基因工程制药-3 表达
(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)
第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。
2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。
3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。
5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。
2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。
3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。
简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。
《基因工程制药》课程教学大纲
《基因工程制药》实验教学大纲课程代码：BIOP1026课程名称：基因工程制药英文名称：Gene Engineering Pharmaceutical Science实验室名称：生物制药实验室（二）课程学时：90实验学时：36一、本课程实验教学目的与要求本课程是生物制药专业的专业实验课程，是以基因工程基本操作为主线，强调实验方法的经典性、实用性。
实验内容涉及了基因工程制备药物的主要过程，通过本课程的学习使学生掌握基因工程的一些基本原理和实验操作方法，并使其对基因工程制药的上、下游技术有一个完整的概况，力求全面、系统地培养学生基因工程制备药物的实验操作能力，并提高解决问题及分析研究问题的能力，为本科生进入科研实验室打下良好的基础。
二、主要仪器设备及现有台套数恒温培养箱、恒温摇床、高压灭菌锅、电子天平、微量移液器、凝胶成像系统、超净工作台、台式离心机、旋涡混合器、磁力搅拌器、琼脂糖凝胶电泳槽、电泳仪、PCR仪、水浴锅、垂直电泳槽、发酵罐、电转仪。
微波炉、脱色摇床、制冰机三、实验课程内容和学时分配四、考核方式1、实验报告：本门课程要求实验报告应具有“实验目的与要求、原理、实验基本过程、实验结果与讨论”等几个方面的内容。
2、考核方式（1）实验课的考核方式：本课程按等级制评定与考核，评分标准分为：A、B、C、D、E五个等级。
考核主要包括两部分：实验操作技能、实验报告（包括实验预习报告）。
（2）实验课考核成绩确定，实验课成绩占课程总成绩的比例等：在该课程的评定分数中，实验课内容占30%，其中实验课考核又分为两部分，即实验操作技能占实验课总分数的60%、实验报告（包括实验预习报告）占实验课总分数的40%。
五、实验教材、参考书1、教材：自编参考楼士林主编《基因工程》，科学出版社20072、参考书目：（1）基因工程技术实验指导，钟卫鸿主编，化学工业出版社 2007（2）基因工程实验指导，朱旭芬主编，高等教育出版社，2006（3）基因工程实验技术，彭秀玲编著，湖南科学技术出版社 1997《酶工程制药》实验教学大纲课程代码：BIOP1027课程名称：酶工程制药英文名称：Enzyme Engineering Pharmaceutical science实验室名称：药学院实验中心生物制药实验室课程学时：90实验学时：36一、本课程实验教学目的与要求本课程实验教学的目的是让学生掌握酶制剂的发酵生产方法、酶的固定化原理与操作方法、酶分子的修饰原理和实验方法等，加深学生对抽象的理论内容的理解；通过实验训练，培养学生的动手操作能力和观察能力，正确掌握实验仪器的使用方法和实验操作技能，培养学生独立解决问题的能力和严谨的科学态度。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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基因工程在生物制药领域的应用探讨
基因工程在生物制药领域的应用探讨作者：匡光永来源：《中国民商》2021年第08期摘要：随着经济社会的发展，生物制药领域开始引入基因工程技术，使用基因工程技术对自身进行改造和发展。
本文从生物制药领域中的基因操作技术分析概念入手，进行以基因工程为基础的其中几类药物类型的分析，从而了解基因工程生物制药所面临的机遇以及需要解决的问题，从而使其得到更好的发展。
关键词：基因工程;生物制药;前景一、生物制药领域中的基因操作技术分析（一）基因大分子分离技术DNA大分子的分离技术，最常用的是DNA电泳。
在电泳之前，首先要提取基因所在的位置，以细菌的质粒DNA为例，现阶段使用的提取方法是碱裂解法，具体是将含有质粒的大肠杆菌用NaOH和SDS混合的变性液进行处理，再用高速离心机离心处理，从而将质粒DNA分离出来。
进一步地，如果想要分离出目的DNA片段，就需要用到DNA电泳技术，常用的电泳是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
凝胶电泳的原理其实很简单，DNA是一种多聚阴离子，将其放置在电场中，DNA分子就会迁移到正电极的方向，DNA分子的长度越长，携带的净电荷越多，向正电极方向迁移的速率就越快，因此，在电场强度一定的条件下，DNA 分子的迁移速率取决于DNA片段的大小和构型。
