焦磷酸测序技术的原理
(医学PPT课件)pyrosequencing焦磷酸测序
Fast
Simple
Dedicated Software
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
3’TAAGCCGAATG
16
Multiplexing
SNPs located on different fragments…... …..or on the same
17
Principle of multiplexing
Design of sequencing primers and dispensation order
Single nucleotide InDels (e.g. [C]) Multiple nucleotide InDels (e.g. [CGACGGT])
11
CYP2D6 - A2637del (Allele 3)
T/T
Sequence (reverse) : TCC[ T ]GTG
T/-
3
ref
ref
2,5
2
1,5
1
0,5
0 TA GCT G CA CG AT G
18
User creates a SNP/ mutation sequence database
Software calculates theoretical genotyping results
Each DNA fragment is assigned a color
-/-
12
Large deletion
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平，而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。
正是在这样的历史背景下，焦磷酸光化测序技术（pyrosequencing）由瑞典研究人员发明。
焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于通过合成测序原理进行酶促反应的DNA测序方法，通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定，以及DNA甲基化水平变化的分析等。
近年来，随着摄影器材和成像技术的快速发展，这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光，因此，有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。
该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献，首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理，然后介绍该技术的应用，最后讨论其发展前景。
关键词：人类基因组计划; 焦磷酸光化测序; 基因变异; 基因型; DNA甲基化;Abstract：The Human Genome Project（HGP）not only greatly improved the understanding of human genome and related genetic information, but also promoted the development of technologies in life science research. It was under this historical context that pyrosequencing was invented by Swedish researchers. Pyrosequencing is a method of DNA sequencing based on the sequencing by synthesis principle with enzymatic reactions, and relies on light detection based upon a chain reaction when pyrophosphate is released. The application of this technology involved the detection of DNA nucleotide sequences and mutations, the identification of genotypes of single nucleotide polymorphisms, the analysis of changes in DNA methylation levels etc. With the recent rapid development of photographic equipment and imaging technology, this technology is expected to have an increasing sensitivity in signal detection. Based upon the working experiences in Sweden for nearly 30 years and accumulated literature, this review first clarified the basic principles of pyrosequencing, then introduced the applications of this technology, and finally discussed its development prospects in the near future.Keyword：Human Genome Project; pyrosequencing; genetic variation; genotype; DNA methylation;1 、引言本世纪是生命科学的世纪。
碱基测序技术原理及其进展
碱基测序技术原理及其进展摘要：自1953年，剑桥大学科学家弗朗西斯.克里克(Francis crick)和博士詹姆斯华生(Jamers waston)发现DNA双螺旋结构以来，已经走过近60年。
在这期间，有关DNA的研究如火如荼。
DNA碱基排列顺序中存在生物的遗传信息，为了的到DNA碱基顺序，研究者先后研发出不同的测序技术获得碱基信息。
从1953年至今，碱基测序技术可以划分为三代，下面主要介绍第一代、第二代测序原理及其存在的优劣。
关键词：cDNA sanger测序法焦磷酸测序法第二代测序法1.1977第一代—sanger测序法及Maxam-Gilbert化学裂解法。
1.1sanger测序法1977年英国的F.sanger设计了 Sanger双脱氧链终止法[1]，其原理：双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2’, 3’-双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，将延伸的DNA 链特异性地终止。
其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA 聚合酶。
共分四组，每组按一定比例加入一种ddNTP，它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，再通过电泳分离，可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。
由于放射性同位素标记对实验人员的身体有害及准确性低等原因，又对sanger测序法进行了技术上的改进，采用荧光素标记、毛细管电泳的全自动测序技术。
1.2 Maxam-Gilbert化学裂解法1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法—Gilbert化学裂解法原理：将待测DNA片段的5’端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核苷酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样(Lane- by-lane)的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影技术，即可读出目的DNA的碱基序列。
焦磷酸测序名词解释
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
焦磷酸测序简介
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 32 -
Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
PCR
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
PCR引物（其中一条有生物素标记）必须 HPLC纯化或相当； PCR必须高保真，建议PyroMark PCR Kit (200) (cat. no. 978703) ，扩增体系和条件 见右图； 一般用5~20ul扩增物 (Q24 Adv) ；
主要内容
一，焦磷酸测序简介
.
. 二，Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 三，仪器维护
.
