分析化学(仪器分析)第五章 分子发光分析法PPT课件
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《化学发光分析》课件
《化学发光分析》PPT课 件
本课程将介绍化学发光分析的工作原理、分类、常用试剂和仪器、典型实验 操作步骤以及优点和应用。让我们一起探索这一极具活力和创新性的化学分 析技术。
化学发光分析概述
什么是化学发光分析？
化学发光分析是指利用发光剂 （luminophore）与感光器 （photodetector）在光激发条件下 发生发光反应进行分析的技术。
发光机制和原理
发光反应主要包括螯合发光、化学 发光、电化学发光和生物发光，其 基本原理为激发能量从分析物传递 到发光剂。
化学发光分析的分类
化学发光分析主要分为储能法、电 化学发光法、免疫分析法、分子印 迹技术法和气相化学发光分析 （GPCA）等。
优点和应用
快速、敏感、高效
化学发光法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短和快速分析等优势，被广泛应用于临床、 食品、环境、药学、安全等领域。
数据统计和分析
4
利用计算机等工具进行数据的整理、计算与 分析，得出结果，并进行结果的验证和确认。
取样
用适当的方法取得样品，并得到有效的样品。
发光检测
激发分析样品使其产生发光，并利用仪器对 其进行检测。
案例分析和总结
CRO公司使用化学发光分析技术加 快药代动力学评估
合同研究组织（CRO）将计划100名志愿者的药代动力 学模拟研究里程碑提前了八个月，其采用了高通量类 似物筛选、高通量药代动力学测定和新一代大规模并 行化药代动力学建模等技术。这些技术包括，化学发 光法作为测定细胞器的特异性标记的方法。
电化学发光分析
电化学发光分析仪（ECL）是用于 电化学发光分析的专用设备，适用 于光谱分析和光度测定等分பைடு நூலகம்。
酶标仪
酶标仪是一种测量酶反应的光度仪 器，通常用于免疫学、生化学等领 域的分析。
本课程将介绍化学发光分析的工作原理、分类、常用试剂和仪器、典型实验 操作步骤以及优点和应用。让我们一起探索这一极具活力和创新性的化学分 析技术。
化学发光分析概述
什么是化学发光分析？
化学发光分析是指利用发光剂 （luminophore）与感光器 （photodetector）在光激发条件下 发生发光反应进行分析的技术。
发光机制和原理
发光反应主要包括螯合发光、化学 发光、电化学发光和生物发光，其 基本原理为激发能量从分析物传递 到发光剂。
化学发光分析的分类
化学发光分析主要分为储能法、电 化学发光法、免疫分析法、分子印 迹技术法和气相化学发光分析 （GPCA）等。
优点和应用
快速、敏感、高效
化学发光法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短和快速分析等优势，被广泛应用于临床、 食品、环境、药学、安全等领域。
数据统计和分析
4
利用计算机等工具进行数据的整理、计算与 分析，得出结果，并进行结果的验证和确认。
取样
用适当的方法取得样品，并得到有效的样品。
发光检测
激发分析样品使其产生发光，并利用仪器对 其进行检测。
案例分析和总结
CRO公司使用化学发光分析技术加 快药代动力学评估
合同研究组织（CRO）将计划100名志愿者的药代动力 学模拟研究里程碑提前了八个月，其采用了高通量类 似物筛选、高通量药代动力学测定和新一代大规模并 行化药代动力学建模等技术。这些技术包括，化学发 光法作为测定细胞器的特异性标记的方法。
电化学发光分析
电化学发光分析仪（ECL）是用于 电化学发光分析的专用设备，适用 于光谱分析和光度测定等分பைடு நூலகம்。
酶标仪
酶标仪是一种测量酶反应的光度仪 器，通常用于免疫学、生化学等领 域的分析。
第5章分子发光分析法PPT课件
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。
内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第
一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
样）成镜像对称关系。
22.11.2020
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
22.11.2020
三、荧光的产生与分子结构的关系
（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。
系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通
过自旋—轨道耦合等作用完成系间跨越。
22.11.2020
（2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第
一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
样）成镜像对称关系。
22.11.2020
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
