麦考酚酸对flk-GFP斑马鱼模型抗血管生成的作用机制研究
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（７００００６６） 作者简介：吴新荣（１９５９一），女，主任药师，博士
生导师，主要从事靶向制剂研究 通讯作者：吴新荣
ＴＥｅ—ｌ： ＩＩ（Ｉ０ａ２ｉ０ｌ）：３６聊６５Ｉ３Ｉ４ｇ７＠６ｙａｌｌ∞．ｃ岫
摘要：目的从已上市药物中筛选出具有抑制血管生成作用的小分子化合物 麦考酚酸（免疫抑制剂）并对其抗血管生成作用机制进行研究。方法用ｎｋ —ＧＦＰ转基因斑马鱼作为观察血管生成的动物模型，从含有大部分已上市药
于每孑Ｌ载有１０个受精后２ ｈ野生型ＡＢ斑马鱼 胚胎的１２孑Ｌ培养板中，①实验组，每孑Ｌ加入０．９斗ｇ· ｍＬ一药液２ ｍＬ；②对照组，每孔加入鱼水２ ｍＬ。置于 ２８℃培养箱中培养至４８ ｈｐｆ，用０．３％的３一氨基苯甲 酸乙酯甲基磺酸盐溶液麻醉，用微量注射仪在手动显 微操作系统控制下，自心脏冠脉处，注射荧光异硫氰 酸盐一葡聚糖５斗Ｌ，１５ ＩＩｌｉｎ后，立即于荧光显微镜下， 分别观察实验组和对照组斑马鱼的血液循环情况，并 用显微照相机获取图像。 ２．４吗啉代反义寡核苷酸法
ｅｎｔ．７ｒｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｂｌｏｃｋｅｄ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｉ－
ｃｒｏａｎ百ｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｔ ｗ∞ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＩＭＰＤＨ ２ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｖｅｎｔｒａｌ ｒｅ舀ｏｎｓ ｏｆ ｔｌｌｅ ｄｅＶｅｌｏｐｉｎｇ ｔｍｎｋ粕ｄ ＩＭＰＤＨ２ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ锄－ 舀ｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（聘＞２００，＞５０％ｓｈｏｗｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）．Ｃｏｎｄｍ
文献标识码：Ａ
文章编号：１００１—６８２１１２００８）０４一０３１１—０４
Ａ搬ｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉＶｅ ７ｒｏ ｉｄｅｎｔｉ匆ｓｍａⅡｍｏｌｅｃｕｌｅｓ诵ｔ｝ｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎｔｉ一
锄舀ｏｇｅｎｅｓｉｓ（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＭＰＡ）ｆｒｏｍ印ｐｍｖｅｄ ｄｍｇｓ ａｎｄ ｄｏ ｆｕｒ－ ｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｎｋ—ＧＦＰ ｚｅ－ ｂｒａ６ｓｈ ｓｅｎ，ｅｓ鹪ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ百ｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ １ｉｖｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｗｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｌ １２０ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｒｅＶｅａｌｅｄ ｔ｝Ｉａｔ ＭＰＡ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｅ妇ｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ｂｕｔ ｈａｄ ｎｏ ｏｔｈｅｒ ｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌ 硪ｂｃｔｓ ｏｎ ｇｅｎｅｒａｌ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＭＰＡ ａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｈｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＩＩｌｉｃｒｏａｎ百ｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ３ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ＩＭＰ— ＤＨ，ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔａ昭ｅｔ ｏｆ ＭＰＡ，ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｓ（ＭＯ）一ｋｎｏｃｋ．Ｒｅ－ ｓＩＩＩｔｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＭＰＡ ｉｓ ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄ－
３ １３
ＶｏＩ．２４№．４ Ｊｕｌｙ ２００８（ＳｅｎａＩ Ｎｏ．１１４）
结果
ｌ 麦考酚酸抑制血管生成作用 与对照组比较，用０．９峭·ｍＬ一麦考酚酸处理的
舣一ＧＦＰ转基因斑马鱼的胚胎，可见明显的节间血管 （ＩＳＶ）生长抑制，见图１。
图１． 麦考酚酸对斑马鱼血管生成的作用 ｎｇＩｌｎ １．Ｍｙｃｏｐｈｅｎ出ｃ ａｃｉｄｓ（ＭＰＡ）彻ｔｉａ晒ｏｇｅｎｅｓｉｓ∞ｚｅｂ蕊８ｈ ＣｏｎｔＩｎｌ：ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｔｒａｎ９９ｅｌｌｉｃ ｅｍｂｒｙｏ（３２ ｈｐｆ）；Ｂ１００ｄ ｖｅｓ∞ｌｓ ａｐｐｅａｒ∞ 髀∞ｎｕ吣８ｃｅｎｃｅ；Ｔｍ刚：Ｅｍｂｒｙｏ（３２ ｈｐｆ）ｔ燃矧而ｔＩｌ Ｏ．９鹏－ ｍＬ一１ ＭＰＡ吕ｌｌｄｒｔｅｒ ｎｕａｒｅ船蜘ｔＩＳＶｓ ｗｅ地ｏｂ唧ｖｅｄ
３１２
Hale Waihona Puke Baidu
中国临床药理学杂志
第２４卷第４期２００８年７月（总第１１４期）
多正在进行Ｉ／Ⅱ期临床试验，极个已别被批准上市 用于临床。近年来，从已上市的药物中去发现它们的 新用途，已成为国内外科学家们研究新药的一个捷 径。要想从已知药物中，进行大通量快速筛选，从而 得到新的药效，就需要建立一个在活体内能快速检测 筛选的方法。采用转基因斑马鱼作为模型，对一个含 有１ １２０种化合物、其中８５％是被ＦＤＡ批准上市药 物的化合物库（Ｐｒｅｓｔ访ｃｋ ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）进行筛选， 发现一个已被广泛应用于预防器官移植后排斥作用 的免疫抑制剂——麦考酚酸（化学名称为［６一（４一羟 基一６一甲氧基一７一甲基一３一含氧基一５一羰基）一 ４一甲基一４一乙烯酸）（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＭＰＡ）¨。１ 具有较典型的抗血管生成作用。斑马鱼通过血管芽 的发育形成血管，与哺乳动物的血管形成途径需要相 同的生物活性物质ｐ』，因而，ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼已成为 研究血管生成独特的模式生物Ｍ。１。为此本试验以 其作为模型，对ＭＰＡ抗血管生成的作用机制进行了 研究。
