羧基化氧化石墨烯的血液相容性

Vol．31高等学校化学学报No．12 2010年12月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES2354 2359

羧基化氧化石墨烯的血液相容性

徐东1，2，周宁琳1，2，3，沈健1，2，3

（1．南京师范大学化学与材料科学学院，江苏省生物医药功能材料工程研究中心，

2．江苏省生物功能材料重点实验室，南京210097；

3．南京大学江苏省表面与界面工程技术研究中心，南京210093）

摘要采用超声法制备了氧化石墨烯，并利用化学改性的方法，将氧化石墨烯表面的羟基和环氧基转变为

羧基．在红外光谱中羧基化氧化石墨烯（GeneO-COOH）的羧基振动明显，峰强增大．静态水接触角测试结果

表明，羧基化氧化石墨烯改性成功，其亲水性提高显著．GeneO-COOH的主要失重表现为羧基官能团缩合以

一个水分子的形态释放失去结构水［OH2］．复钙动力学曲线随着GeneO-COOH的浓度增加，曲线上升趋势

由陡峭趋于平缓，当浓度为1.25μg/mL时复钙时间延长了11min，平台期OD值降低了8.14%；GeneO-COOH在0.5 100μg/mL浓度范围内溶血率均小于5%．GeneO-COOH比GeneO在同等低浓度下的抗凝血

性能有一定程度的改善，主要是因为GeneO-COOH中—COO－带有负电，其与血浆蛋白的静电排斥和对凝血

因子Ca2+的络合，使得GeneO-COOH的抗凝血性能有所提高．结果表明，羧基修饰氧化石墨烯是提高抗凝

血性能的有效手段．

关键词羧基；表面改性；氧化石墨烯；血液相容性

中图分类号O613.71文献标识码A文章编号0251-0790（2010）12-2354-06

二维炭材料自被发现以来引起了研究人员的广泛关注［1，2］，新型二维炭材料氧化石墨烯已成为研究热点．与昂贵的富勒烯和碳纳米管相比，氧化石墨烯价格低廉，原料易得，有望成为聚合物纳米复合材料的优质填料．近年来，Ruoff等［3］利用化学方法相继研制出石墨烯/聚合物导电纳米复合材料和无支撑的氧化石墨烯纸，使氧化石墨烯的应用研究成为热点［4，5］，而氧化石墨烯在生物材料领域的研究与应用却鲜见报道．2003年，我们课题组［6 10］开始研究氧化石墨以及聚合物/氧化石墨纳米复合材料在生物医药领域，特别是在抗凝血方面的应用．我们利用计算机模拟［11，12］研究，初步探讨了材料表面不同官能团与血液中蛋白片断相互作用的分子动力学原理，获知亲水性表面一般具有良好的生物相容性．极性基团（如—OH和—COOH）对水分子有较大的亲和能力．在水溶液中，—OH呈中性，—COOH可以部分电离而带有电荷．在亲水性表面，带电基团与表面带相反电荷的血浆、蛋白间的静电相互作用通常是血浆吸附到表面的驱动力，表面的吸附数量取决于它们之间的静电平衡［12，13］．正常人体血管壁内皮细胞的电位值为负值，血液中的红细胞、白细胞及血小板等均带负电荷，而—COO－也带有负电荷，不易发生粘附及其它相互作用．因此，羧基修饰的亲水表面有利于提高抗凝血性能．氧化石墨烯（Graphene oxide，GeneO）的结构与石墨烯大体相同，只是在六角环形片状体碳原子上连接有羰基、羟基、羧基和环氧基等官能团．表面化学组成对抗凝血性能有很大影响．为了发挥氧化石墨烯的优良性质，如提高它的溶解性及在基体中的分散性等，必须对其进行有效的功能化［14］．羧基改性的GeneO在功能化GeneO的制备中占有重要的地位．利用GeneO表面的活泼羧基，通过酰胺化或酯化反应，可使各种有机小分子、高分子、生物大分子以及含有活泼基团的功能材料被共价结合到GeneO上．本实验选用氯乙酸与氧化石墨烯在碱溶液中反应，以活化氧化石墨烯表面的环氧基与羟基，使其转变成为羧基，从而制得羧基改性的氧化石墨烯（GeneO-COOH）．通过红外光谱、热重分析和静态水