电泳的步骤为：配胶-制胶板-样品的处理-点样-电泳-检测。
（二）PCR技术PCR技术，即聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术，可以实现短时间内少量甚至微量DNA分子的大量扩增。
PCR技术是分子克隆技术的基石，是基因工程中必不可少的技术。
PCR技术的原理来源于DNA的半保留复制，在生物体内，DNA的复制过程分为三个阶段：复制的起始、延伸和终止，PCR也分为三个阶段：高温变性、复性和延伸，这三个阶段不断的循环往复，从而得到大量的目的基因。
PCR技术已广泛应用于基因的克隆，分子探针的制备和基因定位等实验中，在生物制药领域中也常用于诊断试剂的开发。
第三章基因工程制药
究，从而扩大这些物质的引用范围； • （3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质； • （4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白
质工程进行改造和去; • （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2019
IFN-γ 125Ser IL-2 生长激素（GH） 痢疾疫苗 牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
2020/4/23
批准年份 2019 2000
2019 2019 2019 2019
2019
药品
125Ala IL-2 人胰岛素 Anti-CD3鼠源单抗
人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 表皮生长因子（EGF） EGF衍生物 霍乱疫苗（rBS-WC）
双脱氧末端终止测序法
2020/4/23
2020/4/23
模板序列
测序 读片
2020/4/23
近年来，建立了一种使用荧光染料的无放射性标记 的DNA测序法。它使用4种不同颜色的荧光染料分别 标记4种不同的碱基，并在一个凝胶电泳的泳道中进 行电泳，然后通过激光作用诱发荧光，达到检测碱基 的目的。
2020/4/23
作业 查阅资料，准备ppt、课程论文介绍某种
基因工程药物的生产工艺。
2020/4/23
一、基因工程药物
• 1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国Eli Lilly公司
问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品， 迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会 效益和经济效益。
血友病
2020/4/23
第四章基因工程制药
3.基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制
4.基因工程技术的主要工具: * Tool enzyme 工具酶:restriction enzyme, ligase, repair. * Nucleic acid and protein sequence:Basis for gene analyze and synthesis. * Transfer vector: gene transfer * Expression vector: Manufacture plant for gene replication and expression target products. Good Vectors: Ecol. ,---- High efficiency expression but glycoprotein Beer yeast , mammalian cell ----glycoprotein
5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测 序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）
二、化学合成法
较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成 法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基 因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序， 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
10mM Tris 1mM EDTA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使
oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。
3、cDNA第二链的合成：
基因工程制药
基因工程制药基因工程制药是指利用生物技术手段，通过基因克隆、遗传工程、细胞培养等技术制备的药物。