预试结果显示，麦考酚酸在浓度为０．３～０．９¨ｇ ·ｍＬ。１时，在产生影响血管形成作用的同时，不会引 起发育异常。为观察麦考酚酸的血管抑制作用与剂 量的关系，用鱼水配制麦考酚酸，使浓度分别为ｏ．３、 Ｏ．４、Ｏ．５、Ｏ．６、Ｏ．７、Ｏ．８、Ｏ．９斗ｇ·ｍＬ～，于１２孑Ｌ培养 板中（每孔载有１０个２ ｈｐｆ ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼胚胎），实 验组，每孔加入上述药液２ ｍＬ；对照组，每孔加入鱼水
成年丑ｌ【一ＧＦＰ转基因斑马鱼交配，产卵，待分裂
至１６—２５６细胞期时，将鱼卵随机置于９６孔培养板 （Ｕ底）中。实验组，每孔载人３个胚胎及鱼水（速溶 海盐４０ ｇ加蒸镏水１０００ ｍＬ）２００斗Ｌ，于４ ｈｐｆ（ｈｏｕｒ ｐｏｓｔ ｆｅｎｉｌｉｚｅｄ，受精后小时数）时，白化合物库中加样， 使加药后终浓度为１０斗ｍ０１·Ｌ～；２８℃培养箱中，培 养至２４ ｈｐｆ；于倒置荧光显微镜下，观察ｎｋ—ＧＦＰ转 基因斑马鱼的血管生成情况。于同一培养板中，留出 一列孔，不予加药，作为对照组。 ２．２抑制血管生成的生物学指标及麦考酚酸的量 效关系
２ ｍＬ。
受精后２４ ｈ，于倒置荧光显微镜下，观察ｎｋ— ＧＦＰ斑马鱼的血管生成情况，获取图像，用Ｏｐｅｎｌａｂ系 统进行数据处理。
自卵黄延伸部位（ｙｏｌｋ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）末端起，测量４ 条节间血管（ｉｎｔｅｒｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ，ＩｓＶ）长度与 腹线至背脊线长度的百分比，作为血管抑制程度的定 量指标。 ２．３斑马鱼微血管造影术¨１
Ｏ叫＿—一兽＿暑０∞／ＡＨ
ＣｏｎｔｒｏＩ Ｏ ３
Ｏ．６
０９
１．２
ｌ５
ｃ／ｕｍｏｌ Ｌ’１
图２． 麦考酚酸抑制血管生成的量效关系
矾弘肿２．Ｄｏ眙一池ｔ曲ｔｉｏ舶ｌｌｉｐ ｏｆ ｍｙｃ叩ｈ明０Ｈｃ∞ｉｄ售锄Ⅱａｎｇｉ嘈咖ｅ—
Ｂｉｓ
实验组和对照组的节间血管（ＩＳＶｓ）比较，显示了 较明显的量效效应，见图２，且实验组胚胎在麦考酚酸 浓度大于１，０峭·ｍＬ。１时，基本没有ＩＳＶｓ生长。 ２麦考酚酸对斑马鱼循环系统的影响
ｚｅｂｒａｆｉｓｈ
吴新荣１，仲寒冰２，袁 进１。 李晋１，罗新根１，林 硕２
（１．广州军区广州总医院药剂科．广州 ５１００ｉＯ；２．加州大学洛杉矾分校分子细胞和发 育生物系，美国洛杉矶９００９５）
ｗｕ ｘｉｎ—ｒｏｎ９１，ｚＨｏＮＧ Ｈ粕一ｂｉｎ９２，
ＹＵＡＮ Ｊｉｎｌ，Ｕ Ｊｉｎｌ，ＬＵＯ）【ｉｎ—ｇｅｎｌ， ＵＮ Ｓｈｕ０２
血管生成抑制作用。结果麦考酚酸抑制血管生成的作用与药物浓度成正 相关，且有明显的血管生成阻断作用，提示ＩＭＰＤＨ２ Ｍ０能显著抑制斑马鱼
的血管生成（凡＞２００，表型比例＞５０％）。结论麦考酚酸通过抑制ＩＭＰＤＨ２
从而产生血管生成抑制作用。 关键词：转基因斑马鱼；麦考酚酸；血管生成
中图分类号：Ｒ９７６；Ｒ９６５．１
仪器ＩＸ７０一１４ｌ倒置荧光显微镜，日本Ｏｌｙｍｐｕｓ 公司产品；Ａｘｉｏｐｌ锄２ Ｉｍａｇｉｎｇ直立式荧光显微镜、
ＡｘｉｏＣ锄数码显微镜照相机，均为德国蔡司公司产品；
ｃ４７４２—９５高分辨率照相机，日本滨松光子学株式会 社产品；ＭＮ一１５１手动显微操作系统，日本ＮａＩｉｓｈｉｇｅ 公司产品；ＯｐｅＩｌｌａｂ ４．０４数据处理软件，美国Ｉｍｐｒｏｖｉ— ｓｉｏｎ公司产品。 ２实验方法 ２．１分组与ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼筛选化合物库