22.11.2020
三、荧光的产生与分子结构的关系
（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。
系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通
过自旋—轨道耦合等作用完成系间跨越。
22.11.2020
（2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
第五章 分子发光分析法PPT课件
菏泽学院化学与化工系
9
(二) 荧光效率及其影响因素 1. 荧光效率 发射荧光的分子数目与激发态分子总数的比值。
荧光效率（f）=
发荧光的分子数 激发态分子总数
也可以各种跃迁的速率常数表示
f
Kf K f Ki
式中：Kf为荧光发射过程的速率常数，∑Ki为非辐射跃迁的 速率常数之和。一般来说，Kf决定于物质的化学结构；∑Ki 主要决定于化学环境，同时也与化学结构相关，有分析应用
长；
‘ 2
>
2
>
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2020/10/31
的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”
。
系间跨越(intersystem conversion)：不同多重态,有重叠的转动
能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋
—轨道耦合进行。
2020/10/31
❖ 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种 现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是 由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
2020/10/31
分子发光分析ppt课件
仪器分析
光谱分析
原子光谱
原子吸收 原子发射 原子荧光
分子吸收 分子光谱
分子发光
紫外-可见光谱 红外光谱
2
第八章 分子发光分析法
分子 吸收能量 激发为激发态 释放出能量 基态
电能 化学能 光能
分子发光
光致发光 化学发光
辐射跃迁 非辐射跃迁
光的形式释放 以热的形式释放
称为“发光”
荧光 磷光
3
分子荧光/磷光分析法 一、基本原理
式中为荧光量子效率，又根据Beer定律
A=-lg I/ I0 I= I0 .10- A Ia = I0 - I = I0(1- 10 -A)
I0和I分别是入射光强度和透射光强度。代入 上式得
If = I0(1- 10 -kb c)
28
整理得：
If =2.3 I0 kbc 当入射光强度I0 和b一定时，上式为：
特殊化学作用如氢键的生成
同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同
因素
温度
内部能量转化作用增大 碰撞频率增加，使外转换的几率增加
温度上升使荧光强度下降
化合物所处状态不同
酸度 电子构型上有所不同
荧光强度和荧光光谱不同
30
31
3、荧光猝灭
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子
的相互作用引起荧光强度降低的现象
增加试样的刚性:
低温冷冻
固体磷光法：
吸附于固相载体（滤纸）
分子缔合物的形成：
加入表面活性剂等
重原子效应：
加入含重原子的物质，如银盐等
敏化磷光：
通过能量转移产生磷光
42
磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。 在有荧光发射的同时测量磷光
光谱分析
原子光谱
原子吸收 原子发射 原子荧光
分子吸收 分子光谱
分子发光
紫外-可见光谱 红外光谱
2
第八章 分子发光分析法
分子 吸收能量 激发为激发态 释放出能量 基态
电能 化学能 光能
分子发光
光致发光 化学发光
辐射跃迁 非辐射跃迁
光的形式释放 以热的形式释放
称为“发光”
荧光 磷光
3
分子荧光/磷光分析法 一、基本原理
式中为荧光量子效率，又根据Beer定律
A=-lg I/ I0 I= I0 .10- A Ia = I0 - I = I0(1- 10 -A)
I0和I分别是入射光强度和透射光强度。代入 上式得
If = I0(1- 10 -kb c)
28
整理得：
If =2.3 I0 kbc 当入射光强度I0 和b一定时，上式为：
特殊化学作用如氢键的生成
同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同
因素
温度
内部能量转化作用增大 碰撞频率增加，使外转换的几率增加
温度上升使荧光强度下降
化合物所处状态不同
酸度 电子构型上有所不同
荧光强度和荧光光谱不同
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31
3、荧光猝灭
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子
