感受态细胞和质粒DNA的转化(C)
质粒的转化实验报告
一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。
3. 学会筛选和鉴定转化子。
二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。
通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。
本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。
（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。
（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。
（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。
（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。
（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。
（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。
2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。
（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。
五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。
2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。
3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。
感受态细胞和质粒DNA的转化(C)
质粒DNA可以用于基因治疗， 将正常的基因导入病变细胞， 纠正或补偿缺陷基因。
质粒DNA可以用于构建转基因 植物、动物和微生物，用于生 物工程领域的研究和应用。
03
感受态细胞与质粒DNA的转化过程
转化方法
CaCl2法
通过使用CaCl2处理细胞，使 细胞处于易于吸收外源DNA的 状态，然后加入质粒DNA进行 转化。
在基因工程领域的应用
基因克隆与鉴定
将目的基因插入质粒中，通过转化感受态细胞实 现基因克隆与鉴定。
基因敲除与突变
利用感受态细胞将突变基因导入细胞，实现基因 敲除或突变。
基因表达分析
通过将目的基因导入感受态细胞，分析目的基因 的表达情况，研究基因功能。
转化技术的发展与展望
技术优化
不断优化感受态细胞的制备和转化条件，提高转化效率和稳定性。
应确保质粒DNA的浓度、纯度和分子量符合要求，以提高 转化效率。
转化液的选择
根据不同的转化方法选择适当的转化液，如CaCl2溶液或电 穿孔缓冲液。
转化效率
影响因素
感受态细胞的制备、质粒DNA的质量、转化液的选择、温度、pH 值等都会影响转化效率。
提高转化效率的方法
优化感受态细胞的制备条件、选择高质量的质粒DNA、调整转化 液成分、控制适宜的温度和pH值等。
感受态细胞和质粒DNA的转化
目
CONTENCT
录
• 感受态细胞介绍 • 质粒DNA介绍 • 感受态细胞与质粒DNA的转化过程 • 转化后的筛选与鉴定 • 感受态细胞与质粒DNA转化的应用
与展望
01
感受态细胞介绍
感受态细胞的定义
感受态细胞是指在特定条件下，能够接受外源DNA并使其转化进 细胞内的细菌细胞。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
质粒DNA转化感受态大肠杆菌 protocol
质粒DNA转化感受态大肠杆菌一、实验原理转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。
大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。
质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
二、实验材料准备1. 器材微量移液取样器，移液器吸头，恒温水浴锅，制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，1.5 ml Eppendorf管，50 ml离心管，乳胶手套，恒温培养箱2. 试剂LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素(或卡拉霉素) 、感受态细胞3. 材料处理转化之前超净台紫外照射15-20min；枪头、50ml离心管需提前灭菌，烘箱烘干；液体LB培养基灭菌后放到冷库，防止长菌；三、转化1．从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,置冰上解冻1-2 min。
2．加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
3．42℃水浴中热击90秒, 然后迅速置冰上2min，整个过程不要振荡菌液。
4．向管中加入200μl LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养（225 rpm）1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5. 将上述菌液摇匀后涂布于含Amp（或kna）的LB琼脂平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后,37℃倒置培养12-16小时。
四、注意事项1.加液体LB培养基之前观察其是否长菌2.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂3.提前打开水浴锅，将温度调到42度4.实验目的是表达蛋白，可热击完直接涂平板；目的是质粒扩增或后续要PCR，需在热击后37℃振荡培养复苏1小时5.实验室常用的用于质粒扩增的感受态菌是Top10，用于质粒表达的感受态菌是BL21 Star(DE3)。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]
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行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以 满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面操 作：
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性 的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基 中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA分子的受体细胞)。
实验结果:下次实验观察并分析筛选结果
四、注意事项
➢ 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因 素: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接 或储于４℃的培养菌,最好从－70℃或-20℃甘油 保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌 液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可 通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株 的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 (不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度 过高或不足均会影响转化效率。