-1-
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序简介
基于合成的测序（边合成边测序），对DNA 序列进行精确分析和定量分析。
焦磷酸测序反应 体系中有4 种酶
DNA-Polymerase（DNA聚合酶） ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶） Luciferase（荧光素酶） Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶） 每次只加一种dNTP（A，T，C，G）
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 28 -
Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 29 -
Sample & Assay Technologies
基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]
![基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]](https://img.taocdn.com/s3/m/6f61366fb84ae45c3b358c72.png)
a/g C T G C C T A/G Heterozygote Single height ref peaks 单个高度的参考峰 Double height ref peak两倍高 度的参考峰
Genotype:基因型 2 half height peaks 两个半高峰
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only
- 15 -
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序流程
实验设计 测序 PCR 试样预处理， 获得单链模板
结果分析
1-2h /96 sample
SNP: 10min/96 sample SQA:35 min/96 sample 15 min/96 sample
Homozygous G 纯合子G
GCTGCCT --------CGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A
G
C
T
A
G
Heterozygous A/G 杂合子A/G
ACTGCCT --------TGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A G C T A G
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only -6-
Reference Peaks参考峰
Sample & Assay Technologies
Pyro技术原理
Pyrogram™ 的产生
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
焦磷酸测序技术简介及临床意义
焦磷酸测序技术简介及临床意义
PyrosequencingTM (焦磷酸测序技术)是一种基于4种酶的级联反应来进行定量序列分析的技术。
通过对病人样本DNA序列的直接测定，从而与已知DNA序列进行对照，从而对病人的病情作出判断。
不仅可以指导临床用药，甚至可以对未来的病情发展做出预测。
目前焦磷酸测序技术越来越多的应用在病毒的分型和耐药分析、微生物快速鉴定和肿瘤的个性化治疗中。
与传统的检测方法相比，焦磷酸测序技术由于是直接得到目的核酸片段的序列，所以又被称为分子诊断中的“金标准”。
焦磷酸测序技术原理及应用
焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。
焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行DNA甲基化、SNP等单个/连续多个核苷酸变异进行实时定量检测提供了非常理想的技术操作平台。
一.焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。
焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)．荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。
焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。
反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。
1.每次加入一个dNTP,在聚合酶作用下产生一个焦磷酸（PPi）；2.硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比).3.多余的dNTP被降解，开始新一个循环.4.测序结果2.技术平台：QIAGEN公司PyroMark Q24，PyroMark Q48Autoprep，PyroMark Q96ID焦磷酸测序仪.3.焦磷酸测序实验流程4.焦磷酸测序技术应用1)DNA甲基化检测2)全基因组甲基化水平检测：LUMA法4.SNP定量检测/等位基因差异表达检测。
焦磷酸测序
罗氏454测序系统中文名罗氏454测序系统测试原理基于焦磷酸测序法特点依靠生物发光对DNA序列进行检测测序流程支持各种不同来源的样品序列测定测试原理GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。
在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
测序流程1. 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。
2. 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。
短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4。
3. 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。
接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。
图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。
4. 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。
5. 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。
经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。
6. 数据读取和分析工具：GS FLX系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。
pyrosequencing焦磷酸测序
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
1. Assay Design
Example of a general target: 16S gene
Relative
1,000 0,900
Relative peak height =
75 %
peak1 height peak1 height + peak2 height
peak height
0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1分子的dNTP掺入，释放出1分子的PPi，生成1分子的 分子的dNTP掺入，释放出1分子的PPi，生成1 dNTP掺入 PPi ATP， ATP，产生单位强度的光信号
Pyrosequencing： Pyrosequencing： Quantitative Accuracy Test
C/C C/G G/G
PCR产物中加入 streptavidine包被的 sepharose beads
EtOH NaOH
振荡温育 5-10 min 变性，生物素标记的 单链结合于beads并被 真空吸附于Vacuum Prep Tool上
Water Washing buffer
PCR product immobilize d on Sepharose beads
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
焦磷酸测序
Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。
第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。