的相互作用引起荧光强度降低的现象
增加试样的刚性:
低温冷冻
固体磷光法：
吸附于固相载体（滤纸）
分子缔合物的形成：
加入表面活性剂等
重原子效应：
加入含重原子的物质，如银盐等
敏化磷光：
通过能量转移产生磷光
42
磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。 在有荧光发射的同时测量磷光
《分子发光》课件
详细描述
荧光光谱法利用某些物质吸收光后， 能以荧光的形式重新发射出特定波长 的光，通过测量荧光光谱，可以分析 物质的组成和结构。
磷光光谱法
总结词
一种测量物质在激发态的磷光发射光谱的方法。
详细描述
磷光光谱法利用物质吸收光后，处于激发态的分子以磷光的形式缓慢地释放出 特定波长的光，通过测量磷光光谱，可以分析物质的组成和结构。
详细介绍了分子发光的原理、发光机制以及在各个领域的 应用，是学习分子发光的基础教材。
《荧光染料与荧光分析法》
系统介绍了荧光染料的基本性质、合成方法以及荧光分析 法的应用，对于深入了解荧光染料在分子发光领域的作用 很有帮助。
"分子发光机制研究进展"
综述了近年来分子发光机制的研究成果，包括新的发光材 料、发光过程的理论模型等。
激发态的稳定性
激发态是相对不稳定的， 分子会通过各种方式释放 能量并回到基态。
分子发光的辐射过程
辐射跃迁
激发态的分子通过释放光子的形式回到基态，这 个过程称为辐射跃迁。
光子的产生
当分子从激发态回到基态时，会释放出能量并以 光子的形式辐射出去。
光子性质
光子具有特定的波长（或频率），与其所属的分 子和激发态有关。
THANKS
感谢观看
《分子发光》PPT课件
contents
目录
• 分子发光的概述 • 分子发光的原理 • 分子发光的技术与方法 • 分子发光在科学研究中的应用 • 分子发光的发展趋势与展望 • 参考文献
01
分子发光的概述
分子发光的基本概念
分子发光是指分子在吸收能量 后以光子的形式释放能量的过 程。
分子发光现象广泛存在于自然 界和人类生产生活中，如萤火 虫、发光菌、荧光棒等。
荧光光谱法利用某些物质吸收光后， 能以荧光的形式重新发射出特定波长 的光，通过测量荧光光谱，可以分析 物质的组成和结构。
磷光光谱法
总结词
一种测量物质在激发态的磷光发射光谱的方法。
详细描述
磷光光谱法利用物质吸收光后，处于激发态的分子以磷光的形式缓慢地释放出 特定波长的光，通过测量磷光光谱，可以分析物质的组成和结构。
详细介绍了分子发光的原理、发光机制以及在各个领域的 应用，是学习分子发光的基础教材。
《荧光染料与荧光分析法》
系统介绍了荧光染料的基本性质、合成方法以及荧光分析 法的应用，对于深入了解荧光染料在分子发光领域的作用 很有帮助。
"分子发光机制研究进展"
综述了近年来分子发光机制的研究成果，包括新的发光材 料、发光过程的理论模型等。
激发态的稳定性
激发态是相对不稳定的， 分子会通过各种方式释放 能量并回到基态。
分子发光的辐射过程
辐射跃迁
激发态的分子通过释放光子的形式回到基态，这 个过程称为辐射跃迁。
光子的产生
当分子从激发态回到基态时，会释放出能量并以 光子的形式辐射出去。
光子性质
光子具有特定的波长（或频率），与其所属的分 子和激发态有关。
THANKS
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目录
• 分子发光的概述 • 分子发光的原理 • 分子发光的技术与方法 • 分子发光在科学研究中的应用 • 分子发光的发展趋势与展望 • 参考文献
01
分子发光的概述
分子发光的基本概念
分子发光是指分子在吸收能量 后以光子的形式释放能量的过 程。
分子发光现象广泛存在于自然 界和人类生产生活中，如萤火 虫、发光菌、荧光棒等。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
第五章 分子发光分析法
s
体系间窜跃（ 不同多重态, 体系间窜跃（ isc ）：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐 射跃迁（ S1→T1跃迁 跃迁） 磷光发射：电子由第一激发三重态 射跃迁（ S1→T1跃迁） 。磷光发射：电子由第一激发三重态 的最低振动能级( =0)跃迁至基态各振动能级 跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁 跃迁）。 的最低振动能级(v=0)跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁）。 S2 Intersystem Crossing 系间窜跃 S1 磷光发射 Phosphorescence T1
第五章 分子发光分析法