四、注意事项
➢ 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好 分装保存于干燥的冷暗处。
➢ 4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均 应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试 剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶 或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要 的麻烦。
五、质粒DNA转化常见问题
EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速 颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构
色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：
DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
三．实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养 箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝 胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰 上放置2～3min；
溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep 管中；
7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀， 室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙 醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸 上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约 8min)，存于－20℃或直接用于酶切。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
新手入门：质粒的转化,满满干货
新手入门：质粒的转化，满满干货原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。
感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。
在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-Modification 缺陷变异株，以防止对导入外源DNA进行切割）一般通过诱导的方式实现。
主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。
由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。
质粒的转化主要包含Ⅰ感受态细胞制备Ⅱ质粒DNA转化Ⅲ质粒DNA的提取（Ⅰ）感受态细胞制备1）从新活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2）将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中，100ml，37℃振荡扩大培养，2~3h。
当培养液开始浑浊时，间段性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。
3）培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min （4000r/min）。
4）弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。
5）加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。
（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率）6）4℃离心10min（4000r/min）。
7）弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。
8）可直接用于实验，4℃保存。
也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。
（Ⅱ）质粒DNA的转化1）取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。
冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最-后一点冰融化后，迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。
感受态细胞和质粒DNA的转化
⑨ 取100~200uL，臵于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻
璃棒涂匀；静臵5~10分钟。
⑩ 倒臵37℃培养12~18小时(一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增， 提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。 并设下列对照： A．不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。ห้องสมุดไป่ตู้B．用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。 DNA超螺旋转化最好
抗生素的配制
抗生素
工作浓度 松驰型质粒 60ug/mL 严紧型质粒 20ug/mL
氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水） 氯霉素(Cm) 卡那霉素(Kan)
34mg/mL（乙醇） 50ug/mL（水）
170ug/mL 50ug/mL
25ug/mL 10ug/mL
链霉素(Sm)
四环素(Tc)
10mg/mL（水）
处使DNA鲜旋。 ③ 线状DNA 琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的DNA分 开，Agrose电泳中 cccDNA位置最前。
二、阅读微生物的基因型符号
在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表 现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映 的是可观察到的特性。 1．由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在 描述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不 必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给 出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和 metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突变了的，其他基因组仍然 正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因 (如trp) 时，可以用 trp+，或者只是简单地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到 它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就用△表示，如△lon表示 lon基因的缺失突变。
质粒转化42摄氏度热激作用
质粒转化42摄氏度热激作用
质粒转化是将外源 DNA 导入受体细胞的过程，其中一个关键步骤是热激作用。
在质粒转化过程中，将感受态细胞与质粒 DNA 混合后，需要进行热激处理，以提高转化效率。
热激的温度通常为 42°C，这是因为在这个温度下，细胞膜的通透性会增加，使得质粒 DNA 更容易进入细胞。
此外，热激还可以诱导 SOS 反应，激活一系列与 DNA 修复和重组相关的基因，从而促进质粒 DNA 的整合和表达。
热激的时间通常为 90 秒到 2 分钟不等，具体时间取决于使用的感受态细胞和质粒 DNA 的性质。
过长或过短的热激时间都可能会影响转化效率。
需要注意的是，热激处理可能会对细胞造成一定的伤害，因此在进行质粒转化时，需要选择适当的感受态细胞和质粒 DNA，并控制好热激的时间和温度，以确保转化效率和细胞的存活率。
42°C 的热激作用在质粒转化过程中起到了关键的作用，它可以提高细胞膜的通透性，促进质粒 DNA 的整合和表达，从而提高转化效率。
口腔生物学第三章练习题
选择题1. 1953年Watson和Crick提出（ A ）。
A．多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋 B．DNA的复制是半保留的，常常形成亲本-子代双螺旋杂合链 C．三个连续的核苷酸代表一个遗传密码 D．遗传物质通常是DNA 而非RNA E．分离到回复突变体证明这一突变并非是一个缺失突变2. DNA以半保留方式复制如果一个具有放射性标记的双链DNA分子在无放射性标记的环境中经过两轮复制。
其产物分子的放射性情况如何( A )。
A其中一半没有放射性 B都有放射性 C半数分子的两条链都有放射性 D都不含放射性质粒是一种细菌细胞内独立于染色体外的___DNAA. 线状B.环状C. 颗粒状D. 网状E. 不规则形答案：B1.RNA聚合酶特异性识别结合和启动转录的DNA序列是：（B）A.增强子B.启动子C.沉默子D.终止子2.转染的定义是：（C）A.将外源性的DNA分子导入原核细胞的过程B.利用噬菌体颗粒为载体，将外源性DNA导入受体细菌的过程C.将外源性的DNA分子导入真核细胞的过程D.其它以下哪个不是基因的点突变：A1.( C)是蛋白质合成的模版A tRNAB DNAC mRNAD 以上都不对2.64个密码子中，有（A）个是终止密码子A 3B 4C 5D 61. 遗传密码的性质:(E)A.所有的密码都是由3个连续的核苷酸组成，相邻的两个密码之间没有间隔的核苷酸存在；B.64个密码子中，有3个是终止密码（UAA、UGA、UGA)，其余61个都能编码氨基酸，其中AUG是起始密码；C.密码具有简单性D.密码具有通用性.E.以上全是2遗传病是指遗传物质的结构或功能发生改变引起的疾病，牙周病属于：（C）A.染色体病B.单基因病C.多基因病D.线粒体病.E.体细胞遗传病1.启动子通常含有以下哪些元件：eA.TATA框B.CAAT框C.GC框D.A和BE.A,B,C1;除了那个选项，都是釉质的主要蛋白质：bA.釉原蛋白B.胶原蛋白C.釉蛋白D.成釉蛋白E.釉丛蛋白1、转导是（C）A 将外源性的DNA分子导入原核细胞的过程。
感受态细胞的制备及重组质粒的转化
思考题
影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？ 如何利用抗性筛选出重组克隆？
感受态细胞的制备及 重组质粒的转化
experiments of molecular biology
演讲者：
分：分离外源基因目的基因。
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转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。
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切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。
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筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。
实验原理
C
B
A
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基
实验仪器、材料
．超净工作台 ．高速离心机 ．恒温摇床 ．恒温培养箱 ．恒温水浴锅 ．制冰机 ．移液枪
实验材料、试剂
大肠杆菌JM109菌株 重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 试管、培养皿
LB液体培养基 含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50µg／mL） 氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL） 4．0.1mol/L CaCl2溶液
受体菌的培养
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质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化
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感受态细胞的制备
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实验 安排
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实 验 安 排
一、受体菌的培养
从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。（已做） 将该菌悬液以1:50转接于50ml LB液体培养基中，37℃ 250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.3～0.5时，取出置冰浴。
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究一、本文概述本文旨在深入研究枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，以及质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。
文章首先将对枯草芽孢杆菌的生物学特性进行简要介绍，包括其生理结构、生长环境及其在生物技术领域的重要地位。
随后，将详细阐述感受态细胞制备的原理和步骤，包括细胞的诱导、处理和保存等关键环节，并对不同方法进行比较分析，以找出最佳制备条件。
在此基础上，本文将深入探讨质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。
质粒转化作为一种高效的基因转移手段，对于枯草芽孢杆菌的遗传改造和功能研究具有重要意义。
文章将详细介绍质粒转化技术的操作流程，包括质粒的选择、转化条件的优化以及转化效率的评价等方面。
本文还将对枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法的应用前景进行展望。
随着生物技术的不断发展，这些方法在基因工程、生物制药、环境修复等领域的应用潜力将逐渐显现。
通过本文的研究，旨在为相关领域提供可靠的技术支持和实践指导。
二、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备制备枯草芽孢杆菌感受态细胞是质粒转化的关键步骤之一，它涉及到细胞的生长、处理和储存等多个环节。
以下是详细的制备过程：菌种复苏与活化：从低温保存的菌种库中取出枯草芽孢杆菌菌种，在LB固体培养基上进行划线接种，然后将其置于37℃恒温培养箱中倒置培养，待菌落长出后，挑选单个菌落进行活化。