相比传统的制药技术，基因工程制药具有高效、精准、无毒副作用等优点。
本文将从基因工程制药的概念、制备过程、应用、发展现状等方面进行介绍。
一、基因工程制药的概念基因工程制药是指利用遗传工程技术，将DNA序列插入到细胞内，使细胞能够表达人类所需的有效蛋白质，从而制备出符合医疗需求的药物。
基因工程制药的研发已成为制药业的重要领域，具有广阔的市场前景和潜力。
二、基因工程制药的制备过程基因工程制药的制备过程包括基因选择、基因克隆、载体构建、转染细胞、发酵培养和纯化等步骤。
1、基因选择基因工程制药的制备过程首先要选择适合人体治疗的基因，可以是已知的治疗目标基因，也可以是新发现的疾病相关基因。
2、基因克隆基因克隆是将目标基因从DNA分子复制到载体上的过程。
其中包括PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，最终得到包含目标基因的重组载体。
3、载体构建为了使目标基因的表达量达到较高水平，需要将目标基因克隆到适合的载体中。
典型的载体包括质粒和病毒。
4、转染细胞将重组载体转染到宿主细胞中，宿主细胞将目标基因表达成蛋白质。
常用的宿主细胞有哺乳动物细胞和真菌等。
5、发酵培养将转染后的细胞进行大规模培养，加入培养基和营养成分，进行培养和生长。
由于基因工程制药药物的生产量较大，通常采用发酵技术进行生产。
6、纯化将发酵得到的药物纯化出来，使其达到医药级别要求。
通常采用多种分离纯化技术，如超滤、离子交换和透析等，得到纯度高、活性好的药物制剂。
三、基因工程制药的应用基因工程制药已经广泛应用于多种疾病的治疗中，如慢性病、肿瘤、代谢性疾病和遗传性疾病等。
其中常见的基因工程制药药物有类风湿关节炎药物、肿瘤靶向药物、生长激素、重组人胰岛素和重组人血小板等。
1、类风湿关节炎药物抗肿瘤类药物通过影响免疫系统来治疗类风湿关节炎。
这些药物通常在类风湿关节炎患者无法耐受非甾体类抗炎药物和光合作用药物时使用。
基因工程制药中常用的上、下游技术
• HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK) • Myc-tag (EQKLISEEDL)
和Plac杂合成的Ptac，启动强度分别是Ptrp的3倍
和 Plac 的 11 倍。启动子的强弱程度还与所控外源 基因的性质密切相关。
优化转录调控元件
双启动子表达载体
• 为提高转录活性，增加外源基因的 表达量有时将两个启动子串联到一起。 • 两个不同的启动子串联， 如 PR+T7 • 两个相同的启动子串联, 如 T7+T7
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型表达的优缺点
• 优点：
• 外原基因的表达量极高，对宿主细胞的 生长和代谢影响小 • 抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强 • 目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化
• 缺点：
• 必须复性
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
分泌型表达
• 分泌型表达的特点： • 在 N 端加上能够跨膜的信号肽序列。这对 重组蛋白的折叠可能有一定好处；由于跨膜是 逐个进行的，蛋白间的交联机会较少；周质中 的蛋白酶活性比胞质低；周质蛋白仅占菌体总 蛋白的4%，使之易于纯化。但分泌到周质中的 重组蛋白其构象不一定是天然构象，在周质中 的重组蛋白也可能形成包涵体。
外源基因染色体定位整合原理
•
根据DNA同源交换原理，在外源 基因两侧各组合一段与染色体特定 部位完全相同的同源序列。外源基 因越长同源序列也需越长。
外源基因在大肠杆菌 中的高效表达的方法
基因工程制药
第三节 目的基因的获得
难点： 真核生物的单拷贝基因在整个基因中很小 部分； DNA很大，组建物理图谱和基因定位很难； 真核生物基因含内含子是断裂基因，它在 原核生物中不表达。
克隆真核基因常用方法：反转录法， 反转录-聚合酶链反应法，化学合成法， 筛选基因和对已经发现的基因进行改造。
分离到含有目的基因的阳性克隆后，
必须对其作进一步的验证和鉴定。主要是 限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、 基因测序、确定基因的转录方向、转录起 始点等。
二、化学合成法
较小的蛋白质或多肽的编码基因 可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序 或目的蛋白质的氨基酸顺序。 原理：DNA是由3’，5’-磷酸二酯键连接 技术：DNA自动合成仪
基因工程药物：采用基因工程技术研制的， 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目 的基因插入载体，拼接后转入新的宿主 细胞，构建成工程菌(或细胞），实现 遗传物质的重新组合，并使目的基因在 工程菌内进行复制和表达的技术。