收稿日期：2010-03-01．

基金项目：国家自然科学基金（批准号：20874047）、江苏省自然科学基金（批准号：BK2009408）和“211工程”重点学科建设项目基金资助．

联系人简介：周宁琳，女，博士，教授，主要从事生物功能材料的研究．E-mail：zhouninglin@njnu．edu．cn

接触角实验对羧基的结构和含量进行了表征与测试．通过溶血实验和血浆复钙实验评价了改性前GeneO 和改性后GeneO-COOH 的血液相容性，证明羧基官能团修饰对氧化石墨烯抗凝血性能有较大影响．

1

实验部分

1．1

试剂与仪器

石墨（粒度≤30μm ，国药集团化学试剂公司）；发烟硝酸（A．R．级，上海化学试剂有限公司）；氯酸钾（A．R．级，上海试四赫维化工有限公司）；一氯乙酸（A．R．级，上海金山化工厂）；氯化钙（A．R．级，天津市化学试剂六厂三分厂）；磷酸氢二钠（A．R．级，上海凌峰化学试剂有限公司）．成人全血及去血小板血浆由江苏省血液中心提供．

KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）．FTIR Nexus 670型（Nicolet

公司）红外光谱仪，实验条件为：分辨率4cm －1，扫描次数64次，扫描范围4000 400cm －1

，KBr 压

片；SL200B 型动态/静态接触角仪（美国科诺工业有限公司），测试条件：以水为接触角测试液，水体

积3μL ；7系列热重分析仪（美国Perkin-Elmer 公司），测试条件：高纯氮气气氛，升温速率10ħ/min ，气流量50mL /min．1．2

羧基化氧化石墨烯的制备

称取1g 由改良的B 法［9，15］

制得的氧化石墨（GO ），加入到一定浓度的碱液中超声分散2h ，得氧

化石墨烯（GeneO ）胶体，再加入过量的氯乙酸［16］

，继续超声2h ，将氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基．将溶液反复离心水洗至中性以除去杂质，得到均相的羧基化氧化石墨烯溶液，记作GeneO-COOH．1．3

分析测试

分别采用FTIR 光谱仪、动态/静态接触角仪和热重分析仪对所制备的羧基化氧化石墨烯进行表征

和测试．

1．4血液相容性测试1．4．1

溶血实验取含抗凝剂的成人全血8mL ，加入含0.9%NaCl 的水溶液10mL 稀释，得稀释血

液．用0.9%NaCl 配制不同浓度的GeneO 和GeneO-COOH 溶液，每管10mL ，于37ħ恒温30min 后加入稀释血液0.2mL ，轻轻摇匀，继续保温60min 后，以1000r /min 速率离心分离10min ，吸取上清液0.2mL 移入96孔板中，用BioTek synergy2酶标仪在545nm 处测定其吸光度值．

用10mL 蒸馏水加0.2mL 稀释血液得阳性对照样品，用10mL 0.9%NaCl 水溶液加0.2mL 稀释血液得阴性对照样品．保温条件和测定方法与样品相同，实验组和对照组均取3管的平均值．溶血率按下式计算：

溶血率（%）=

D t －D nc

D pc －D nc

ˑ100%

式中，D t 为实验样品吸光度；D nc 为阴性对照吸光度；D pc 为阳性对照吸光度．

若溶血率小于5%，则表明材料符合生物材料溶血实验要求；若溶血率大于5%，则表明材料有溶

血作用［8］

．

1．4．2血浆复钙实验用0.9%NaCl 配制不同浓度的GeneO 和GeneO-COOH 溶液（0.5，1，1.25和

2.5μg /mL ），于37ħ恒温30min．分别取0.025mol /L CaCl 2溶液、去血小板血浆（Poor platelet plas-

ma ，PPP ）和待测溶液各0.1mL 加入到96孔板中，用BioTek synergy2酶标仪在405nm 波长处测定复

钙时间动力学曲线．对照组采用0.1mL CaCl 2溶液加0.1mL PPP．每组实验重复3次取平均值［7］

．

2

结果与讨论

2．1

FTIR 分析

采用FTIR 光谱法分析了GeneO 的结构，由图1可见，其中含有羟基（3440cm －1

）、羧基（1740，

5

532No．12徐东等：羧基化氧化石墨烯的血液相容性