种子液制备：将活化后的菌落接种到LB液体培养基中，以一定的转速（如200rpm）在37℃下振荡培养，直至达到对数生长期。
感受态细胞制备：将种子液按照一定比例接种到新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4~6。
然后，将培养液转移到预冷的离心管中，冰浴10分钟，以4℃、4000rpm的条件离心10分钟，收集菌体。
细胞处理：去除上清液，用预冷的感受态细胞洗涤液轻轻悬浮菌体，冰浴10分钟，再次离心收集菌体。
重复此步骤一次，以彻底去除培养基中的盐分。
实验五农杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
感受态细胞制备的原理
• 感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低 渗氯化钠溶液中，菌细胞壁通透性增加。
实验原理
• 转化方法：电击法、 CaCl2、 NaCl等化 学试剂法 • 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通 过时细胞的状态。 • 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( TransfoKan培养基
影响转化率的因素
• • • • 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验试剂
农杆菌LBA4404 YM培养基， 0.1mol/LNaCl溶液（预冷） 20mM CaCl2溶液（预冷） 卡那霉素（50mg/ml） 质粒DNA （上周日提取）
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基（硫酸链 霉素，25mg/ml）中，28℃条件下，250rpm悬 浮培养12-20小时。
3．在超净工作台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管 中，4℃ ，5000×rpm离心8min。 4．在超净工作台上弃上清，用100mM NaCl （4℃ 预冷）重悬农杆菌，4℃， 5000×rpm离心8min。 5．在超净工作台上弃上清，加入原始农杆菌菌液 1/50体积（800ml）的20mM CaCl2溶液重悬菌体， 并分装成500ml/管。 6．将分装后的离心管置于液氮中10秒，-80℃保存。
农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌LBA4404（抗硫酸链霉素，25mg/ml）接 种在YM平板上，26-28℃ 培养48小时。
YM培养基的配方：酵母提取物0.4g/L；甘露醇 10g/L；NaCl 0.1g/L；MgSO4 0.1g/L； K2HPO4 0.5g/L；琼脂粉 15g/L pH：7.2-7.4
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重组 DNA分子导入受体细胞
导入大肠杆菌: 氯化钙转化法 electroporation 电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法
重组DNA导入哺乳动物细胞:
DNA- 磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导法、 原生质体融合法
酵母菌转化法:
完整细胞转化法 原生质体转化法 电击法
两种假设：
① CaCl2处理4℃，0.1M低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞
壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁， 俗称“打孔”，使DNA分子能够进入细胞内。
② CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的
酶位点，使DNA分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受
态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来
DNA环状 次之
DNA线状 有干扰作用 1ug pBR322DNA转化入HB101可得：5×106/2×107转化子。 DNA分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过10kb，最高 限为15kb。一般1ug DNA可得5×107~1×108个转化菌。
（3）注意事项
① 宿主菌取出时应注意菌株名及编号。 ② 检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。 ③ 整个操作过程应保持无菌状态。 ④ LB培养液中不能有抗生素。 ⑤ 不同受体菌，培养要求不同。如 K802株，OD550=0.5
通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发
生变异，表现型发生变化时才被表示。但是需要特别的表示时，则在 野生的基因型上加“+”，在变异的基因型上加“-”以示区别。表示方
法是用基因产物或其作用的名称的三个斜体字素表示(如 DNA Aednine
methylase-dam)。如果不同的基因变导致相同的作用结果，则加上一个 大写字母(如Recombination- recA、recB、recC)。
⑧ 取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或250mL LB则全 部铺板。
⑨ 取100~200uL，臵于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻
璃棒涂匀；静臵5~10分钟。
⑩ 倒臵37℃培养12~18小时(一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增， 提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。 并设下列对照： A．不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。 B．用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。 DNA超螺旋转化最好
DNA分子。保持感受态的时间约1~2天，一般出现在生长 对数期的后期。
5 . DNA转化感受态细胞
（1）抗性琼脂板中抗生素的配制
抗生素
抽滤除菌并均臵 -20℃保存。 Mg++是四环素拮抗物， 需加MgCl2时改加NaCl(6g/L) 四环素光敏感应避光保存 抗生素不耐热，在加入到琼脂 板中时，应等琼脂冷至 48~50℃时再加入抗生素
某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上“△”表示，
MgSO4＞H2O (NH4)2SO4 KH2PO4 甘油 dH2O
0.18g 1.8g 3.6g 88g 至1L
高压灭菌
Phagemid -20℃ Enzyme -20℃ Buffers -20℃ Primer -4℃ Thiodeyivatives -20℃ Ribonucleotides -20℃ Helper phage -4℃ 臵于—20℃或—80℃，并一个月检查一次
具体保存方法：
① LB琼脂平板划线，37℃，倒臵平板培养(16-24hr)，形成
单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔 绝空气)，倒臵放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。
E. coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中， 4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。 ② 穿刺琼脂(stab agar)，室温，避光可保存数年。 ③ 冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入1050%甘油培养基中，分装，臵-20～ -70℃。可经过30次冻融， 细菌仍然存活。
试举一例来说明上述概念：
JM83，F-，ara，△(lac-proAB)，rpsL，Ф80d，lacZ △M15是这 样一个品系：不带F因子，ara基因座突变(因此不能代谢阿拉伯糖)，
lac操纵子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖体的S12亚基突变(因此有
链霉素抗生)，β-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中 有α-互补作用。如果将克隆的pUC质粒的重组DNA转化入这个细菌， 就可以通过蓝/白菌斑来筛选出转化子)。 野生的大肠杆菌具有大约4700kbp的DNA分子，上面有约2800个基 因。当这些基因中有突然变异发生时，基因产物随之变化，并且有可 能给大肠杆菌带来可以观察到的变化。这种能够观察到的特征叫做大 肠杆菌的表现型(Phenotype)，而把基因的构成叫做大肠杆菌的基因型 (Genotype)。
3．校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系 虽然不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作sup+，表现 型则应该写为Sup-。可是，带有sup基因的突变型品系的基因型必需写 为sup-或者sup，它的表现型是Sup+。也就是说，字面上的概念与实际 上的情况正好倒了一个个儿。因此，在阅读它时要特别小心，以免搞 错。此外，在谈到特殊的校正基因时，它的表现型常用数字来表示， 如Sul；但是，它的基因型却用字母来表示supD。鉴于这种情况，有 人建议对校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符号，只标出突变 型品系(Su+)的特殊基因座位符号，如supD和supE等。
（2） 转化步骤
① 感受态细胞新鲜配制的或从-80℃冻存取出后臵于冰水中融化。
② 取出分装到Eppendorf管中，每管100~200uL。 ③ 加入需转化的DNA溶液25ul充分混匀(1~5ug/mLDNA)。
④ 冰水中放臵30分钟。
⑤ 37℃或42℃水浴2分钟。(热休克) ⑥ 冰浴2min。
⑦ 每管再加入1mL LB培养基，37℃振荡培养1小时。
肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆
菌缺乏天然的转化机理。1970年M. Mandela 和A. Higa提 出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌，
能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞
称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转 化频率。目前对这种机制尚不清楚。
感受态细胞(Compenent cells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化 到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。 (主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)
① 取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70℃保存，37℃过夜 (一般16小时)。 ② 取一个菌落接种于3~5mlLB培养管中，37℃振 培养，过夜(8~16 小时)。 ③ 取出1mL过液菌加入新鲜配制的LB培养液50mL中(2%接种量)。 37℃振荡培养，2~4小时。测定光密度值(约5×107个细胞/mL)， OD550达0.3~0.5。 注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值 间关系不同。 HB101，OD600=0.5（约×107个细胞/mL） X1776，OD600=0.2（约×107个细胞/mL）
2．有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是 性因子F。细菌中有F因子的描述为F+；没有的为F-。有些F因子上面 带有细菌的某些基因，这样的F因子写作Fˊ，它所带基因的描述方法 同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面带有细菌的lac和proA， B基因。又如，FlacZ，proA+，B+表示F因子上面带有lac和proA，B 基因，但是，其中的Z基因是突变的基因。源自抗生素的配制抗生素
工作浓度 松驰型质粒 60ug/mL 170ug/mL 50ug/mL 严紧型质粒 20ug/mL 25ug/mL 10ug/mL
氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水） 氯霉素(Cm) 卡那霉素(Kan) 34mg/mL（乙醇） 50ug/mL（水）
链霉素(Sm)
四环素(Tc)
大肠杆菌(Escherichia coli)
大肠杆菌(Escherichia coli)大约含 3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。 革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度 37℃，PH7.0～7.6 (一般7.4)，保存加 甘油，培养皿密封。 大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期 (生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、 稳定期(饱和期)，约1×109 ~2×108/mL和衰老期。
⑧ 用预冷的0.1mol/L CaCl2溶液2.5mL，小心轻轻悬浮沉淀，4℃过夜。 可直接使用。 ⑨ 次日加20%(最终浓度)灭菌预冷甘油。 ⑩ 分装成每Eppendorf管200uL。 新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞0℃~ 4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在-70℃干冰或液氮气体 部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。
④ 细菌培养管取出臵水浴中，10~15分钟。 ⑤ 细菌移入预冷的离心管中，4℃4000GSA转头，转离心5分钟；弃上清，
留沉淀臵于冰浴中。
⑥ 加0.1mol/L CaCl2(预冷)溶液25mL，将沉淀充分悬浮，臵冰浴中 20~30分钟。延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在0℃过夜。
⑦ 4℃，4000~2500rpm转离心5分钟，弃上清，留沉淀，臵冰浴中。
10mg/mL（水）
5mg/mL（乙醇）
50ug/mL
50ug/mL
10ug/mL
10ug/mL
大肠杆菌感受态细胞制备和贮存
在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体
DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA
复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌 宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大