实验二 细菌的染色实验
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
实验二+细菌的简单染色与革兰氏染色
滴加碘液 媒染1min; 碘液, (6)媒染 滴加碘液,媒染 ) ; 用水洗去碘液; (7)水洗 用水洗去碘液; ) 将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色 乙醇脱色 (8)脱色 将玻片倾斜,连续滴加 ) 乙醇脱色2 0-25s至流出液无色,立即水洗; 至流出液无色,立即水洗; 至流出液无色 滴加沙黄复染5min; 沙黄复染 (9)复染 滴加沙黄复染 ) ; (10)水洗 用水洗去涂片上的沙黄染色液; 用水洗去涂片上的沙黄染色液; ) (11)晾干 将染好的涂片放空气中晾干或者用吸 ) 水纸吸干; 水纸吸干; 镜检时先用低倍,再用高倍, (12)镜检 镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油 ) 镜观察, 镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应 性.
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以 简单染色法 是只用一种染料使细菌着色以 显示其形态, 显示其形态,简单染色不能辨别细菌细胞 的构造. 的构造. 革兰氏染色法是 年由丹麦病理学家C.G 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 年由丹麦病理学家 ram所创立的.革兰氏染色法可将所有的 所创立的. 所创立的 细菌区分为革兰氏阳性菌( G+ ) 和革兰 细菌区分为革兰氏阳性菌 ( 氏阴性菌( 两大类, 氏阴性菌(G-)两大类,是细菌学上最常 用的鉴别染色法. 用的鉴别染色法.该染色法所以能将细菌 分为G 菌和G 是由这两类菌的细胞 分为 + 菌和 - 菌 , 是由这两类菌的 细胞 壁结构和成分的不同所决定的 所决定的. 壁结构和成分的不同所决定的.
六 思考题及作业题
1,当对未知菌进行革兰氏染色时 , 如何保 , 当对未知菌进行革兰氏染色时, 证操作正确及结果可靠? 证操作正确及结果可靠? 2,简述革兰氏染色的原理和步骤. ,简述革兰氏染色的原理和步骤.
球菌
实验二 细菌的革兰氏染色法
实验二细菌的革兰氏染色法一、目的要求1.掌握革兰氏染色的方法及原理。
2.进一步熟悉显微镜的使用二、基本原理1. 革兰氏染色的意义：革兰氏染色的反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医生Gram 创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。
2. 革兰氏染色的原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
三、器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌12～20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。
四、操作步骤1. 涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。
2. 干燥室温自然干燥。
3. 固定固定时通过火焰2～3次即可。
此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4. 初染加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。
5. 媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
6. 脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。
实验二 细菌单染色及革兰氏染色法
冯 新
实验三
细菌单染色及革兰氏染色法
一、实验目的
• 学习细菌的革兰氏染色原理和方法
• 了解细菌的特殊形态结构： 芽孢、荚膜、鞭毛
二、实验原理
• 单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。 • 复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？ 如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？
3）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？ 4）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？ 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？ 哪一步是关键？Why?
实验四
真菌染色技术
2．染色标本检查：
1）革兰氏染色：
4 操作步骤 水浸片观察 （1） 在载玻片上滴加一滴美兰染液，用接 种环以无菌操作方式挑取少许真菌，在染液 中充分混匀，盖上盖玻片。 （2） 镜检：先低倍镜观察，后换用高倍镜 观察细胞形态。 （3）绘出真菌形态特征图
实验步骤
操作步骤
无菌操作
涂片
干燥
染色
固定
水洗
干燥
镜检
革兰氏染色
• 丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 • 细菌细胞壁的结构
革兰氏（Gram）染色法