用化学法合成目的基因DNA不同部位的 两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端 形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些 双链片段按正确的次序进行退火使连接成较 长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基
因。
人工化学合成基因的限制有：
⒈不能合成太长的基因。目前 DNA 合 成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 50～60 bp，因此只适用于克隆小分 子肽的基因。
《基因工程制药》课件
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
基因工程制药名词解释
基因工程制药名词解释基因工程制药是指利用基因工程技术生产药物的过程。
以下是基因工程制药常见名词的解释：1. 基因工程：基因工程是一种利用生物技术改变生物体遗传物质的方法。
通过人为选择和转移与特定功能相关的基因，可以改良生物体的性状或让其产生特定的产物。
2. 表达载体：表达载体是指一种DNA分子，用于传递外源基因到宿主细胞中，并使外源基因能够表达出目标蛋白质。
表达载体通常包括启动子、转录终止信号、选择性标记基因等元素。
3. 重组蛋白质：重组蛋白质是通过基因工程技术在外源表达系统中合成的蛋白质。
这些蛋白质通常是具有特定功能或药理学活性的，例如抗体、生长因子和酶等。
4. 重组DNA技术：重组DNA技术是指将不同来源的DNA片段组装到一起，形成新的DNA序列。
这项技术是进行基因工程研究和制药生产的关键步骤之一。
5. 基因转导：基因转导是将外源基因转移到宿主细胞中的过程。
通常通过病毒载体或非病毒载体传递外源基因到宿主细胞中，从而使宿主细胞表达目标蛋白质。
6. 选择标记基因：选择标记基因是用于筛选宿主细胞是否成功转导外源基因的标志性基因。
常见的选择标记基因包括抗生素抗性基因或含有发光标记的基因。
7. 纯化：纯化是将合成的重组蛋白质从杂质中分离出来的过程。
常见的纯化方法包括亲和纯化、离子交换层析和凝胶过滤。
8. 质量控制：质量控制是对基因工程制药产品的开发、生产和分析过程进行监控，以确保产品的质量符合国际质量标准。
质量控制包括产品的物理、化学和生物学测试等。
9. 免疫学制剂：免疫学制剂是一种通过基因工程技术生产的用于治疗疾病的药物。
免疫学制剂包括疫苗、单克隆抗体等，可通过调节和加强免疫系统来预防和治疗疾病。
10. 基因治疗：基因治疗是一种利用基因工程技术修复或替代患者缺陷基因的治疗方法。
通过将正常的基因导入患者体内，可修复或恢复患者体内缺少或异常的基因功能，从而治疗疾病。
基因工程技术在生物制药领域的应用和发展
基因工程技术在生物制药领域的应用和发展
基因工程技术在生物制药领域的应用和发展具有重要作用，主要表现在以下几个方面：
1. 基因工程生产重组蛋白：通过基因工程技术，可以将感兴趣的基因转入微生物、动植物等宿主中，使其表达所需的蛋白质。
这样可以大规模生产许多重要的蛋白质药物，如细胞因子、抗体、血液凝块因子和疫苗等。
2. 基因工程合成药用基因：通过基因工程技术，可以合成药用基因，用于治疗遗传性疾病。
例如，基因工程合成的血细胞凝聚促进因子（EPO）可以用于治疗贫血，基因工程合成的人胰岛素用于治疗糖尿病等。
3. 基因工程开发新型药物：基因工程技术可以将多个基因从不同的生物体中组合、修饰或改造，创造出新的药物。
例如，通过基因工程技术，可以将人体细胞中的基因导入小鼠胚胎中，产生具有人类免疫系统的小鼠，用于评估新药的疗效和安全性。
4. 基因编辑技术的应用：随着CRISPR-Cas9等基因编辑技术的发展，基因工程技术在生物制药领域的应用进一步扩大。
通过基因编辑技术，可以精确修改生物体的基因组，用于研究疾病机制、开发新药和治疗遗传性疾病等。
未来，随着基因工程技术的进一步发展和创新，生物制药领域的应用也将得到更广泛的推广和应用。
基因工程技术将为药物研发提供更多可能性，加速新药的开发和生产，进而改善人们的健康水平。
基因工程制药(3)
基因工程制药(一) (二) (三) (四) (五) (六) (七) (八) (九) (十)概述 基因工程药物生产的基本过程 目的基因的获得 基因表达 基因工程菌的稳定性 基因工程菌生长代谢的特点 基因工程菌发酵 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的质量控制 基因工程药物制造实例(九)基因工程药物的质量控制原核生物表达的重组蛋白质量检测重组蛋白的质量控制指标包括：重组蛋白的鉴别（序列） 重组蛋白的纯度（杂质的类型） 重组蛋白的活性（检测方法） 重组蛋白的安全性 重组蛋白的稳定性 重组蛋白的一致性（构象与构型）原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法检测项目 检测项目 检测方法 检测方法产品是否含内毒素 产品是否含内毒素 蛋白质是否变异 蛋白质是否变异 甲硫氨酸是否被甲酰化 甲硫氨酸是否被甲酰化家兔热原法 家兔热原法 肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳 肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳 肽谱、质谱、HPLC、Edman分析 肽谱、质谱、HPLC、Edman分析蛋白质是否变性、聚合、脱氨基 SDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质 蛋白质是否变性、聚合、脱氨基 SDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质 谱、HPLC、毛细管电泳、Edman分析 谱、HPLC、毛细管电泳、Edman分析 配体是否脱落 配体是否脱落 氨基酸是否发生取代 氨基酸是否发生取代 SDS-PAGE、免疫分析 SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳 氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳是否被细菌、病毒、支原体等污染 微生物学检测 是否被细菌、病毒、支原体等污染 微生物学检测药物的特点 含量少 活性高 安全、可靠 有效基因工程药物研发过程临床前 临床实验 新药申请 批准投放市场新药研究进度表临床前试验 年数 1 2 3 期 4 5 期 6 7 ～ 期 8 批准 9 10人数－20～80人100～300人1000～3000人动物 实验安全性 剂量 70疗效长期毒性通过率（％）30－3520－3020IND (Investigational New Drug Application) NDA (New Drug Application) PLA (Production License Application)基因工程药物(1)活细胞作为表达系统 (2)化学性质:活性蛋白质或多肽; 相对分子量 较大，结构复杂;性质或剂量，对理化条件的 要求高 (3)全过程严格控制、鉴定质量基因工程药物生产工艺过程 种子的贮存培养种子细胞株分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定基因工程药物质量控制 原材料的质量控制培养过程质量控制分离纯化过程的质量控制 目标产品的质量控制一、原材料的质量控制确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。
生物制药--基因工程制药--ppt课件可编辑全文
组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 （oligo-dT 亲和层析法）
• 借助于逆转录酶，以 mRNA 为模板，以 oligo-dT 为引物， 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链； • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增，即“逆转录
－PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法：将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段，然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增， 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性，酶切位点丰富。含 T7lac 启动子；含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签，便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC（平末端）
Haemophilus parainfluenzae
基因工程制药的基本过程
基因工程制药的基本过程
基因工程制药的基本过程包括：
1.选择目标基因：首先要从所有存在的基因中根据需要选择目
标基因。
2.克隆目标基因：将目标基因克隆到适当的载体中。
在这个过
程中，需要使用不同的限制性内切酶和连接酶对DNA进行操作，将目标基因插入到载体中。
3.转化目标细胞：利用转化技术将重组的载体带有目标基因的DNA转化到目标生物体的细胞中。
4.筛选获得重组生物体：利用适当的筛选技术，筛选出带有目
标基因并且表达该基因的细胞。
筛选的方法可以是选择性培养基、DNA杂交、荧光染色等。
5.表达目标蛋白：在获得重组生物体后，利用适当的生产条件（例如温度、pH值、培养基等）刺激目标基因表达目标蛋白。
6.纯化目标蛋白：利用各种生物化学纯化技术对目标蛋白进行
分离和纯化。
7.制剂和药物研发：将纯化的目标蛋白进行制剂开发和药物研发，包括剂型设计、剂量确定、毒理学和临床试验等。
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化
