微生物直接计数法及测微技术
微生物大小的测定及显微镜直接计数法
微生物大小的测定及显微镜直接计数法微生物的大小测定与显微计数生32 程雨婧 2013012406一、实验目的1. 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。
2. 了解血细胞计数板的构造及计数原理。
3. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二、实验原理1. 显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。
镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。
用于校正目镜测微尺的长度.目镜测微尺的中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度(见图1),再以后作为测量微生物细胞的长度。
2. 球菌用直径表示大小;杆菌用宽和长来表示(μm)图一:测微尺的校正3. 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。
中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。
计数区的刻度有两种:一种是计数区(大方格)分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
计数区由400个小方格组成。
每个大方格边长为1mm，其面2积为lmm，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体3积为0.1mm。
使用血球计数板计数时，通常测定四或五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以16或25，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。
设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则: A441mL菌液中的总菌数= ×25×10×B=5×10×A?B (25个中格) 5图二:血细胞计数室构造三、实验器材1. 菌种:啤酒酵母2. 器材:普通光学显微镜、目镜测微尺镜头、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、试管、无菌水、血细胞计数板、计数器、吸管、生理盐水、移液器。
微生物显微技术及微生物计数法
微生物显微技术及微生物计数法•在实验室中常用的有:普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
通常在我们观察细菌、放线菌以及真菌等相对较大的微生物时,可以采用普通光学显微镜。
普通光学显微镜通常能将物体放1500~2000倍。
八、微生物计数法•显微直接计数法：利用血细胞计数板在显微镜下直接计数,能立即得到数值,但死活细胞都计数在内。
•平板计数法：是平板上长成菌落后再计数,反应较真实,但费时太长。
（一）微生物直接计数法•利用血细胞计数板进行直接计数。
•计数前需对样品做适当稀释,然后将经过适当稀释的菌悬液(或孢子悬液)放在血细胞计数板的计数室内,按照在显微镜下观察到的微生物数目代入计算公式运算后,即可得出单位体积微生物总数目。
•此法的优点是直观、快速。
•用于直接测数的菌悬液浓度一般不宜过低或过高(常大于106个/mL)。
活跃运动的细菌应现用甲醛杀死或适度加热以停止其运动。
•显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易分辨。
•菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。
•两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部的细菌不易看清。
•每个方格网共分九个大方格,中间的方格即为计数区。
•计数区分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格，即计数区都由400个小方格组成。
•每毫升菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数(N)×系数(Κ)×菌液稀释倍数(d)。
系数K=400×104血细胞计数板的便用(1)稀释菌液：根据待测菌悬液浓度,加无菌水适当稀释,目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4~5个酵母细胞为宜,一般稀释100倍即可。
(2)准备计数板：取清洁干燥的血细胞计数板(使用前可通过显微镜检验计数板上有无污物,若有,则需清洗后才能进行计数),在中央的计数室上加盖专用的盖玻片。
实验七微生物血球计数板直接计数法和测微技术教案
1)目镜测微尺的校正：在10×镜下，看清镜台 测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺 与镜台测微尺的刻度平行，移动载物台，使 目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某一刻度重 合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的 刻度。计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜 台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每 格长10µm，所以可得
用10×镜观察并将计数室移至视野中央。
在10×镜下计数：计数4个（或5个）中格的 平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上 16（或25）就得出计数区总菌数，最后再换 算到每mL菌液中的含菌数。
注意胞的大小
测定的工具：目镜测微尺 镜台测微尺
实验目的
1．明确显微镜计数的原理并学习使用 血球计数板进行微生物计数的方法。
2．学习并掌握用测微尺测定微生物大 小的方法，增强微生物细胞大小的感 性认识。
二、基本原理
1．血球计数板计数原理
血球计数板是一块特制的载玻片，由四条槽 构成三个平台，中间较宽的又被一短的横槽隔 成两半，每边平台上刻有一个方格网，每个方 格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数 室。每个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后， 盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以 计 数 室 的 容 积 为 0 . 1 mm3（1×10-4ml）。 计 数时通常统计5个中方格的细菌数，再换算成 1ml菌液中的细菌数。
2．测微尺的使用原理