第二步——四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。
注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。
第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。
ATP sulfurylasePPi+APS —————————> ATPLuciferase，ATPLuciferin —————————> oxyluciferin光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。
每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
第五步——然后加入下一种dNTP。
在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram™的信号峰中决定。
利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。
e7-3焦磷酸测序与深度测序
e7-3 焦磷酸测序与深度测序1. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其参入到引物链的3′-端，并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。
PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。
每个峰值的高度与反应中参入的核苷酸数目成正比。
第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。
整个测序反应分为四步[图e7-3(1)]：图e7-3(1) 焦磷酸测序的原理（1）将单链DNA模板与其特异性的测序引物结合，然后加入四种酶的混合物，包括：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（A TP sulfurylase，APS）、荧光素酶（luciferase）和双磷酸酶（apyrase）。
反应底物有腺苷-5′-磷酸硫酸（adenosine-5′-phosphosulfate，APS)和荧光素（luciferin）。
（2）向反应体系中加入1种dNTP，如果它正好能和DNA模板的下一个碱基配对，就会在DNA 聚合酶的作用下，被添加到测序引物的3′-端，同时释放出1分子的PPi。
dA TP 由腺苷-α硫-三磷酸（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate，dATPαS）替代，原因是DNA聚合酶对dATPαS的催化效率比对dA TP的催化效率高，且dATPαS不是荧光素酶的底物。
（3）在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合，形成氧化荧光素，同时产生可见光。
通过电荷耦合器（charge coupled device，CCD）光学系统，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量A TP在双磷酸酶的作用下发生降解。
（5）加入另一种dNTP，按第2、3、4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
罗氏454焦磷酸测序技术
仔猪肠道菌群的形成
新生动物肠道菌群形成可以划分为以下几个阶段 [3,4,5,6]。
第一阶段:新生动物出生两周以内，肠道内的细菌定 植方式基本相同。结肠内首先出现杆菌和肠链球菌，随之 很快出现双歧杆菌并成为优势菌，这个时期肠道菌群的特 点是不稳定，容易发生变化。
第二阶段:出生后两周到断奶以前，动物在母乳喂养 下，肠道内细菌主要以厌氧菌为主，主要为双歧杆菌，肠 杆菌和链球菌数量较少。这个阶段的特点是肠道菌群容易 受食物的影响，食物的微小改变就可以引起肠道菌群发生 较大的变化。
肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）
DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代 表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使 代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图 谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、 直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的 结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳 （Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10,11,12]和末端片段长 度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism, T-RFLP） 等。
UniFrac 是一种通过计算系统发育树上序列的进化距离，比较不同微生物群 落结构差异的系统发育进化方法。 UniFrac方法在比较不同微生物群落结构的差 异时，不仅考虑物种的丰度，更考虑序列之间的进化距离。
参考文献
1. Zoetendal E, Koike S, Mackie R, et al. Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota: A review. J of Nutrition, 2004, 134:465-472.
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Pyrosequencing技术的原理Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。
其基本原理如下：第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。
第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。
第2步图示(图片来自互联网)第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。
通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
第3步图示(图片来自互联网)第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。
第4步图示(图片来自互联网)第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
第4步图示(图片来自互联网)Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。
→如果您认为本词条还有待完善，请编辑词条上一篇SNP（单核苷酸多态性）下一篇阅读质粒图谱具体事例【摘要】建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称“SRPP”)。
先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签，PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。
用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量，并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。
【关键词】序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达1 引言差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。
目前，用于检测基因表达水平的技术主要有SAGE法[1]、实时荧光定量PCR法[2,3]和基因芯片法[4]等。
但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等缺点。
焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要使用荧光标记，定量性能好。
目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微生物分型和基因甲基化分析等。