反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA，而要 分离纯化目的基因的mRNA，其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA，mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 （polyA)组 成的末端，长达20~250个腺苷酸，足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的 作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被i洗脱下来， 经过两次寡聚(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的mRNA。
我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。 20 世纪70年代末以来，开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家 汁划，特别是国家"863"高技术计划的优先支持下， 使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点 是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。
简述基因工程制药的基本流程
简述基因工程制药的基本流程基因工程制药是利用基因工程技术来开发和生产药物的过程。
它涉及到多个步骤和方法，以下是基本流程的简要概述：1. 目标基因的选择：首先确定需要表达的目标基因，该基因可能是人类或其他生物体产生的具有治疗作用的蛋白质或多肽。
2. 基因克隆：利用DNA重组技术将目标基因从其自然来源中分离出来，并将其插入到适当的表达载体中，以便将基因导入到宿主细胞中。
3. 基因导入和表达：将经过修饰的表达载体导入到宿主细胞中，这可以通过多种方法实现，如转染、电穿孔或基因枪等。
一旦基因在宿主细胞中被导入，它将开始表达并产生目标蛋白质。
4. 培养和扩增：在适当的培养条件下，培养宿主细胞以扩增转基因细胞群。
这通常需要使用培养基和特定的生长因子来促进细胞生长和表达目标蛋白质。
5. 蛋白质纯化和分离：通过选择合适的纯化方法，如离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等，将目标蛋白质从细胞中纯化出来。
这可以帮助去除杂质并提高目标蛋白质的纯度和活性。
6. 质量控制：对纯化后的蛋白质进行质量控制检测，包括对其纯度、结构和活性的分析。
这确保生产的药物符合安全和有效的标准。
7. 药物制剂：将纯化后的目标蛋白质制备成具有良好稳定性和生物可用性的药物制剂。
这可能涉及到药物配方、缓冲剂的选择、冻干或液体制剂的制备等。
8. 临床试验和批量生产：经过严格的临床试验验证其安全性和有效性后，药物可以进行批量生产。
这包括大规模的生产、包装、贮存、分发和监管，以确保药物的质量和安全。
通过这些基本流程，基因工程制药能够生产出大量具有疗效的蛋白质药物，用于治疗多种疾病，并为人类健康做出贡献。
基因工程技术在生物制药中的应用
基因工程技术在生物制药中的应用在当今的医学领域，生物制药无疑是一颗璀璨的明星，而基因工程技术则是推动生物制药发展的强大引擎。
基因工程技术的出现和不断发展，为解决人类的健康问题带来了前所未有的机遇，也为生物制药产业带来了革命性的变革。
基因工程技术，简单来说，就是通过对生物体基因的改造、重组和表达，来实现特定的生物功能或生产有用的生物制品。
在生物制药领域，它的应用范围非常广泛，涵盖了从药物的研发、生产到质量控制等多个环节。
首先，基因工程技术在药物研发方面发挥着至关重要的作用。
传统的药物研发往往依赖于从天然产物中筛选活性成分，或者通过化学合成来制备药物。
这种方法不仅效率低下，而且往往难以获得具有理想疗效和安全性的药物。
而基因工程技术则为药物研发提供了全新的思路和方法。
通过基因工程技术，科学家们可以深入了解疾病的发生机制，从而针对性地设计和开发药物。
例如，对于某些遗传性疾病，如囊性纤维化，科学家们通过研究相关基因的突变情况，开发出了能够修复基因突变的基因治疗药物。
此外，基因工程技术还可以用于生产抗体药物。
抗体是人体免疫系统产生的一种蛋白质，能够特异性地识别和结合病原体或异常细胞，从而发挥免疫防御作用。
利用基因工程技术，科学家们可以将人类抗体的基因导入到细菌、酵母或哺乳动物细胞中，使其大量表达和生产抗体药物。
这些抗体药物具有高特异性、高亲和力和低副作用等优点，在肿瘤、自身免疫性疾病等领域取得了显著的疗效。
其次，基因工程技术在药物生产方面也具有显著的优势。
传统的药物生产方法往往受到原材料供应、生产工艺复杂等因素的限制，导致药物生产成本高昂、产量有限。
而基因工程技术则可以通过构建基因工程菌或基因工程细胞系，实现药物的大规模工业化生产。
以胰岛素为例，胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。
过去，胰岛素主要从动物胰腺中提取，不仅产量有限，而且由于动物胰岛素与人胰岛素在结构上存在一定差异，容易引起免疫反应等副作用。
而利用基因工程技术，科学家们将人胰岛素基因导入到大肠杆菌或酵母细胞中，使其能够高效表达和生产人胰岛素。