ＧＣＴＧＡＴｒＡＡＡＴＡ ＧｒＩ℃ＣＧＣＣＡＴＡＧＴ一３：美国Ｇｅｎｅ ７ｎｄ８ 公司提供；化合物库，美国Ｐ诧ｓ晰ｃｋ ｃｌｌｅｌｌｌｉｃａｌ公司提供；３ 一氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（ｔｒｉｃａｉｎｅ ｍｅｔｈａｎｅ８ｕ怕ｎ－ ａｔｅ），美国Ｓｉｇ眦一舢ｄｒｉｃｈ化学试剂公司生产。
动物ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼，野生型ＡＢ斑马鱼，均为 美国加州大学洛杉矶分校分子细胞和发育生物系林 硕实验室提供。
Ｃｈｉｎ Ｊ ＣＩｉｎ ＰｈａｒｒｎａＣＯＩ
Ｖ０１．２４ Ｎｏ．４ ＪｕＩｙ ２００８（Ｓｅｎａｌ Ｎｏ．１１４）
３ｌ ｌ
麦考酚酸对ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼模型抗血管生成的 作用机制研究
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｅａ沁ｃｔｉＶｅ ｍｅｃｈａＩｌｉｓｍ ｏｆ ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｎｋ—ＧＦＰ
物的１ １２０种化合物库（Ｐｒｅｓ附ｉｃｋ Ｃｈｅｆｎｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）中，筛选出具有典型抑制血 管生成的药物麦考酚酸（ＭＰＡ）；对其抑制血管生成的作用进行量效分析，通
过目标基因敲出技术和微注射方法，研究ｎｋ—ＧＦＰ转基因斑马鱼胚胎注射
次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶（ＩＭＰＤＨ）的吗啉反义寡核苷酸（ＭＯ）３种亚型的
材料与方法
１材料 受试样品 麦考酚酸，美国Ｂｉｏｍｏｌ化学试剂公司
生产；荧光异硫氰酸盐一葡聚糖，ＦＩＴＣ—Ｄｅｘｔｒａｎ，相 对分子质量为：２×１０６ ｕ，２０ ｍｇ·ｍＬ～，美国ｓｉｇｍａ—
Ａｌ出ｃｈ化学试剂公司生产；Ｍｏ讪ｏＩｌｌｉ∞，Ｉ姗ＤＨｌｂ：５７一 Ｃ＿淝ＡＧＧＴＡ Ａ７ｒＣ．ＡＧ ＣＣＡｌ＇ＧＡＧｌｌＩ［？Ｉ℃一３：Ｉ＾驷ＰＤＩ｛２：５ ７一
为了证实ＭＰＡ可能是通过抑制ＩＭＰＤＨ起作用 的，本试验用野生型ＡＢ斑马鱼胚胎于ｌ细胞期，用微 量注射器将ＩＭＰＤＨ ３种亚型的吗啉代反义寡核苷酸 注射人细胞内，将鱼卵置于装有鱼水的培养皿中，２８ ℃培养箱孵育，２６ ｈｐｆ时进行原位杂交，显微镜下观察 染色情况。
Ｃｈｉｎ Ｊ ＣＩｉｎ ＰｈａｒｍａｃＯｌ
ｓｉｏｎ
ＭＰＡ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＩＭＰＤＨ２．
Ｋｅｙ、】．，ｏｒｄｓ：ｔｍｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ；ｍｙｃｏｐｈｅｎ０１ｉｃ ａｃｉｄ；ａｎ百ｏｇｅｎｅｓｉｓ
血管生成抑制剂作为治疗肿瘤新的手段，已成为药物研究工作 者的重要课题，目前全球已开发的抗血管生成药物多达５０余种，大
通过微动脉造影法显示，药物处理的斑马鱼胚胎 中，仅有主要的动静脉提供血液循环，见图３；而不存 在器官形成阶段开始新生的节间血管，提示麦考酚酸 是一种有效的新生血管生成抑制剂，且其血管抑制作 用与药物浓度有明显的量效关系。 ３ 麦考酚酸对次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶的抑制作用
（Ｊ．Ｄ印口厅，，ｌＰｎ￡矿—Ｐ：危口几７ｌｃＩｃ，，，ＧＥｍ，ｌｇ。
办Ｄ”＆聊删觑印溉Ｚ矿‰，ｌｇｚｂｕ
埘胁口可 ｃＤｍｍ０以， Ｇ配，ｌｇｚｂＭ