测微尺包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台 测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片， 一般是将1mm分为100格，每格0.01mm （即10μm），用于校正目镜测微尺每格的 相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜 内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度， 分50和100两种，通过镜台测微尺校正后， 可用于测量细菌的大小。
微生物大小的测定及显微镜直接计数法
微生物大小的测定及显微镜直接计数法微生物的大小测定与显微计数生32 程雨婧 2013012406一、实验目的1. 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。
2. 了解血细胞计数板的构造及计数原理。
3. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二、实验原理1. 显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。
镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。
用于校正目镜测微尺的长度.目镜测微尺的中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度(见图1),再以后作为测量微生物细胞的长度。
2. 球菌用直径表示大小;杆菌用宽和长来表示(μm)图一:测微尺的校正3. 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。
中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。
计数区的刻度有两种:一种是计数区(大方格)分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
计数区由400个小方格组成。
每个大方格边长为1mm，其面2积为lmm，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体3积为0.1mm。
使用血球计数板计数时，通常测定四或五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以16或25，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。
设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则: A441mL菌液中的总菌数= ×25×10×B=5×10×A?B (25个中格) 5图二:血细胞计数室构造三、实验器材1. 菌种:啤酒酵母2. 器材:普通光学显微镜、目镜测微尺镜头、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、试管、无菌水、血细胞计数板、计数器、吸管、生理盐水、移液器。
测定微生物总数的方法
测定微生物总数的方法测定微生物总数是微生物学研究中的一项重要任务，它可以帮助我们了解微生物在环境中的分布和数量。
本文将介绍几种常用的测定微生物总数的方法。
一、直接计数法直接计数法是最直接、最常用的测定微生物总数的方法之一。
它通过使用显微镜观察样品中的微生物细胞数目来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、土壤样等，制备适当的稀释液。
2. 取适量的稀释液滴于玻璃片上，用显微镜观察。
3. 在显微镜下，使用目镜和物镜进行放大观察，并使用计数室或计数网格进行计数。
4. 统计不同视野中的微生物数量，并计算平均值，从而得到微生物总数。
二、培养法培养法是一种常用的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品在培养基上培养并生长，然后观察和计数生长的菌落数来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取适量的样品，如空气、食品、药品等，制备适当的稀释液。
2. 取一定量的稀释液接种于含有富营养物的培养基上。
3. 将培养基培养在适当的温度和湿度条件下，使微生物生长繁殖。
4. 观察培养基上生长的菌落，并进行计数。
5. 根据计数结果，计算微生物总数。
三、膜过滤法膜过滤法是一种常用的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品过滤到膜上，然后将膜放置在培养基上进行培养和生长，最后观察和计数生长的菌落数来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、食品样等，制备适当的稀释液。
2. 将稀释液通过膜过滤装置过滤到膜上。
3. 将膜放置在含有富营养物的培养基上进行培养和生长。
4. 观察培养基上生长的菌落，并进行计数。
5. 根据计数结果，计算微生物总数。
四、荧光显微镜法荧光显微镜法是一种高级的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品染色，并利用荧光显微镜观察和计数荧光染色的微生物细胞来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、食品样等，制备适当的稀释液。
2. 取适量的稀释液滴于载玻片上，进行定性或定量染色。
微生物质量测定技术及应用研究
微生物质量测定技术及应用研究微生物是生活中一个重要的组成部分。
在环境保护、农业生产、药品生产等领域中，微生物的数量测定是一个非常重要的前提条件。
传统的测定方法需要耗费大量时间和人力物力，并且具有较大的误差。
而微生物质量测定技术及其应用的出现，大大提高了微生物测定的效率和准确度。
一、微生物质量测定技术微生物质量测定技术主要包括直接计数、浓度测定、生长曲线测定等几种方法。
1.直接计数法直接计数法是一种常用的微生物质量测定方法。
该方法是在显微镜下进行观察，通常使用作用于细胞分子中，使其显得更明显的染料进行染色。
常见的染色方法有革兰氏染色和健太染色。
虽然直接计数法有效，但该方法需要耗费大量时间，同时需要特殊的技能和技术背景。
2.浓度测定法浓度测定法是通过分析细胞中某一对特定化合物的反应，来推算细胞数量的一种方法。
这种测量方法可以快速准确地测量细胞数量，但需要使用复杂的设备，如光度计和分光光度计。
3.生长曲线测定法生长曲线法是一个定量的技术，可以测量微生物群落的密度和生长速度，并根据这些数据推断微生物在特定环境条件下的生长速度和最大生长密度。
生长曲线法可以测量大量样本，但该技术需要消耗较多的时间和资源，且需要对基本的微生物生理学和环境生态学知识有了解。
二、微生物质量测定技术的应用1.环境监测在环境监测中，微生物质量测定技术可以快速准确地确定环境中某些特定微生物的数量，帮助确定环境质量状况。
例如，检测空气中霉菌的数量以确保室内空气质量的安全，检测污染源中各种微生物的浓度以判断污染程度。
2.食品生产在食品生产中，微生物质量测定技术可以帮助监测微生物污染，确保食品安全。
例如，监测肉类、水果和蔬菜中的微生物，以便确定污染来源和检测不合格样品。
3.药品生产在药品生产中，微生物质量测定技术可以用于检测微生物在药品生产过程中的污染情况，确保纯度和楼容。
例如检测细菌和霉菌的污染程度以确保生产过程中没有无菌裂解和其他生产活性物质的污染。
微生物大小测定和微生物的显微镜直接计数法
微生物大小测定和微生物的显微镜直接计数法一、实验目的1、了解显微测微尺的结构及掌握显微测微尺用于测量菌体大小的方法。
2、学习使用血细胞计数板计酵母菌细胞数的原理和方法。
二、实验原理（一）、显微测微尺的使用：可用于测量微生物细胞或孢子的大小，它包括镜台测微尺和目镜测微尺两部分。
镜台测微尺是一块特制的载玻片，其中央有一全长为1mm 的刻度标尺，等分成100小格，可用它校正目镜测微尺每小格的长度。
目镜测微尺是一块可放在目镜内的圆形玻片，每小格的长度随目镜、物镜放大倍数的大小而变动。
在测量之前，应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大倍数物镜下，目镜测微尺每小格所代表的实际长度，再以它作为测量微生物细胞的尺度。
标定公式为：目镜测微尺每格长度(um)=（两条重合线间镜台测微尺的格数/两条重合线间目镜测微尺的格数）*10；计算公式：微生物大小(um)=目镜测微尺格数* 目镜测微尺每格长度(um) （二）、显微镜直接计数法：其原理是将经过适当稀释的微生物细胞或孢子悬液，加至血细胞计数板的计数室中，在显微镜下逐格计数。
由于计数室的容积是固定的（0.1mm3）,故可将在显微镜下计得的菌体细胞数换算成单位体积试样中的含菌量。
此法是一种常用的微生物总菌计数法。
血细胞计数板上的计数室位于中央平台短槽两侧的2个短平台；其上各有一方格网，它被划分成9大格，中央大格为计数室。
该计数室又被划分为400个小格，其中包括25个中格，四周均有双线界限加以区分。
计数公式：1ml菌液中的总菌数 =（5个方格中的总菌数/5）× 25 ×10000 × 稀释倍数三、实验器材菌种：酵母菌仪器：显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，血细胞计数板等其它：载玻片，盖玻片，擦镜纸等四、实验步骤（一）、微生物大小测定：1、装目镜测微尺；2、放置镜台测微尺；3、目镜测微尺的格数标定：按照标定公式的要求，分别测出低倍镜和高倍镜下的目镜测微尺每格所代表的实际长度。
实验六 微生物的大小测定和显微直接计数
五、实验结果
1、微生物大小测定实验结果
（1）将目镜测微尺校正结果填入下表： ）将目镜测微尺校正结果填入下表：
接物镜 低倍镜 高倍镜 油 镜 接物镜倍数 目镜测微尺格 数 镜台测微尺格 数 目镜测微尺每格代表 的长度(μm)
接目镜的放大倍数________
（2） 酵母细胞大小的测量结果： ） 酵母细胞大小的测量结果：
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的 特制玻片制成的。 特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的 构成三个平台。中间的平台较宽， 槽，构成三个平台。中间的平台较宽， 其中间又被一短横槽隔为两半， 其中间又被一短横槽隔为两半，每半边 上面个刻有一个方格网。 上面个刻有一个方格网。 方格网上刻有9个大方格 个大方格， 方格网上刻有 个大方格，其中只有中间 的一个大方格为计数室， 的一个大方格为计数室，供微生物计数 这一大方格为边长为1mm正方形， 正方形， 用。这一大方格为边长为 正方形 深度为0.1mm，其体积为 深度为 ，其体积为0.1mm3。 。
微生物 名称 目镜测微尺每 格代表的长度 /µm 宽 目镜测微 尺格数 宽度 /µm 目镜测微 尺格数 长 长度/将结果记录于下表中， 将结果记录于下表中，A表示五个中方格中的总 菌数； 表示菌液稀释倍数。 菌数；B表示菌液稀释倍数。
各中格中菌数 1 第一室 第二室 2 3 4 5 A B 二室平 菌数/ml 均值
(1)目镜测微尺的构造 目镜测微尺是一块圆形玻 目镜测微尺的构造 其中央刻有精确的等分刻度，有等分为50小 片，其中央刻有精确的等分刻度，有等分为 小 格和100小格两种。刻度的大小是随使用的接目 小格两种。 格和 小格两种 镜和接物镜的放大倍数而改变， 镜和接物镜的放大倍数而改变，用前必须用镜台 测微尺来标定。 测微尺来标定。 (2)镜台测微尺的构造 镜台测微尺为一块特制 镜台测微尺的构造 的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度， 的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度， 将长1mm的直线等分为 小格，每小格等于 的直线等分为100小格 小格， 将长 的直线等分为 10µm。 。
微生物数量的测定方法
微生物数量的测定方法微生物数量的测定方法微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，也存在于人体内外。
了解微生物的数量对于环境监测、食品安全、医学诊断等领域具有重要意义。
本文将介绍几种常用的微生物数量测定方法。
1. 直接计数法直接计数法是最直接、最常用的微生物数量测定方法之一。
它通过显微镜观察和计数来确定微生物的数量。
首先，将待测样品制备成适当的悬浮液，然后在显微镜下观察，并使用计数器进行计数。
这种方法适用于细菌和酵母等较大的微生物。
但是，由于显微镜观察需要较高的技术水平和时间，所以无法快速测量大量样品。
2. 培养法培养法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过培养微生物并计数生长的菌落来确定数量。
首先，将待测样品制备成适当的培养基，然后在恰当的温度和湿度条件下培养一段时间。
培养基中的微生物会形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。
这种方法适用于大部分微生物，但是它需要一定的培养时间，并且某些微生物可能无法在常规培养基上生长。
3. 膜过滤法膜过滤法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过将待测样品过滤到膜上，并将膜培养在适当的培养基上来确定数量。
首先，将待测样品通过特定孔径的过滤器过滤，然后将过滤后的膜放置在培养基上培养。
培养基中的微生物会在膜上形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。
这种方法适用于水样、空气样等液态和气态样品。
4. 分子生物学方法分子生物学方法是一种新兴且快速发展的微生物数量测定方法。
它通过检测和分析微生物DNA或RNA来确定数量。
常用的分子生物学方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）等。
这些方法可以快速、准确地测定微生物的数量，并且可以检测到少量微生物。
