR探针和引物的设计 阳性克隆质粒的构建 荧光定量PCR反应 定量标准曲线 重复性实验 灵敏性实验
定量PCR三个基本概念
• 扩增曲线
平台期 背景期 指数增 长期 线性增长期
阈值与C(t)值
• 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍，设定在扩增曲线指数增长期 • C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增 循环次数
C(t) value
Threshold line
18.12 +/- 0.04
C(t) value
定量PCR的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n • 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
实验材料