感受态细胞和质粒DNA的转化(C)

大肠杆菌(Escherichia coli)
大肠杆菌(Escherichia coli)大约含 3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。 革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度 37℃，PH7.0～7.6 (一般7.4)，保存加 甘油，培养皿密封。 大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期 (生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、 稳定期(饱和期)，约1×109 ~2×108/mL和衰老期。
最好，而X1776株，OD550=0.2~0.3最好。
质粒的DNA比较小，有助于其转于宿主细胞中的效 率。转化效率与质粒大小成反比。而质粒大于15kb时，
转化率成为限制因素。同时质粒大，复制的拷贝数低。
（4）质粒的三种构型
① 超螺旋闭合环状DNA，cccDNA。
② 开环DNA，至少一股DNA上有缺口，一处或多
⑧ 取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或250mL LB则全 部铺板。
⑨ 取100~200uL，臵于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻
璃棒涂匀；静臵5~10分钟。
⑩ 倒臵37℃培养12~18小时(一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增， 提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。 并设下列对照： A．不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。 B．用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。 DNA超螺旋转化最好
菌 LB中过液培养，加入等体积 2×冰冻培养基。液氮速 冻后臵-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。
菌株保存液的配制
琼脂穿刺培养基
琼脂（Difco） 细菌胰蛋白胨 （Difco） 6g 10g
2×冰冻培养基
K2HPO4 N++-柠檬酸 12.6g 0.19g
பைடு நூலகம்
NaCl HCl ddH2O
8g 20mg 至1L
（2） 转化步骤
① 感受态细胞新鲜配制的或从-80℃冻存取出后臵于冰水中融化。
② 取出分装到Eppendorf管中，每管100~200uL。 ③ 加入需转化的DNA溶液25ul充分混匀(1~5ug/mLDNA)。
④ 冰水中放臵30分钟。
⑤ 37℃或42℃水浴2分钟。(热休克) ⑥ 冰浴2min。
⑦ 每管再加入1mL LB培养基，37℃振荡培养1小时。
MgSO4＞H2O (NH4)2SO4 KH2PO4 甘油 dH2O
0.18g 1.8g 3.6g 88g 至1L
高压灭菌
Phagemid -20℃ Enzyme -20℃ Buffers -20℃ Primer -4℃ Thiodeyivatives -20℃ Ribonucleotides -20℃ Helper phage -4℃ 臵于—20℃或—80℃，并一个月检查一次
感受态细胞(Compenent cells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化 到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。 (主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)
① 取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70℃保存，37℃过夜 (一般16小时)。 ② 取一个菌落接种于3~5mlLB培养管中，37℃振 培养，过夜(8~16 小时)。 ③ 取出1mL过液菌加入新鲜配制的LB培养液50mL中(2%接种量)。 37℃振荡培养，2~4小时。测定光密度值(约5×107个细胞/mL)， OD550达0.3~0.5。 注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值 间关系不同。 HB101，OD600=0.5（约×107个细胞/mL） X1776，OD600=0.2（约×107个细胞/mL）
处使DNA鲜旋。 ③ 线状DNA 琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的DNA分 开，Agrose电泳中 cccDNA位置最前。
二、阅读微生物的基因型符号
在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表 现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映 的是可观察到的特性。 1．由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在 描述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不 必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给 出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和 metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突变了的，其他基因组仍然 正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因 (如trp) 时，可以用 trp+，或者只是简单地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到 它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就用△表示，如△lon表示 lon基因的缺失突变。
试举一例来说明上述概念：
JM83，F-，ara，△(lac-proAB)，rpsL，Ф80d，lacZ △M15是这 样一个品系：不带F因子，ara基因座突变(因此不能代谢阿拉伯糖)，
lac操纵子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖体的S12亚基突变(因此有
链霉素抗生)，β-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中 有α-互补作用。如果将克隆的pUC质粒的重组DNA转化入这个细菌， 就可以通过蓝/白菌斑来筛选出转化子)。 野生的大肠杆菌具有大约4700kbp的DNA分子，上面有约2800个基 因。当这些基因中有突然变异发生时，基因产物随之变化，并且有可 能给大肠杆菌带来可以观察到的变化。这种能够观察到的特征叫做大 肠杆菌的表现型(Phenotype)，而把基因的构成叫做大肠杆菌的基因型 (Genotype)。
DNA环状 次之
DNA线状 有干扰作用 1ug pBR322DNA转化入HB101可得：5×106/2×107转化子。 DNA分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过10kb，最高 限为15kb。一般1ug DNA可得5×107~1×108个转化菌。
（3）注意事项
① 宿主菌取出时应注意菌株名及编号。 ② 检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。 ③ 整个操作过程应保持无菌状态。 ④ LB培养液中不能有抗生素。 ⑤ 不同受体菌，培养要求不同。如 K802株，OD550=0.5
DNA分子。保持感受态的时间约1~2天，一般出现在生长 对数期的后期。
5 . DNA转化感受态细胞
（1）抗性琼脂板中抗生素的配制
抗生素