５ＪＤＤＪＤ，吼ｉ船；却ｎ砌忱ｍ矿胁如ｕ一
研，＆盯ａ以Ｄ恍２０ｐ胧ｍ以砒妇ｙ， ‰眈瑙砂矿仇Ｚ扣ｍ玩，‰Ａ，铲ｋ，
Ｕ趴９∞９５）
收稿日期：２００７一０８—２７ 修回日期：２００８—０２—２５ 基金项目：广东省自然科学基金资助项目
（７００００６６） 作者简介：吴新荣（１９５９一），女，主任药师，博士
生导师，主要从事靶向制剂研究 通讯作者：吴新荣
ＴＥｅ—ｌ： ＩＩ（Ｉ０ａ２ｉ０ｌ）：３６聊６５Ｉ３Ｉ４ｇ７＠６ｙａｌｌ∞．ｃ岫
摘要：目的从已上市药物中筛选出具有抑制血管生成作用的小分子化合物 麦考酚酸（免疫抑制剂）并对其抗血管生成作用机制进行研究。方法用ｎｋ —ＧＦＰ转基因斑马鱼作为观察血管生成的动物模型，从含有大部分已上市药
于每孑Ｌ载有１０个受精后２ ｈ野生型ＡＢ斑马鱼 胚胎的１２孑Ｌ培养板中，①实验组，每孑Ｌ加入０．９斗ｇ· ｍＬ一药液２ ｍＬ；②对照组，每孔加入鱼水２ ｍＬ。置于 ２８℃培养箱中培养至４８ ｈｐｆ，用０．３％的３一氨基苯甲 酸乙酯甲基磺酸盐溶液麻醉，用微量注射仪在手动显 微操作系统控制下，自心脏冠脉处，注射荧光异硫氰 酸盐一葡聚糖５斗Ｌ，１５ ＩＩｌｉｎ后，立即于荧光显微镜下， 分别观察实验组和对照组斑马鱼的血液循环情况，并 用显微照相机获取图像。 ２．４吗啉代反义寡核苷酸法
ｅｎｔ．７ｒｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｂｌｏｃｋｅｄ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｉ－
ｃｒｏａｎ百ｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｔ ｗ∞ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＩＭＰＤＨ ２ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｖｅｎｔｒａｌ ｒｅ舀ｏｎｓ ｏｆ ｔｌｌｅ ｄｅＶｅｌｏｐｉｎｇ ｔｍｎｋ粕ｄ ＩＭＰＤＨ２ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ锄－ 舀ｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（聘＞２００，＞５０％ｓｈｏｗｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）．Ｃｏｎｄｍ
文献标识码：Ａ
文章编号：１００１—６８２１１２００８）０４一０３１１—０４
Ａ搬ｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉＶｅ ７ｒｏ ｉｄｅｎｔｉ匆ｓｍａⅡｍｏｌｅｃｕｌｅｓ诵ｔ｝ｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎｔｉ一
锄舀ｏｇｅｎｅｓｉｓ（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＭＰＡ）ｆｒｏｍ印ｐｍｖｅｄ ｄｍｇｓ ａｎｄ ｄｏ ｆｕｒ－ ｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｎｋ—ＧＦＰ ｚｅ－ ｂｒａ６ｓｈ ｓｅｎ，ｅｓ鹪ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ百ｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ １ｉｖｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｗｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｌ １２０ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｒｅＶｅａｌｅｄ ｔ｝Ｉａｔ ＭＰＡ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｅ妇ｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ｂｕｔ ｈａｄ ｎｏ ｏｔｈｅｒ ｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌ 硪ｂｃｔｓ ｏｎ ｇｅｎｅｒａｌ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＭＰＡ ａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｈｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＩＩｌｉｃｒｏａｎ百ｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ３ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ＩＭＰ— ＤＨ，ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔａ昭ｅｔ ｏｆ ＭＰＡ，ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｓ（ＭＯ）一ｋｎｏｃｋ．Ｒｅ－ ｓＩＩＩｔｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＭＰＡ ｉｓ ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄ－
３ １３
ＶｏＩ．２４№．４ Ｊｕｌｙ ２００８（ＳｅｎａＩ Ｎｏ．１１４）
结果
ｌ 麦考酚酸抑制血管生成作用 与对照组比较，用０．９峭·ｍＬ一麦考酚酸处理的
舣一ＧＦＰ转基因斑马鱼的胚胎，可见明显的节间血管 （ＩＳＶ）生长抑制，见图１。
图１． 麦考酚酸对斑马鱼血管生成的作用 ｎｇＩｌｎ １．Ｍｙｃｏｐｈｅｎ出ｃ ａｃｉｄｓ（ＭＰＡ）彻ｔｉａ晒ｏｇｅｎｅｓｉｓ∞ｚｅｂ蕊８ｈ ＣｏｎｔＩｎｌ：ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｔｒａｎ９９ｅｌｌｉｃ ｅｍｂｒｙｏ（３２ ｈｐｆ）；Ｂ１００ｄ ｖｅｓ∞ｌｓ ａｐｐｅａｒ∞ 髀∞ｎｕ吣８ｃｅｎｃｅ；Ｔｍ刚：Ｅｍｂｒｙｏ（３２ ｈｐｆ）ｔ燃矧而ｔＩｌ Ｏ．９鹏－ ｍＬ一１ ＭＰＡ吕ｌｌｄｒｔｅｒ ｎｕａｒｅ船蜘ｔＩＳＶｓ ｗｅ地ｏｂ唧ｖｅｄ
３１２
Hale Waihona Puke Baidu
中国临床药理学杂志
第２４卷第４期２００８年７月（总第１１４期）
多正在进行Ｉ／Ⅱ期临床试验，极个已别被批准上市 用于临床。近年来，从已上市的药物中去发现它们的 新用途，已成为国内外科学家们研究新药的一个捷 径。要想从已知药物中，进行大通量快速筛选，从而 得到新的药效，就需要建立一个在活体内能快速检测 筛选的方法。采用转基因斑马鱼作为模型，对一个含 有１ １２０种化合物、其中８５％是被ＦＤＡ批准上市药 物的化合物库（Ｐｒｅｓｔ访ｃｋ ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）进行筛选， 发现一个已被广泛应用于预防器官移植后排斥作用 的免疫抑制剂——麦考酚酸（化学名称为［６一（４一羟 基一６一甲氧基一７一甲基一３一含氧基一５一羰基）一 ４一甲基一４一乙烯酸）（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＭＰＡ）¨。１ 具有较典型的抗血管生成作用。斑马鱼通过血管芽 的发育形成血管，与哺乳动物的血管形成途径需要相 同的生物活性物质ｐ』，因而，ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼已成为 研究血管生成独特的模式生物Ｍ。１。为此本试验以 其作为模型，对ＭＰＡ抗血管生成的作用机制进行了 研究。