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸 铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：除去残水后，用稀碘液覆 盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约30－60秒，后立即 用流水冲洗。 5. 复染：滴加石碳酸复红染色液， 染30秒，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
实验二细菌的单染色及革兰氏染色
掌握染色步骤
选择适当的染料，对细菌进行固定、 染色、脱色、复染等步骤，确保染色 效果良好。
掌握革兰氏染色技术
了解革兰氏染色的原理
革兰氏染色是一种用于区分革兰氏阳 性菌和革兰氏阴性菌的染色技术。
掌握染色步骤
在涂片上涂抹细菌，然后使用结晶紫 、碘液和酒精等染料进行染色和脱色
，最后用番红和石炭酸复染。
识别染色结果
革兰氏染色结果分析
染色反应
革兰氏染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类 ，通过染色反应可以初步判断细菌的致病性。
颜色变化
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色，通过颜色变化可以判 断细菌类型。
染色准确性
革兰氏染色准确性较高，对于初步鉴别细菌种类具有重要意义。
实验结果在细菌鉴别中的应用
初步鉴别
通过单染色和革兰氏染色实验结果，可以对细菌进行初步鉴别，确 定可能的致病菌种类。
辅助诊断
在临床诊断中，细菌鉴别对于确定感染源、选择合适的治疗方案具 有重要意义。
科研应用
在科研领域，细菌鉴别可以为研究不同类型细菌的生物学特性、致病 机制等提供基础数据。
06
CATALOGUE
注意事项与实验改进
实验注意事项
实验前需确保实验室环境清洁 ，避免污染。
使用显微镜时，应确保镜头清 洁，以免影响观察效果。
在操作过程中，应避免细菌污 染，尤其是避免交叉污染。
实验结束后，应按照实验室规 定正确处理废弃物。
实验操作技巧与难点解析
01 涂片时，应保证涂片均匀，避免产生气泡 。
02 染色时，应控制染色时间，避免染色过度 或不足。
情况。
02
CATALOGUE
实验原理
实验二细菌单染色及革兰氏染色法
该方法通常使用结晶紫、姬姆萨 染料或瑞氏染料等染料进行染色。
染色过程中，染料能够进入细菌 细胞内，与细胞成分结合，使细
菌着色。
革兰氏染色法原理
革兰氏染色法是一种用于区分革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的染
色方法。
该方法通过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料和试剂，对细菌进行 初染、媒染、脱色和复染等步骤。
将涂片放入复染液中， 使细菌重新染色。
水洗
用流水冲洗涂片，去 除染色液。
干燥
将涂片自然干燥或用 吸水纸吸干。
结果观察与记录
在显微镜下观察染色后的细菌涂片，记录观察到的细菌形态、染色深浅等特征。 根据观察结果，判断细菌的革兰氏染色反应，即阳性或阴性。
记录实验数据和结果，并进行分析和解释。
05
实验结果与分析
细菌单染色结果分析
01
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染色效果
通过细菌单染色，可以清 晰地观察到细菌的形态、 大小和排列情况，为后续 分析提供基础。
染色方法
本实验采用了结晶紫染色 法，该方法操作简便，染 色效果稳定。
注意事项
在染色过程中，需严格控 制染色时间，避免染色过 度或不足，影响观察效果。
革兰氏染色结果分析
染色效果
熟悉染色法的操作流程
细菌单染色法的操作流程
制备细菌涂片→加温固定→加染料染色→水洗→干燥→观察。
革兰氏染色法的操作流程
制备细菌涂片→加结晶紫染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→水洗→沙 黄复染→水洗→干燥→观察。
了解染色结果与细菌特性的关系
细菌单染色法的染色结果
通过观察染色后的细菌，可以初步判断细菌的形态和大小，有助于鉴别细菌种类 。
革兰氏染色法的染色结果
试验二细菌的染色和细菌细胞构造的观察-海南大学
实验二 细菌的革兰氏染色
一、实验目的
• 掌握细菌的革兰氏染色 • 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 • 观察和识别细菌细胞的特殊构造
二、实验的基本原理
• 细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色 有不同的反应（阳性和阴性）： • 革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度 低，当以95%酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变 大，肽聚糖因95%酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量 较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复 合物被95%酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成 红色；
四、实验步骤
• 油镜的使用
1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜， 在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细 调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头 上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油， 最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。