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• 利用低浓度的IPTG诱导可提高可溶蛋白 的含量。
(4)蛋白质的包涵体形式表达与蛋白质 复性
• 包涵体是指在某些生长条件下，大肠杆菌能
积累某些特殊的生物大分子(主要是蛋白质组 成)，它们在细胞内致密地聚集成没有生物活
性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒，或被膜
包裹或形成无膜裸露结构。 • 包涵体主要由蛋白质组成，其中大部分是克 隆外源基因的表达产物。
（3）供给丰富的培养基，创造最佳条件，如供
氧、pH。
包涵体蛋白的分离、纯化
• 包涵体的形成不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋
白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。
• 由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一 步是对培养收集的细胞进行 破碎 ，有效的方法是高压
匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心 ，可使大
抑制子基因及PR启动子、pRC23的PL启
动子及SD序列
优点:
①cIts857抑制子基因与PL启动子同在,以便选用
蛋白酶活低的宿主细胞,使表达产物不易降解; ②SD序列后面紧跟多克隆位点,便于插入带起始 ATG的外源基因,可表达非融合蛋白; ③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象, ④质粒小,有利于增加其拷贝数及容量,可以插入 较大片段的外源基因; ⑤PR与PL启动子串联,可以增强启动作用。本系 统为温度诱导,外源基因表达量可达到细胞总 蛋白的20%-30%, 包涵体形式存在, 不易被降 解,均一性好。
即可将包涵体从细胞裂解物中分离出来）
• 减少对宿主菌的毒害
包涵体形成的原因
• 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物 中翻译后修饰所需的酶类，致使中间体大量积累，容 易形成包涵体沉淀。
• 缺乏蛋白质折叠过程中需要的某些酶和辅助因子，
或环境不适，无法形成正确的次级键等，也是原因之 一。
• 表达量越高越容易形成包涵体。可能因为合成速度
以CNBr处理去除融合多肽示意图
凝血因子Xa切割融合蛋白示意图
GST融合表达载体 pGEX6p-3
GST纯化
例
• 上清液加入1mL 50%的 谷胱甘肽-琼脂糖珠 混 悬液中，室温下轻轻混匀超过2min。加50mL冰浴预 冷的PBS液洗涤，混匀， 500g离心10s。用PBS液洗 涤2次，用1～2mL冰冷的PBS重悬琼脂糖珠，并移入 一个1.5mL微量离心管中。 • 室温下500g离心10s收集琼脂糖珠，弃上清液。加
• 表达非融合蛋白的操纵子:
细菌或噬菌体的启动子一细菌的核糖体结合位 点(SD序列)一真核基因的起始密码子一结构基 因一终止密码。 • 要求：SD序列与翻译起始密码ATG之间的距离 要合适 • 特点：非融合蛋白能够较好地保持原来的蛋白 活性；容易被蛋白酶破坏；非融合蛋白N末端 带有甲硫氨酸,可能引起人体免疫反应。
（1）化学裂解
可采用诸如溴化氰（Met↓）、BNPS-3-甲基吲哚 （ Trp↓ ） 、 羟 胺 （ Asn↓Gly ） 等 试 剂 或 低 pH （Asp↓Pro）来进行融合蛋白的化学裂解。
（2）酶解
• 温和；高度专一性。 • 有用的酶有：凝血酶、肠激酶、Xa因子、凝乳酶、胶 原酶等。这些酶都具有较长的底物识别序列（比如在 凝乳酶中为7个氨基酸），从而降低了蛋白质中其他无 关部位发生断裂的可能性。 • 肠激酶和凝血酶应用最多，因为它们切割各自的识别 序列的羧基端，就使带有天然氨基端的被融合部分得 以释放。
融合表达质粒pBG-2的结构
pET系统
• LB培养基或M9培养基中生长良好； • 产物以包涵体形式存在于细胞内 • 外源基因最大表达量可占细胞总蛋白的 50%。中试生产中,可以用乳糖代替IPTG 作为诱导剂, 降低发酵成本； • 新的PET系统带有his标记, 标记与克隆 位点之间有酶切割位点,使产物能方便地 使用金属整合物分离材料进行分离,一步 达到高纯度、高收率。
(1)表达载体需要具备的条件
1、能够独立复制，复制能力强，多用松弛型； 2、具有灵活的多克隆位点； 3、具有方便的筛选标记； 4、具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA 聚合酶识别； 5、具有很强的终止子； 6、mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和SD序列； 7、一般具有阻遏子，使启动子受到控制
• 宿主细胞有两类：
原核细胞表达体系（大肠杆菌、枯草芽孢杆
菌、链霉菌）； 真核细胞表达体系（酵母、哺乳动物细胞）
1.原核细胞表达体系