但是，分子生物学方法需要一定的实验设备和技术，并且对样品预处理要求较高。
总结起来，微生物数量的测定方法有直接计数法、培养法、膜过滤法和分子生物学方法等。
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。
常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。
滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。
滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。
通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。
薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。
这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。
电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。
这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。
2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。
常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。
ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。
微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。
细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。
微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。
氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。
微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。
3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。
常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。
引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
(1)先将计数板盖上盖片在显微镜下，从低倍找到计数器位 置，不动。
(2)将稀释好菌悬液摇匀，用滴管吸入由盖玻片边缘滴入让 其自行渗透，使室充满（不宜过多，也不可有气泡）。
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
第8页
(3)静止3-5分钟，先在低倍镜观察，然后换成高倍 镜进行计数。样品不宜太浓或太稀，最好每小格 控制在5-10个菌体为宜，计数需要重复二次。取 平均值。先后二次误差太大，需再重复计数。
2.微生物大小测定
பைடு நூலகம்
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
第5页
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
第6页
三、器材
显微镜；血球计数板；手揿计数器；盖玻片； 目镜测微尺；镜台测微尺。
酵母菌菌悬液； 枯草杆菌和金黄色葡萄球菌染色标本。
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
第7页
四、操作步骤
在计数时，通常以五个中方格总菌数（每个中方格中数四 个小方格）即20个小方格总菌数（求平均值）。
比如：设20个小方格中总菌数为A，悬液稀释度B，那么 大格（0.1立方毫米总菌数） A/20×400×B。
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
第3页
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
第4页
测量枯草杆菌长和宽及金黄色葡萄球菌直径。
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
第12页
五、试验结果
1、P48题1 2、P92题1
微生物显微镜的直接计数法和微生物大小测定
第13页
六、思索题
1、依据你体会，用血球计数板误差主要来自 那些方面？应怎样防止误差，力争准确？
2、当接目镜不变，目镜测微尺也不变，只改 变接物镜，目镜测微尺每格所量镜台上物体 实际长度是否相同？为何？
微生物细胞大小测定及显微镜直接计数
微生物细胞大小测定及显微镜直接计数一、实验原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。
用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图示）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上，此处正好与物镜放大的中间物像重迭，用于测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺（图示）是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长10µm即0.01mm，是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和稀释平板计数法。
直接计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，则难于直接测定。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼德罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。
两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌难于区分。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载坡片上有4条槽所构成的3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图示），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，大方格用三线隔开，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，大方格之间用双线分开，而每个大方格又分成16个小方格。
实验微生物细胞的大小测量和显微计数目
四、操作步骤
2、显微直接计数