2-1棉塞制作方法
2-2移液管灭菌前 的包装
二、培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）培养基配方： 牛肉膏 2.5g 蛋白胨 5.0g 、 NaCl2.5g、琼脂10.0g、自来水500mL、pH7.2~7.4 。 （二）操作步骤： 1. 取一个1000mL烧杯，装500mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶 解。 注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成 分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并 适当补充因蒸发而损失的水量。
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
实验二细菌革兰氏染色ppt课件
五、思考题
1、讲述革兰氏染色的原理并指出E.C和B.S分别属于革兰 氏阳性或阴性？
2、观察细菌为什么要染色？为什么细菌染色多采用碱性 染料？
3、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色 成败的关键一步是什么？
crystal violet stain
wash with water
Counterstain wi在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱 色
时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足， 革
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等
Heat fixing
Staining
实验二 细菌革兰氏染色
一、实验目的
学习微生物制片、染色的基本技术 掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术 进一步观察细菌的基本形态
二、实验原理
C.Gram（革兰）于1884年 发明的一种鉴别不同类型 细菌的染色方法。
革兰氏染色
1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
4、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色 技术和结果的正确性？
实验二：细菌涂片的制备和染色镜检
提高实验效率
在这次实验中，我们发现了一些 可以改进的地方，希望在未来的 实验中能够通过改进提高实验效
率。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
有助于判断细菌的分类。
细胞质结构
观察细菌细胞质的颜色、颗粒 大小、分布等特征，有助于判 断细菌的种类和生长状态。
鞭毛等特殊结构
观察细菌是否有鞭毛、菌毛等 特殊结构，有助于判断细菌的
致病ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ和分类。
细菌分类的初步判断
革兰氏染色法
通过革兰氏染色法可以将细菌分 为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 两大类，有助于初步判断细菌的
实验细节注意不够
在染色过程中，我发现自己对一些细节问题没有给予足够的重视， 导致染色效果不佳，未来应更加注重细节。
对未来实验的展望
探索更多染色方法
我希望在未来的实验中，能够探 索更多不同的染色方法，以了解
各种方法的优缺点。
深入研究细菌种类
通过这次实验，我对细菌有了更 直观的认识，希望在未来的实验 中能够深入研究更多种类的细菌。
01
02
03
涂片制备
在洁净的载玻片上滴一滴 无菌水，用接种环取少量 细菌样品与水混合，然后 涂抹均匀，制成涂片。
干燥
将涂片放在实验台上自然 晾干，大约需要10-15分 钟。
固定
将干燥后的涂片放入火焰 中加热，使细菌固定在载 玻片上，防止在染色过程 中脱落。
染色镜检
染色
脱色
选择适当的染色液（如结晶紫、番红等） ，将涂片浸入染色液中，染色时间根据染 色液和细菌种类而定。
常用染色方法
革兰氏染色、抗酸染色、荧光染色等。
染色镜检的观察方法
显微镜观察
实验二 细菌的革兰氏染色
实验二细菌的革兰氏染色法一、实验目的1．学习革兰氏染色的原理。
2．掌握革兰氏染色的方法。
二、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂——碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色；最后用蕃红复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色（红色）者为革兰氏阴性菌。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
三、实验器材1．菌种：大肠杆菌、葡萄球菌。
2．试剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）)碘液、95%乙醇、0.5%番红染色液。
3．器材及其它：显微镜、载玻片、酒精灯、接种环、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
四、操作步骤1．涂片：斜面菌种：取一块洁净无油的载玻片，滴加一滴无菌水，以无菌操作挑取菌苔少许，在无菌水中涂匀。