• 大肠杆菌(Eschertchia coli) EPO能否 研究的比较多，技术成熟； 在本体系 进行表达? 操作方便；成本低； 不存在翻译后修饰作用，对蛋白质产物 不能糖基化； • 枯草芽孢杆菌 分泌能力强；具有若干种有
表达载体的基本结构
Ribosome Promoter binding site
Terminator
Gene
DNA RNA transcript
(2)基因工程药物常用的表达载体 • pBV220(3.66kb)系统，
• pET系统
pBV220表达系统
• pBV220系统组成:
pUC8的多克隆位点、核糖体rrnB基 因终止信号、pBR322第4245－3735位、 pUC18第2066－680位、 噬菌体cIts857
实现分泌表达的条件
• 合适的信号肽(碱性磷酸酶信号肽(phoA)、
膜外周质蛋白信号肽(OmpA)、霍乱弧菌 毒素B亚单位(CTXB)等)；
• 培养条件：培养温度影响着分泌的速度，分泌 速度又与蛋白质的正确折叠有关； • 启动子的强度和诱导剂的浓度也有影响； • 目前普遍接受的观点：
低温，低强度的启动子和较低浓度 的诱导剂，可能实现分泌表达。
太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
正确配对，过多的蛋白间可能存在非特异性结合，蛋 白质无法达到足够的溶解度等。
减少包涵体形成的策略
（1）降低重组菌的生长温度。
（2）促进重组蛋白质可溶性表达的生长 添加剂： 高浓度的多醇类、蔗糖可以阻止分泌到周质的 蛋白质的聚集反应。其它添加剂还有乙醇（诱 导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二 硫化合物（改变细胞周质的还原态，影响二硫 键的形成）等。
• 缺点：
动物细胞生产周期长，培养条件苛刻等
二. 大肠杆菌中的基因表达
大肠杆菌应用最广泛、最成功的表达 体系，常常作为高效表达的首选体系
1.载体
• 载体的作用是把外源DNA带进宿主细胞，并使
之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细胞内繁 殖、传代或进行表达。 • 载体主要有质粒、粘性末端质粒、噬菌体和病 毒。 • 载体按照其用途可分为：克隆载体、表达载体、 转移载体、探针载体。
pRSET
2.影响目的基因在大肠杆菌中表达的
因素
（1）外源基因的拷贝数:高拷贝的表达质粒 （2）外源基因的表达效率： 强启动子 核糖体结合位点（RBS）有效性 SD序列和起始密码ATG的间距 选择偏爱的密码子 （3）表达产物稳定性,不易被降解 （4）细胞的代谢负荷：防止表达产物的毒性 （5）优化工程菌的培养条件
Gene
DNA
Vector
mRNA
Host cell
protein
tet四环素诱导产生的a-synuclein蛋白质
一. 宿主细胞的选择
• 对宿主细胞的要求：
容易获得较高浓度的细胞，能利用价廉易得 原料，不产生内毒素、不致病，需氧低，发热量 低，适当的发酵温度，易进行代谢调控，易进行 DNA重组技术操作，产物的产量、产率高，易进 行分离纯化等。
于二硫键的正确形成。
信号肽序列
• 信号肽：15-30个疏水Aa残基组成，N-端的小段肽链
是以带正电荷的赖氨酸和精氨酸为特征，随后是以疏 水Aa为主的肽段，在邻近切割位点处常有几个侧链很 短的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸等。
• N–端带正电荷的一段：有助于新生肽链与带负电荷的 细胞质膜结合； • 疏水肽段：能形成α-螺旋结构，两段螺旋以反平行的 方式形成发夹结构之后，容易进入内膜的脂双层； • 邻近切割位点的氨基酸：倾向于形成β-折叠，这可能 是信号肽酶所识别的结构。 • 信号肽后面的氨基酸：也影响蛋白质的穿膜和随后的 切割。
1mL GST洗脱缓冲液 （ 50mmol/L Tris· ， Cl
pH8.0/ 5mmol/L还原型谷胱甘肽）洗脱融合蛋白。混 匀2min,500g离心10s，收集上清液。重复洗脱二三 次，经SDS-PAGE分析各分部收集的样品。洗脱的蛋 白质分成小份，加甘油10%贮存于-70℃。
(2) 药物蛋白基因的非融合表达
第三章 基因工程制药
生物信息和疾病
复制
3.5 目的基因表达
DNA
转录
病毒细菌 入
体细胞基
RNA
翻译
基因突变
多基因突
蛋白质
基因功能 ？？？
合成目的基因产物包括转录、翻译、加工 等过程，首先使目的基因编码序列在RNA聚合酶 催化下转录成mRNA，mRNA与核糖体结合，由 tRNA将氨基酸引入，按mRNA的遗传信息翻译为 多肽。通常，新生多肽需经过翻译后加工，如 糖基化、磷酸化等才能成为有功能的蛋白。
价值的信全不致病；表达
的蛋白基本能正确折叠,不形成包涵体
异源和同源蛋白在芽孢杆菌表达的实例
2.真核细胞表达体系
(1)酵母表达体系 主要优点：
①强启动子可促使外源基因达到高效表达,如明 胶表达量可高达14.8g/L;
eg.乙肝，干扰素等
②高密度培养, 可使菌丝干重达到100g/L甚至
（3）药物蛋白基因的分泌型表达
细胞外膜蛋白、周质蛋白、内膜蛋
白以带有N-端信号肽的前体形式在细胞
质中合成，随后穿膜运送到周质或定位
到内、外膜上。在穿膜的过程中，信号
肽被信号肽酶切除。
信号肽 + 外源基因