基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态， 基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光 分子发光（ 便产生分子发光（Molecular Luminescence）。 ）。 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、 荧光和磷光两种）、热致发 （按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、热致发 场致发光和化学发光等 光、场致发光和化学发光等。 本 分子荧光（Molecular Fluorescence）、 分子荧光（ ）、 章 分子磷光（ 分子磷光（Molecular Phosphorescence） ） 化学发光（ 化学发光（Chemiluminescence） ）
S0 λ2 λ1
内转移（ ） 相同多重态的两个电子能级之间 之间（ 内转移（ic） ：相同多重态的两个电子能级之间（如S2 S1,S1 S0）的非辐射跃迁 。 ）
S2 T1 S1
S0 λ2 λ1
分子发光分析法概况课件
分子发光分析法的优缺点
优点
高灵敏度
分子发光分析法通常具 有很高的灵敏度，能够 检测出低浓度的目标物
。
选择性
某些发光分子可以与目 标物发生特异性反应， 从而提高分析的选择性
。
操作简便
分子发光分析法通常操 作简单，所需仪器设备 相对简单，便于现场快
速检测。
缺点
背景干扰
发光分析法容易受到环 境背景光的影响，如日 光、荧光等，导致检测
01
02
研发能够延长发光分子寿命 的技术，以减少检测过程中
的误差和不确定性。
03
04
克服背景干扰
研究和发展能够有效排除背 景光干扰的技术和方法，以 提高检测的稳定性和准确性
。
拓展应用领域
进一步探索发光分析法在环 境监测、生物医药、食品安 全等领域的应用，以满足更
广泛的需求。
06 结论
总结分子发光分析法的概况与重要性
结果不稳定。
发光衰减
某些发光分子的发光强 度会随时间衰减，影响 检测的准确性和稳定性
。
成本较高
某些高灵敏度的发光分 子和仪器设备成本较高 ，限制了其在某些领域
的应用。
未来发展方向与挑战
提高灵敏度和选择性
延长发光寿命
进一步研发具有更高灵敏度 和选择性的发光分子，以满 足更低检测限和更高准确性
的需求。
新型的分子发光分析方法和技术不断 涌现，如荧光免疫分析、荧光偏振免 疫分析、时间分辨荧光免疫分析等。
02
分子发光分析法的基本原理
分子发光的过程与机制
01
分子发光是指分子吸收能量后，由基态跃迁至激发态，再由激 发态回到基态时释放光子的过程。
02
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光致发光（荧光，磷光） 热致发光 场致发光 化学发光
3
§5.1 荧光分析法
一、概述 根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行 定量 16世纪，人们已经观察到了荧光现象 1852年，Stokes考察了奎宁和叶绿素的荧光，对荧 光现象给出了解释 1864年，Stokes提出将荧光作为一种分析方法 1867年，Goppelsroder应用铝－桑色素络合物的荧 光测定了铝 1924年，Wawwilous进行了荧光量子产率的测定 1926年，Gavila对荧光寿命进行了测定
4
荧光分析法的特点
1. 灵敏度高 检出限通常比分光光度法低2-4个数量级
2. 选择性好 包括激发和发射两个过程，通过前后两次 波长的选择，可得到更高的选择性
3. 方法简便快速，试样用量少 4. 对环境因素比较敏感，能产生强荧光的化
合物相对较少，使其应用受到一定限制
5
二、基本原理
一、荧光与磷光的产生过程
辐射跃迁，例如S1→T1就
S2
是一种系间跨越。通常，
发生系间跨越时，分子由
S1的较低振动能级转移至
T1的较高振动能级处。有
时，通过热激发，有可能 S0
发生T1→S1，然后由S1发
吸光l1
生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间跨越
S1 T1
吸光l2 荧光l3
15
2、荧光效率及其影响因素
（1）荧光效率 荧光效率用来描述激发态分子发生辐射跃
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、 激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
迁返回基态的概率的大小，定义为发荧光的 分子数目与激发态分子总数的比值。
荧光效率(φf)＝发荧光的分子数／激发态分子总数 Φf越高，辐射跃迁的概率越大，发射的荧光越强 具有分析应用价值的荧光化合物， φf应在0.1-1之间
16
（2）荧光与分子结构的关系 a.物质必须能够吸收紫外-可见光，即分子 中必须含有共轭双键这样的强吸收基团， 共轭体系越大，π电子的离域性越强，越 易被激发而产生荧光。 b. 共轭芳环增大，荧光效率提高，荧 光峰向长波方向移动。 萘 φf＝0.29, λem=310nm
6
2.电子激发态的多重性
电子激发态的多重性：2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应
单重态能级低；
大多数分子含有偶数电子（即，S=0），因此，其基态处
于单重态；
S0
S1
T1
S0→T1 禁阻跃迁；
通过其他途径进入
