实验四 PEG介导的细胞融合

实验四 PEG介导的细胞融合

一、实验目的：

（1）通过PEG介导的鸡血细胞融合实验，对体细胞融合有一个清楚的概念。（2）初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。

二、实验原理：

利用PEG介导动物细胞融合的原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲和以及彼此间表面张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合并在一起，使两细胞的胞质沟通，从而造成相互接触的细胞之间发生融合。

利用PEG介导细胞融合，其融合效果受以下几种因素的影响。

1、PEG的分子量与浓度

细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG得分子量越大、浓度越高，对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000-4000，浓度一般为40%-60%。

2、PEG的pH值

经验证，PEG的pH值在8.0-8.2之间融合效果最好。

3、PEG的处理时间

处理时间越长，融合效果越好，但对细胞的毒害作用也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中那个细胞融合后无需继续培养，故处理时间可适当放宽至数分钟。

4、融合时的温度

由于生物膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果，在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞，一般采用的温度为38℃-40℃。

本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为：①鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；②实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有1个核，定为未融合细胞；有2至多个核，定为融合细胞。

三、实验用品：

1、材料：新鲜鸡血；

2、试剂：

（1）Alsever液：葡萄糖（2.05g）枸椽酸钠（0.8g）氯化钠（0.42g）重蒸水（至100mL）

（2）生理盐水（0.85%）

（3）GKN液：氯化钠（8g）氯化钾（0.4g） Na2HPO4•2H2O（1.77g）

Na2HPO4•H2O（0.69g）葡萄糖（2g）酚红（0.01g）

溶于1000mL重蒸水中

（4）50%PEG液（现用现配）：根据实验需要，称取适量PEG（Mr.4000）放入刻度离心管内，在酒精灯上将其融化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热的GKN液并充分混匀。

3、器材：

（1）主要设备：普通离心机、普通光学显微镜。

（2）小型器材：100mL量筒，滴管，10mL刻度离心管，载玻片、盖玻片。

四、实验方法：

（1）注射器内先吸入2mL Alsever液，在从活鸡的翼下静脉抽取鸡血2mL，注入试管内，再加入Alsever液6mL，使之成为1：4悬液，混匀后放在4℃冰箱中，可使用3-4天。（该步骤已经提前完成）

（2）取出上述悬液1mL加入0.85%生理盐水4mL，混匀后，1200r/min离心5分钟，除去上清液后，在以上述离心速率重复离心两次（第一次5分钟，第二次10分钟），以达到去除细胞表面黏附物质的目的。

（3）去除上清液后，将最后一次离心沉降的血球，加入适量GKN液（2mL），使之成为10%的细胞悬液。

（4）去上述调整后的血球悬液1mL，加入0.5mL 50%的PEG液混匀，吸取1-2滴，滴到一干净的载玻片上，在常温下2-3分钟后即可加上盖玻片进行镜检，并计算出融合率。

五、实验结果：

经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞，融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。

细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。

六、分析与讨论：

1、本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？为什么？

答：不能。植物细胞有细胞壁，细胞膜在细胞壁的阻碍下不能相接触，PEG无法破解这层细胞壁则无法介导其细胞融合会阻碍细胞膜融合。应事先用纤维素酶和果胶酶处理，将植物细胞壁去除，提取其中的原生质体才可进行细胞融合。2、本实验的材料为什么不用兔子或小鼠的血细胞？

答：因为兔子和小鼠都是哺乳动物，而哺乳动物的成熟血细胞没有细胞核，细胞融合后不便于进行实验结果的观察。