1）血球计数室的观察和清洗 取血球计数板置于载物台上→ 观察熟悉计数室的中 方格和小方格 → 取下血球计数板→用自来水冲洗计 数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净→ 置 干燥箱干燥 。
2）样品中酵母菌细胞的直接计数：
取干净血球计数板→ 在计数室上方盖上盖玻片→ 用无 菌吸管，吸取摇匀的酵母菌稀释液→ 在盖玻片边缘沾 一下，让菌液沿缝隙靠毛细管渗透作用进入计数室→ 静置5min → 低倍镜或高倍镜计算每个中方格内的细 胞数→ 完毕后清洗血细胞计数板→ 冲洗、干燥
五、实验数据及处理结果
1、大小测量
1）将目镜测微尺校正结果填入下表：
接物镜 接物镜倍数 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数
低倍镜 高倍镜 油镜
接目镜放大倍数： 2）将各菌测定结果填入下表
目镜测微尺每格代表的长度
（μm ）
微生物类型
杆菌 球菌 螺旋菌
目镜测微 尺每格代 表的长度 （μm ）
宽
长
菌体大小范
采用目镜测微尺测量经显微镜放大后的细胞物象，由于 不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微 尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此在测量前要先对目 镜测微尺进行校正。
10μm
校正公式： 目镜测微尺每格长度(μm)＝两重合线间镜台测微尺小格数×10/ 两重合线间目镜测微尺小格数
计数室
二、基本原理
1、微生物细胞大小的测量
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也 是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要 在显微镜下，借助特殊测量工具――测微尺（包括 镜台测微尺和目镜测微尺）。
测微尺原理：镜台测微尺是中央部分刻有精确等 分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长 0.01mm(即10μm)。镜台测微尺并不直接用来测量细 胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长 度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。
微生物大小的测量和直接计数
微生物大小的测量和直接计数一、实验目的1、学习显微镜下测量微生物的大小的基本方法2、学习血球计数板计数法使用的原理与方法，并学习区别死活酵母的方法。
二、实验原理用于测量微生物细胞的大小的工具有接目测微尺和接物测微尺。
接目测微尺不是直接测量菌体，而是测量经显微镜放大后的细胞物像。
接目测微尺仅与目镜的放大倍数有关，接目测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例相同，只是代表相对长度，所以使用前必须用置于镜台上的接物测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的每格所代表的精确长度，然后用接目测微尺直接测被测对象的大小。
测定微生物数量的方法有很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法、细胞和原生质体总量计测法等。
血球计数板其计数室的每个大方格均由400个小方格组成。
每个大方格体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3.使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每ml菌液（或每g样品）中微生物细胞的数量。
三、实验步骤1、接目测微尺的标定把接物测微尺置于载物台上，使刻度朝上，先用低倍镜观察，调焦，使接目测微尺与接物测微尺刻度平行，再使其重叠，两尺的“0”刻度完全重合，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间接目测微尺的格数和接物测微尺的格数。
接物测微尺刻度每格长10mm，计算接目测微尺每格所代表的长度：接目测微尺每格长度= 接物测微尺两个重合格之间的格数10 / 接目测微尺两重合格之间的格数2、微生物细胞大小的测定换上菌体标本片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜、油镜下转动接目测微尺，测出菌体的长、宽各占几格（不足一格的部分估读一位小数），测出的格数乘以接目测微尺每格的长度，即等于该菌的大小，一般测量菌的大小要在同一涂片上测定至少5个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。
3、微生物的直接计数将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的边缘滴入一滴（不宜过多），使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去多余菌液，避免盖玻片上浮。
微生物直接计数和大小测定
微生物直接计数和大小测定
第5页
2、显微镜测微技术：
微生物大小通常见测微计来测量，测微计分别有接 目镜测微尺和镜台测微尺两个别。
• 接目镜测微尺是一块圆形玻片，在中央有一带刻 度尺，等份成50或100小格，每一格大小是相正确， 在同一接目镜下，随不一样放大率物镜而改变其大 小。
微生物直接计数和大小测定
第7页
四、方法及步骤
1、血球计数： ⑴灭活：取菌悬液一管（10ml）摇匀，加入1%甲醛， 将酵母菌灭活，充分振荡，使菌体分散成单体。 ⑵稀释：将菌液适当稀释（菌液如不浓可无须稀 释），要求每小格内约3—5个菌体为宜。 ⑶染色：加0.1%吕氏美蓝酒精溶液0.5ml，摇匀， 使菌体着色。 ⑷取清洁干燥血球计数器，在计数室上加盖盖玻片。
微生物直接计数和大小测定
第10页
微生物直接计数和大小测定
目尺刻线(27格) 台尺刻线(4格) 第11页
按照以下公式即可求出在低倍镜下目镜测微尺每格长 度：
目镜测微尺每格长度（微米）=两条两重条合重线合间线间镜目台镜测测微微尺尺格格数数×10
如：目测为30小格等于台测为20小格，已知台测每格
为10微米，那么对应在目镜测微尺上每格长度为（20×10
B
二室 菌数/ml
平均值
⑺计数完成后，将计数器在水龙头下冲洗（勿用硬物洗刷， 如试管刷），洗完后晾干，镜检确认无残留菌体和其它沉积 物，若不洁净则必须重复洗涤至洁净为止。
微生物直接计数和大小测定
第9页
2、测微技术：
⑴接目镜测微尺校正： 接目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央刻有 “十字”刻线。 镜台测微尺每小格为10μm。 接目镜测微尺装入接目镜内隔板（光栏）上，刻 度向下，并把镜台测微尺置于载物台上。 先用低倍镜校对，调整至能清楚地看到镜台测微 尺为止。移动镜台测微尺和旋转目镜测微尺，使二者 刻度平行，并使目镜测微尺“0”与镜台测微尺一条线 重合，然后找出两个尺刻线再次重合时分别格数