(见能级图)；进入的
几率小；但并非绝对
第五章 分子发光分析法 （Molecular Luminescence Analysis）
1
整体概况
概况一
点击此处输入 相关文本内容
01
概况二
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02
概况三
点击此处输入 相关文本内容
03
分子发光（Molecular Luminescence） 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发 态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量 释放返回基态时，便产生分子发光。 激发模式：
8
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量 发
吸 收
射 荧 光
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
9
辐射能量传递过程
S2
S1
T1
S0 吸光l1
荧光发射
吸光l2
荧光
荧光l3
处于第一激发单重态中的分子跃回至基态各振动能级时，将得 到最大波长为λ3的荧光。λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且 不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3为的 荧光。荧光的产生在10-6-10-9s内完成。
10
磷光发射
分子由基态单重态激发至 第一激发三重态的几率很 小，因为这是禁阻跃迁。 但是，由第一激发单重态 的最低振动能级，有可能 以系间窜跃方式转至第一 激发三重态，再经过振动 驰豫，转至其最低振动能 级，由此激发态跃回至基 态时，便发射磷光，这个 S0 跃迁过程（T1→S0）也是 自旋禁阻的，其发光速率 较慢，约为10-3-10s。因此， 这种跃迁所发射的光，在 光照停止后，仍可持续一 段时间。
给电子基团(-OH, -NH2, -NR2, -OR)使共轭体系增 大，导致荧光增强。反之， 吸电子基团(-COOH, NO, -NO2)使荧光减弱。
13
内转化
Internal conversion
S2
S1
T1
S0
吸光l1
吸光l2
当两个相同多重态的电子能级非常靠近以至其振动能级有重 叠时，常发生分子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。
处于高激发单重态的分子，通过内转移及振动弛豫，均跃回 到第一激发单重态的最低振动能级。
14
系间跨越
指不同多重态间的无
不发生。
7
3.激发态→基态的能量传递途径
分子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移
振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
蒽 φf＝0.46, λem=400nm
17
b. 分子的刚性平面结构有利于荧光的产生
O-
O
O
O-
O
COO -
C COO -
荧光素， φf接近1
酚酞，没有荧光
刚性平面结构可以减少分子振动和碰撞去
活的可能性。
有机配位剂与金属离子形成螯合物后荧光强 度增大，也是由于形成了共平面的配合物的原 因。
18
c. 取代基的影响
S2 吸光l1
S1 T1
吸光l2 荧光l3
磷光
磷光
11
非辐射能量传递过程
振动弛豫 内转换 外转换 系间跨越
12
S2
S1
振动弛豫
T1
Vibrational
relaxation
S0 吸光l1
吸光l2
在同一电子能级中，分子由高振动能级转至低 振动能级，而将多余的能量以热 的形式发出。 发生振动弛豫的时间为10-14-10-12s数量级。
3
§5.1 荧光分析法
一、概述 根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行 定量 16世纪，人们已经观察到了荧光现象 1852年，Stokes考察了奎宁和叶绿素的荧光，对荧 光现象给出了解释 1864年，Stokes提出将荧光作为一种分析方法 1867年，Goppelsroder应用铝－桑色素络合物的荧 光测定了铝 1924年，Wawwilous进行了荧光量子产率的测定 1926年，Gavila对荧光寿命进行了测定
4
荧光分析法的特点
1. 灵敏度高 检出限通常比分光光度法低2-4个数量级
2. 选择性好 包括激发和发射两个过程，通过前后两次 波长的选择，可得到更高的选择性
3. 方法简便快速，试样用量少 4. 对环境因素比较敏感，能产生强荧光的化
合物相对较少，使其应用受到一定限制
5
二、基本原理
一、荧光与磷光的产生过程
辐射跃迁，例如S1→T1就
S2
是一种系间跨越。通常，
发生系间跨越时，分子由
S1的较低振动能级转移至
T1的较高振动能级处。有
时，通过热激发，有可能 S0
发生T1→S1，然后由S1发
吸光l1
生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间跨越
S1 T1