菌悬液：用接种环以无菌操作钓取菌液2-3滴，均匀涂抹在洁净无油的载玻片上。
（注意涂片切不可过于浓厚）。
2．干燥：将涂好的玻片于室温下自然干燥。
（也可利用酒精灯上方的热空气加热干燥，但要注意以玻片不烫手为宜。
）3．固定：将干燥后的涂片通过酒精灯火焰2-3次，加热国定。
固定的目的：（1）杀死细菌并使其粘附在玻片上（2）增加其对染料的亲和力。
实验二-细菌的革兰氏染色
实验二-细菌的革兰氏染色摘要在本实验中，我们学习了细菌的革兰氏染色方法，它是一种常用的细菌分类技术。
通过革兰氏染色，可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在实验中，我们将细菌样本进行了革兰氏染色，并观察了染色后不同类型菌落的变化。
背景细菌的革兰氏染色是细菌学中常用的分类技术，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏染色的原理是利用不同类型菌壁对染色剂的染色特性。
革兰氏阳性菌具有较厚的层状菌壁，菌壁数量较多且含有高量的肽聚糖和穿孔蛋白，故在革兰氏染色中易被靛基紫染色，即为紫色。
而革兰氏阴性菌菌壁较少，含有脂质多糖结构，靛基紫容易被脱色，失去颜色，再染上对比色——碘液后，在有机溶剂乙醇中去除结晶紫染料，洗净后再用第二种常规染色溶液（抗色素溶液）染色，为粉红色。
实验方法和步骤1.将郑重筛选发酵技术及纯化分离后的细菌分别进行涂片。
2.在涂片上滴上靛基紫染剂，静置1分钟，然后用水冲洗。
3.在涂片上滴上碘液，静置1分钟，然后再次用水冲洗。
4.滴上有机溶剂乙醇将片洗去结晶紫染料，然后再滴抗色素溶液在片上静置1~2分钟。
5.用水冲洗干净，然后把涂片放到显微镜下观察即可。
结果与分析在此次实验中，我们观察到了不同类型菌落的变化。
在涂片上的细菌，经过靛基紫的染色后，革兰氏阳性菌的细胞呈现出紫色颜色，而革兰氏阴性菌的细胞颜色并没有明显变化。
在加上碘液后，革兰氏阴性菌的细胞依旧没有变化，而革兰氏阳性菌的细胞则变得更加明显，呈现更深的紫色。
在使用有机溶剂乙醇将片洗去结晶紫染料后，再加上抗色素溶液，革兰氏阳性菌的细胞会继续呈现紫色，而革兰氏阴性菌的细胞则变成粉红色。
据此可知，我们通过革兰氏染色的方法，有效地将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
此外，我们还观察到不同类型菌落的变化，这对于后续实验中判断细菌种类及其特性非常有帮助。
细菌的革兰氏染色是一种常用的细菌分类技术，在本实验中我们成功地实现了对不同细菌样本的革兰氏染色及观察。
实验二细菌的简单染色与革兰氏染色
通过显微镜观察，判断细菌是否着色，从而初步判断细菌的种类。
了解革兰氏染色的原理和操作方法
了解革兰氏染色的原理
了解染色结果
通过使用两种不同的染料，使细菌呈 现不同的颜色，从而区分革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌。
通过显微镜观察，判断细菌是否被染 色以及呈现的颜色，从而确定细菌的 革兰氏类型。
革兰氏染色的目的是区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，因为这两种类 型的细菌在染色结果上存在明显的差异。
03 实验材料
菌种察。
金黄色葡萄球菌
另一种常见的细菌样本，具有不 同的染色特性。
染色液
结晶紫染色液
用于细菌的简单染色。
革兰氏染色液
用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
简单染色的原理是利用染料对细菌的亲和力不同，将细菌染成不同的颜色，从而区 分不同类型的细菌。
简单染色方法简便、快速，但染色效果不如革兰氏染色。
革兰氏染色原理
革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，通过使用结晶紫、碘液和酒精 等染料对细菌进行染色。
革兰氏染色的原理是利用结晶紫和碘液对细菌的亲和力不同，将细菌染 成紫色或红色，再通过脱色剂酒精将细菌脱色，最后用番红和碘液复染。
其他试剂和器材
显微镜
用于观察染色后的 细菌。
酒精灯和接种环
用于加热染色液和 接种细菌样本。
无菌水
用于清洗玻片和细 菌样本。
载玻片和盖玻片
用于放置和观察细 菌样本。
吸管和滴管
用于吸取染色液和 其他试剂。
04 实验步骤
细菌的简单染色
01
02
03
涂片制作
将细菌均匀涂在载玻片上， 晾干后进行染色。
染色
出细菌的细胞壁结构特点。
实验二细菌的染色及形态观察
实验二细菌的染色及形态观察一、目的要求1、了解细菌染色的基本原理。
2、掌握细菌的简单染、革兰氏染色及其他染色方法。
3、观察和识别细菌的形态及细菌细胞的特殊结构。
二、实验说明细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。
由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。
用于细菌染色的染色剂是苯环上含有发色基团和助色基团的化合物。
发色基团使化合物本身具有染色之能力，助色基团有电离特性，可以于被染物结合，使被染物着色。
染色剂有三种：酸性染色剂（电离后分子带负电荷）；碱性染色剂（电离后分子带电荷）；复合染色剂（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色剂）。
酸性染色剂主要用于染细胞质；碱性染色剂主要用于染核和异染颗粒等细胞结构；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次氏体。
三、实验材料1、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
2、酒精灯、接种环、载玻片。