实验1微生物细胞大小测定及显微镜直接计数法
• 定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的 刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的 格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微 尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可 以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
• 例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小 格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则 目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝ 10μm。 • 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测 微尺每小格所代表的长度。
• 计数区由400个小方格组成。
• 每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻 片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计 数区的体积为0.1mm3。
• 使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的 微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得 到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌 液中微生物的数量。 • 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个中方格中 细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数 （d）
• 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上 有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一 短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数 区。 • 计数区的刻度有两种： • 一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每 个中方格又分成25个小方格； • 另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中 方格又分成16个小方格。
• 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片， 一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即 0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时， 将镜台测微尺放在载物台上。 • 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要 经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台 测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此 从镜台测微尺葡 萄球菌
大肠杆菌
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
微生物直接计数法及测微技术
实验类型：基础
学时：4(参考)
内容：
一、实验目的
1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。
2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。
二、实验原理
显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
因为计数板是一块特别的载玻片。
其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2—3—44)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。
每一个大方格边长为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。
计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。
然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。
若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为：
lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N·M(个)
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。
微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0．01mm(即10pm)。
镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
三、试剂与器材
1.材料酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。
2.实验器材细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。
四、实验内容
1.微生物直接计数法
菌悬液制备→镜检计数室→加样品→显微镜计数→清洗血细胞计数板
2.微生物测微技术
装目镜测微尺→校正→菌体大小测定
五、关键步骤及注意事项
1.防止加样空气泡产生。
2.调节显微镜光线的强弱适当。
六、思考题
1.根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差、力求准确?
2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。
3.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?
提示：本文微生物直接计数法及测微技术属于实验设计文章，主要介绍微生物直方面的知识，内容仅供学习交流与参考，不代表中生网的观点。
原文地址:/biotech/exp/ExpDesign/2007/8673.html。