抽滤除菌并均臵 -20℃保存。 Mg++是四环素拮抗物， 需加MgCl2时改加NaCl(6g/L) 四环素光敏感应避光保存 抗生素不耐热，在加入到琼脂 板中时，应等琼脂冷至 48~50℃时再加入抗生素
2. 菌株的保存
大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株
在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同 条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株 比大肠杆菌X1776株保存期长。 所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再
做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生
长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。
具体保存方法：
① LB琼脂平板划线，37℃，倒臵平板培养(16-24hr)，形成
单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔 绝空气)，倒臵放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。
E. coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中， 4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。 ② 穿刺琼脂(stab agar)，室温，避光可保存数年。 ③ 冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入1050%甘油培养基中，分装，臵-20～ -70℃。可经过30次冻融， 细菌仍然存活。
两种假设：
① CaCl2处理4℃，0.1M低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞
壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁， 俗称“打孔”，使DNA分子能够进入细胞内。
② CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的
酶位点，使DNA分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受
态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来
通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发
生变异，表现型发生变化时才被表示。但是需要特别的表示时，则在 野生的基因型上加“+”，在变异的基因型上加“-”以示区别。表示方
法是用基因产物或其作用的名称的三个斜体字素表示(如 DNA Aednine
methylase-dam)。如果不同的基因变导致相同的作用结果，则加上一个 大写字母(如Recombination- recA、recB、recC)。
感受态细胞和质粒DNA的转化
重组 DNA分子导入受体细胞
导入大肠杆菌: 氯化钙转化法 electroporation 电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法
重组DNA导入哺乳动物细胞:
DNA- 磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导法、 原生质体融合法
酵母菌转化法:
完整细胞转化法 原生质体转化法 电击法
肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆
菌缺乏天然的转化机理。1970年M. Mandela 和A. Higa提 出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌，
能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞
称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转 化频率。目前对这种机制尚不清楚。
3．校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系 虽然不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作sup+，表现 型则应该写为Sup-。可是，带有sup基因的突变型品系的基因型必需写 为sup-或者sup，它的表现型是Sup+。也就是说，字面上的概念与实际 上的情况正好倒了一个个儿。因此，在阅读它时要特别小心，以免搞 错。此外，在谈到特殊的校正基因时，它的表现型常用数字来表示， 如Sul；但是，它的基因型却用字母来表示supD。鉴于这种情况，有 人建议对校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符号，只标出突变 型品系(Su+)的特殊基因座位符号，如supD和supE等。
⑧ 用预冷的0.1mol/L CaCl2溶液2.5mL，小心轻轻悬浮沉淀，4℃过夜。 可直接使用。 ⑨ 次日加20%(最终浓度)灭菌预冷甘油。 ⑩ 分装成每Eppendorf管200uL。 新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞0℃~ 4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在-70℃干冰或液氮气体 部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。
抗生素的配制
抗生素
工作浓度 松驰型质粒 60ug/mL 170ug/mL 50ug/mL 严紧型质粒 20ug/mL 25ug/mL 10ug/mL
氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水） 氯霉素(Cm) 卡那霉素(Kan) 34mg/mL（乙醇） 50ug/mL（水）
链霉素(Sm)
四环素(Tc)
某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上“△”表示，
2．有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是 性因子F。细菌中有F因子的描述为F+；没有的为F-。有些F因子上面 带有细菌的某些基因，这样的F因子写作Fˊ，它所带基因的描述方法 同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面带有细菌的lac和proA， B基因。又如，FlacZ，proA+，B+表示F因子上面带有lac和proA，B 基因，但是，其中的Z基因是突变的基因。
10mg/mL（水）
5mg/mL（乙醇）
50ug/mL
50ug/mL
10ug/mL
10ug/mL
大肠杆菌感受态细胞制备和贮存
在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体
DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA
复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌 宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大
④ 细菌培养管取出臵水浴中，10~15分钟。 ⑤ 细菌移入预冷的离心管中，4℃4000GSA转头，转离心5分钟；弃上清，
留沉淀臵于冰浴中。
⑥ 加0.1mol/L CaCl2(预冷)溶液25mL，将沉淀充分悬浮，臵冰浴中 20~30分钟。延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在0℃过夜。
⑦ 4℃，4000~2500rpm转离心5分钟，弃上清，留沉淀，臵冰浴中。