吸光l2 荧光l3
15
2、荧光效率及其影响因素
（1）荧光效率 荧光效率用来描述激发态分子发生辐射跃
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、 激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
迁返回基态的概率的大小，定义为发荧光的 分子数目与激发态分子总数的比值。
荧光效率(φf)＝发荧光的分子数／激发态分子总数 Φf越高，辐射跃迁的概率越大，发射的荧光越强 具有分析应用价值的荧光化合物， φf应在0.1-1之间
16
（2）荧光与分子结构的关系 a.物质必须能够吸收紫外-可见光，即分子 中必须含有共轭双键这样的强吸收基团， 共轭体系越大，π电子的离域性越强，越 易被激发而产生荧光。 b. 共轭芳环增大，荧光效率提高，荧 光峰向长波方向移动。 萘 φf＝0.29, λem=310nm
6
2.电子激发态的多重性
电子激发态的多重性：2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应
单重态能级低；
大多数分子含有偶数电子（即，S=0），因此，其基态处
于单重态；
S0
S1
T1
S0→T1 禁阻跃迁；
通过其他途径进入
(见能级图)；进入的
几率小；但并非绝对
第五章 分子发光分析法 （Molecular Luminescence Analysis）
1
整体概况
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概况二
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03
分子发光（Molecular Luminescence） 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发 态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量 释放返回基态时，便产生分子发光。 激发模式：
8
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量 发
吸 收
射 荧 光
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
9
辐射能量传递过程
S2
S1
T1
S0 吸光l1
荧光发射
吸光l2
荧光
荧光l3
处于第一激发单重态中的分子跃回至基态各振动能级时，将得 到最大波长为λ3的荧光。λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且 不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3为的 荧光。荧光的产生在10-6-10-9s内完成。
10
磷光发射
分子由基态单重态激发至 第一激发三重态的几率很 小，因为这是禁阻跃迁。 但是，由第一激发单重态 的最低振动能级，有可能 以系间窜跃方式转至第一 激发三重态，再经过振动 驰豫，转至其最低振动能 级，由此激发态跃回至基 态时，便发射磷光，这个 S0 跃迁过程（T1→S0）也是 自旋禁阻的，其发光速率 较慢，约为10-3-10s。因此， 这种跃迁所发射的光，在 光照停止后，仍可持续一 段时间。
给电子基团(-OH, -NH2, -NR2, -OR)使共轭体系增 大，导致荧光增强。反之， 吸电子基团(-COOH, NO, -NO2)使荧光减弱。
13
内转化
Internal conversion
S2
S1
T1
S0
吸光l1
吸光l2
当两个相同多重态的电子能级非常靠近以至其振动能级有重 叠时，常发生分子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。
处于高激发单重态的分子，通过内转移及振动弛豫，均跃回 到第一激发单重态的最低振动能级。
14
系间跨越
指不同多重态间的无
不发生。
7
3.激发态→基态的能量传递途径
分子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移
振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
蒽 φf＝0.46, λem=400nm
17
b. 分子的刚性平面结构有利于荧光的产生
O-
O
O
O-
O
COO -
C COO -
荧光素， φf接近1
酚酞，没有荧光
刚性平面结构可以减少分子振动和碰撞去
活的可能性。
有机配位剂与金属离子形成螯合物后荧光强 度增大，也是由于形成了共平面的配合物的原 因。
18
c. 取代基的影响
S2 吸光l1
S1 T1
吸光l2 荧光l3
磷光
磷光
11
非辐射能量传递过程
振动弛豫 内转换 外转换 系间跨越
12
S2
S1
振动弛豫
T1
Vibrational
relaxation
S0 吸光l1
吸光l2
在同一电子能级中，分子由高振动能级转至低 振动能级，而将多余的能量以热 的形式发出。 发生振动弛豫的时间为10-14-10-12s数量级。