预试结果显示，麦考酚酸在浓度为０．３～０．９¨ｇ ·ｍＬ。１时，在产生影响血管形成作用的同时，不会引 起发育异常。为观察麦考酚酸的血管抑制作用与剂 量的关系，用鱼水配制麦考酚酸，使浓度分别为ｏ．３、 Ｏ．４、Ｏ．５、Ｏ．６、Ｏ．７、Ｏ．８、Ｏ．９斗ｇ·ｍＬ～，于１２孑Ｌ培养 板中（每孔载有１０个２ ｈｐｆ ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼胚胎），实 验组，每孔加入上述药液２ ｍＬ；对照组，每孔加入鱼水
成年丑ｌ【一ＧＦＰ转基因斑马鱼交配，产卵，待分裂
至１６—２５６细胞期时，将鱼卵随机置于９６孔培养板 （Ｕ底）中。实验组，每孔载人３个胚胎及鱼水（速溶 海盐４０ ｇ加蒸镏水１０００ ｍＬ）２００斗Ｌ，于４ ｈｐｆ（ｈｏｕｒ ｐｏｓｔ ｆｅｎｉｌｉｚｅｄ，受精后小时数）时，白化合物库中加样， 使加药后终浓度为１０斗ｍ０１·Ｌ～；２８℃培养箱中，培 养至２４ ｈｐｆ；于倒置荧光显微镜下，观察ｎｋ—ＧＦＰ转 基因斑马鱼的血管生成情况。于同一培养板中，留出 一列孔，不予加药，作为对照组。 ２．２抑制血管生成的生物学指标及麦考酚酸的量 效关系
２ ｍＬ。
受精后２４ ｈ，于倒置荧光显微镜下，观察ｎｋ— ＧＦＰ斑马鱼的血管生成情况，获取图像，用Ｏｐｅｎｌａｂ系 统进行数据处理。
自卵黄延伸部位（ｙｏｌｋ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）末端起，测量４ 条节间血管（ｉｎｔｅｒｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ，ＩｓＶ）长度与 腹线至背脊线长度的百分比，作为血管抑制程度的定 量指标。 ２．３斑马鱼微血管造影术¨１
Ｏ叫＿—一兽＿暑０∞／ＡＨ
ＣｏｎｔｒｏＩ Ｏ ３
Ｏ．６
０９
１．２
ｌ５
ｃ／ｕｍｏｌ Ｌ’１
图２． 麦考酚酸抑制血管生成的量效关系
矾弘肿２．Ｄｏ眙一池ｔ曲ｔｉｏ舶ｌｌｉｐ ｏｆ ｍｙｃ叩ｈ明０Ｈｃ∞ｉｄ售锄Ⅱａｎｇｉ嘈咖ｅ—
Ｂｉｓ
实验组和对照组的节间血管（ＩＳＶｓ）比较，显示了 较明显的量效效应，见图２，且实验组胚胎在麦考酚酸 浓度大于１，０峭·ｍＬ。１时，基本没有ＩＳＶｓ生长。 ２麦考酚酸对斑马鱼循环系统的影响
ｚｅｂｒａｆｉｓｈ
吴新荣１，仲寒冰２，袁 进１。 李晋１，罗新根１，林 硕２
（１．广州军区广州总医院药剂科．广州 ５１００ｉＯ；２．加州大学洛杉矾分校分子细胞和发 育生物系，美国洛杉矶９００９５）
ｗｕ ｘｉｎ—ｒｏｎ９１，ｚＨｏＮＧ Ｈ粕一ｂｉｎ９２，
ＹＵＡＮ Ｊｉｎｌ，Ｕ Ｊｉｎｌ，ＬＵＯ）【ｉｎ—ｇｅｎｌ， ＵＮ Ｓｈｕ０２
血管生成抑制作用。结果麦考酚酸抑制血管生成的作用与药物浓度成正 相关，且有明显的血管生成阻断作用，提示ＩＭＰＤＨ２ Ｍ０能显著抑制斑马鱼
的血管生成（凡＞２００，表型比例＞５０％）。结论麦考酚酸通过抑制ＩＭＰＤＨ２
从而产生血管生成抑制作用。 关键词：转基因斑马鱼；麦考酚酸；血管生成
中图分类号：Ｒ９７６；Ｒ９６５．１
仪器ＩＸ７０一１４ｌ倒置荧光显微镜，日本Ｏｌｙｍｐｕｓ 公司产品；Ａｘｉｏｐｌ锄２ Ｉｍａｇｉｎｇ直立式荧光显微镜、
ＡｘｉｏＣ锄数码显微镜照相机，均为德国蔡司公司产品；
ｃ４７４２—９５高分辨率照相机，日本滨松光子学株式会 社产品；ＭＮ一１５１手动显微操作系统，日本ＮａＩｉｓｈｉｇｅ 公司产品；ＯｐｅＩｌｌａｂ ４．０４数据处理软件，美国Ｉｍｐｒｏｖｉ— ｓｉｏｎ公司产品。 ２实验方法 ２．１分组与ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼筛选化合物库