本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析，考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的差异表达。
2 实验部分仪器、试剂与材料21R型台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司);Gene SpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日本Naka Instrument公司);PTC225 PCR扩增仪、Opticon实时荧光PCR仪(美国MJ Research 公司)。
焦磷酸测序装置由本实验室自行组装[9,10]。
此装置主要由焦磷酸测序反应模块、荧光信号放大和数据采集3部分组成。
反应模块由位于中间的反应池通过毛细管与四周的dNTP储液池相连组成。
通过注射器施压使4种dNTP循环加入反应池完成测序反应。
荧光信号通过R6335光电倍增管(日本Hamamatsu Photonics .公司)放大后，经BPCL微弱发光测量仪(北京中国科学院生物物理研究所)采集数据。
Hotstar Taq DNA聚合酶、Omniscript RT kit反转录试剂盒(德国Qiagen公司);Trizol(上海Inviotrogen公司);荧光素、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和5′磷酸化硫酸腺苷(美国Sigma公司); Dynabeads M280链霉亲和素磁珠(挪威Dynal AS公司); Klenow DNA 聚合酶(美国Promega公司);所有引物均由上海Invitrogen公司合成。
实验中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝组织由南京师范大学生命科学学院提供。
RNA的提取用Trizol试剂盒抽提RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度及纯度。
反转录合成cDNA第一链取等量的不同来源的总RNA，分别以来源特异性反转录引物反转录。
即取总RNA ～μg 至Nuclease free的小管中，加DEPC H2O至12 μL;65 ℃反应5 min后，置冰上至少1 min;在上述各小管中加入10×第一链合成缓冲液2 μL， mmol/L dNTP混合物，10 U RNase 抑制剂，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 μmol/L反转录引物，加DEPC H2O 至总体积为20 μL。
反转录条件为：37 ℃反应1 h, 93 ℃反应5 min，然后中止反应。
基因特异性PCR不同来源的cDNA等比例混合，以共用引物CP(5′CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC3′)和生物素标记的基因特异性引物(GSP)进行扩增反应。
PCR体系为： cDNA等比例混合液1 μL，μmol/L CP和GSP， mmol/L Mg2+， mmol/L dNTP 混合物，10×PCR 缓冲液 5 μL，5×Q 溶液10 μL ， 1 U HotStar Taq DNA聚合酶，并加入灭菌蒸馏水至50 μL。
PCR反应程序为： 94 ℃变性 15 min，热循环35次(94 ℃, 40 s; 60 ℃, 40 s; 72 ℃, 1 min )，72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。
基因特异性引物的序列见表1。
表1 实验用引物焦磷酸测序固相单链模板的制备取5 μL戴诺磁珠(Dynabeads)，用磁铁吸弃上清液。
磁珠以100 μL B&W Buffer(10 mmol/L Tris HCl, pH , 1 mmol/L EDTA, mol/L NaCl)洗涤两遍，最终悬浮于50 μL B&W 缓冲液中;加入50 μL PCR产物，37 ℃反应30 min;用磁铁吸弃上清液，磁珠以180 μL H2O 洗涤两遍，加入 mol/L NaOH溶液20 μL，混匀室温放置5 min使PCR产物变性;磁铁吸弃上清液，磁珠以100 μL B&W 缓冲液洗涤两遍，100 μL 1×退火缓冲液洗一遍，最终溶于8 μL 1×退火缓冲液中;加入1 μL 10 μmol/L测序引物，93 ℃混匀30 s，55 ℃退火3 min，4 ℃保存，待测序用。
焦磷酸测序反应焦磷酸测序标准混合液的组成为： mol/L Tris Ac缓冲液(pH ，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L Mg(Ac)2，% BSA，1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，3 μmol/L 5′磷酸化硫酸腺苷(adenosine5′phosphosulfate，APS)，μg/L PVP， mmol/L D虫荧光素，2×10-4 U/L 三磷酸腺苷硫酸化酶，2×10-3 U/L 三磷酸腺苷双磷酸酶，18×10-3 U/L无外切酶活性的Klenow DNA聚合酶， mg/L荧光素酶。
3 结果与讨论方法原理焦测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技术。
其原理是：引物与模板DNA退火后, 在DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)的协同作用下完成循环测序反应。
当加入的dNTP与模板互补时，DNA模板与互补的dNTP聚合可以产生等摩尔PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi与5′磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生成等量的ATP;在荧光素酶催化作用下，ATP与虫荧光素(luciferin)反应发出荧光。
产生的荧光信号强度与聚合的测序模板量和碱基数成正比，根据加入的dNTP类型和测得的荧光信号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列。
反应方程式如下：(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+l+PPi(1)PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2)ATP+Luciferin+O2luciferaseAMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+hv(3)dNTPApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4)ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5)为了定量测定基因表达量差异，本研究将碱基序列标记法与焦磷酸测序解码技术相结合，其关键点在于：在不同来源的同一基因中标记上区别样品来源的特异性标签;对标记序列进行解码和定量测定。
采用反转录引物将来源特异性碱基标记到各来源待测基因，然后用焦磷酸测序定量测定标记序列。
具体测定过程如图1所示：(1) 用来源特异性反转录引物对不同来源的RNA进行反转录。
引物由4部分组成：5′端为共用序列;位于引物中间的4个碱基为人为设计的来源特异性标签，在图1中以深浅不同的4个小圆点表示;3′端为oligo(dT)n和用于固定oligo(dT)n位置的两个兼并碱基。
来源特异性反转录引物的碱基组成和数目都相同，只是位于中间的来源特异性碱基的排列位置有所差异;(2) 不同来源的cDNA稀释后等比例混合;(3) 用生物素标记的基因特异性引物和共用引物扩增上述混合物，通过改变基因特异性引物就可以进行任何基因的表达量差异分析;(4) 用磁性微球技术将PCR产物制备成单链，根据来源特异性反转录引物中来源标签序列进行焦磷酸测序。
测序结果中，各来源特异性碱基的相对峰高即代表相对基因表达量差异。
本方法称之为SRPP法(Sequence tagged reverse transcription PCR with pyrosequencing)。
图1 碱基序列标记法结合焦磷酸测序解码技术测定基因表达量差异的原理图Principle of comparative gene expression analysis by coupling sequence tagged reverse transcription polymerase chain reaction(PCR) with pyrosequencing (SRPP)由于不同来源的同一基因在单管中只用一对引物进行PCR，并且扩增产物的碱基组成和含量完全一样，仅4个碱基的排列顺序不一样，具有相同的保留时间。