3、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、荚膜染色液、鞭毛染色液（配方见附录）。
四、方法步骤（一）简单染色法步骤：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检。
1、涂片在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水，以无菌操作法，从斜面上挑取少量菌种，在载玻片上和水混合后，涂成一均匀薄层。
2、干燥固定涂片让其在空气中自然干燥，有时为使其干燥得快点，也可在酒精灯上加温，但勿贤紧靠火焰。
3、固定待涂片干燥徨，手持载玻片一端，有菌膜的一面向上，在酒精灯火焰上通过几次（用手背触载玻片背面，以不烫手为宜），待冷却后，再加染料。
4、染色玻片置于水平位置。
加石炭酸复红液于菌膜部位。
染1-2min。
5、水洗倾去染液，斜置玻片，用很细水流的自来水冲洗（切勿使水流直接冲刷在菌膜处），直至洗下水呈无色为止。
6、干燥自然干燥或用吸水纸吸干。
7、镜检。
（二）革兰氏染色法步骤：涂片干燥固定结晶紫染色水洗吸干 95%酒精脱色水洗吸干蕃红复染水洗干燥镜检。
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实验五 细菌简单染色的操作步骤
沾取菌样
涂片 干燥 固定
水洗、吸干 镜检 染色2min
五
染色结果
枯草芽胞杆菌示意图 六 注意事项
1 菌龄合适。 2 注意涂片均匀，不宜过厚。
实验六 细菌的革兰氏染色法
一 目的与要求 1 掌握细菌的革兰氏染色法 2 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性 二 基本原理 革兰氏染色法基本步骤：涂片固定 结晶紫初染色 碘液媒染
实验七 细菌的芽胞染色法
一 目的与要求
1 掌握细菌芽孢染色的方法及原理 2 初步了解芽孢杆菌的形态特征
二 基本原理
芽胞的简介；芽孢染色的原理；
三 主要器材
1 枯草芽胞杆菌(约2d的培养物) 2 5%孔雀绿、0.5%番红染色液
四 实验操作步骤（改良的Schaeffer-Fulton染色法)
1 2 3 4 5 6 菌液制备：取2滴生理盐水或蒸馏水于EP管中，沾取菌苔2环在水中混匀。 染色：EP管中加入5%孔雀绿3滴混匀，将在沸水浴中加热15~20min。 涂片固定：过火焰固定。 脱色：水洗至无绿色。 复染：0.5%番红染色3min。 镜检：油镜观察，绘出显微镜下观察到的结果。
微生物染色的基本知识
一 微生物染色的意义 1 进行微生物研究的基本技术; 2 微生物形态特征观察的基本方法; 3 不同形态微生物鉴别的基本技能。 二 微生物染色的染料
① 碱性染料（basic dye）—电离后为带正电荷的阳离子，可 与细胞中带负电的组分结合。如Crystal violet, Safranin, Methylene blue，malachite green等。 ② 酸性染料（Acid dye）—电离后为带负电荷的阴离子，可 与细胞中带正电的组分结合。如Eosin, Congo red , Acid fuchsin 等。 ③ 脂溶性染料—如Sudan black。
实验六 细菌的革兰氏染色法
三 主要器材 1 金黄色葡萄球、大肠杆菌(约24培养物) 2 结晶紫、番红染色液 四 染色方法
涂片制作
涂片固定
结晶紫初染2min
sec
水洗
番红复染2min
五
染色结果
革兰氏阳性菌——紫色
革兰氏阴性菌——红色
六
注意事项
1 菌龄合适。 2 注意涂片均匀，不宜过厚。 3 注意控制好脱色程度。
1 胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）无氮培养 基约2d的培养物。 2 绘图墨水（用滤纸过滤后的绘图墨水稀释1倍使用）。 四 实验操作步骤（湿墨水法) 1 制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。 2 加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向 下轻压，吸去多余的菌液。 3 镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
革兰氏阳性菌：紫色
乙醇脱色 番红复染
革兰氏阴性菌：红色
革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性(G-)表现出不同染色反应的根本原因 在于它们的细胞壁结构存在差异。
革兰氏阳性、阴性菌细胞壁结构的差异
Structure of a Gram-Positive Cell Wall
Structure of a Gram-Negative Cell Wall
五
染色结果
兰绿色部分为芽胞；红色部分为菌体和孢囊
六 注意事项
1 注意掌握供试验菌种的培养时间。 2 制备菌液时，取菌量适宜。
实验八 细菌的荚膜染色法
一 目的与要求
掌握细菌荚膜染色的方法及原理
二 基本原理
荚膜不易着色，且易被水洗，采用衬托染色使菌体和前景着色，荚膜在菌体 周围形成一透明圈。
三 主要器材
五
染色结果
透明部分为荚膜
六 注意事项
1 注意掌握供试验菌种的培养时间。 2 控制好墨水的稀释倍数。
细菌染色的方法
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法
细胞壁染色法
抗酸染色
革兰氏染色
实验五 细菌的简单染色法
一 目的与要求 1 掌握细菌的简单染色法 2 初步认识细菌的形态 3 巩固油镜的使用方法 二 基本原理 碱性染料电离后带正电能与带负电荷的细菌结合合,使其着色。 三 主要器材 1 枯草芽胞杆菌( 12~18h培养物) 2 吕氏碱性美兰染色液 3 仪器与用具(略) 四 染色方法 见下图