ＧＣＴＧＡＴｒＡＡＡＴＡ ＧｒＩ℃ＣＧＣＣＡＴＡＧＴ一３：美国Ｇｅｎｅ ７ｎｄ８ 公司提供；化合物库，美国Ｐ诧ｓ晰ｃｋ ｃｌｌｅｌｌｌｉｃａｌ公司提供；３ 一氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（ｔｒｉｃａｉｎｅ ｍｅｔｈａｎｅ８ｕ怕ｎ－ ａｔｅ），美国Ｓｉｇ眦一舢ｄｒｉｃｈ化学试剂公司生产。
动物ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼，野生型ＡＢ斑马鱼，均为 美国加州大学洛杉矶分校分子细胞和发育生物系林 硕实验室提供。
Ｃｈｉｎ Ｊ ＣＩｉｎ ＰｈａｒｒｎａＣＯＩ
Ｖ０１．２４ Ｎｏ．４ ＪｕＩｙ ２００８（Ｓｅｎａｌ Ｎｏ．１１４）
３ｌ ｌ
麦考酚酸对ｎｋ—ＧＦＰ斑马鱼模型抗血管生成的 作用机制研究
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｅａ沁ｃｔｉＶｅ ｍｅｃｈａＩｌｉｓｍ ｏｆ ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｎｋ—ＧＦＰ
物的１ １２０种化合物库（Ｐｒｅｓ附ｉｃｋ Ｃｈｅｆｎｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）中，筛选出具有典型抑制血 管生成的药物麦考酚酸（ＭＰＡ）；对其抑制血管生成的作用进行量效分析，通
过目标基因敲出技术和微注射方法，研究ｎｋ—ＧＦＰ转基因斑马鱼胚胎注射
次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶（ＩＭＰＤＨ）的吗啉反义寡核苷酸（ＭＯ）３种亚型的
材料与方法
１材料 受试样品 麦考酚酸，美国Ｂｉｏｍｏｌ化学试剂公司
生产；荧光异硫氰酸盐一葡聚糖，ＦＩＴＣ—Ｄｅｘｔｒａｎ，相 对分子质量为：２×１０６ ｕ，２０ ｍｇ·ｍＬ～，美国ｓｉｇｍａ—
Ａｌ出ｃｈ化学试剂公司生产；Ｍｏ讪ｏＩｌｌｉ∞，Ｉ姗ＤＨｌｂ：５７一 Ｃ＿淝ＡＧＧＴＡ Ａ７ｒＣ．ＡＧ ＣＣＡｌ＇ＧＡＧｌｌＩ［？Ｉ℃一３：Ｉ＾驷ＰＤＩ｛２：５ ７一
为了证实ＭＰＡ可能是通过抑制ＩＭＰＤＨ起作用 的，本试验用野生型ＡＢ斑马鱼胚胎于ｌ细胞期，用微 量注射器将ＩＭＰＤＨ ３种亚型的吗啉代反义寡核苷酸 注射人细胞内，将鱼卵置于装有鱼水的培养皿中，２８ ℃培养箱孵育，２６ ｈｐｆ时进行原位杂交，显微镜下观察 染色情况。
Ｃｈｉｎ Ｊ ＣＩｉｎ ＰｈａｒｍａｃＯｌ
ｓｉｏｎ
ＭＰＡ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＩＭＰＤＨ２．
Ｋｅｙ、】．，ｏｒｄｓ：ｔｍｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ；ｍｙｃｏｐｈｅｎ０１ｉｃ ａｃｉｄ；ａｎ百ｏｇｅｎｅｓｉｓ
血管生成抑制剂作为治疗肿瘤新的手段，已成为药物研究工作 者的重要课题，目前全球已开发的抗血管生成药物多达５０余种，大
通过微动脉造影法显示，药物处理的斑马鱼胚胎 中，仅有主要的动静脉提供血液循环，见图３；而不存 在器官形成阶段开始新生的节间血管，提示麦考酚酸 是一种有效的新生血管生成抑制剂，且其血管抑制作 用与药物浓度有明显的量效关系。 ３ 麦考酚酸对次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶的抑制作用
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收稿日期：２００７一０８—２７ 修回日期：２００８—０２—２５ 基金项目：广东省自然科学基金资助项目