第4章 抗体的制备及处理1
抗体的制备
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C、凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结构， 大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子 进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、 中、小三种。属区带分离法。
D、离子交换层析：利用带离子基团的纤 维或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
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E、亲和层析：利用生物学分子间所具有的 专一亲和性而设计的层析方法。Ag-Ab, 激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅酶。
但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉 芽肿和持久溃疡而不用于人体免疫。
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(四)免疫动物
+ 为获取高质量(特异性强和效价高)的 抗体，除了需制备质量好纯度高的抗 原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、 剂型、注射途径、注射次数、注射间 隔和接种动物的年龄均与免疫效果密 切的关系。
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B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。 在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用 此法。
C、超声波破碎法：是利用超声波的机械振 动而使细胞破碎的方法。微生物和组织 细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则 较难打破。
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D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化 细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶 菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用 于多种微生物。
C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。
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(2)细菌抗原的制备：取标准菌株，接种。 H抗原：取有动力的菌株液，用 0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h。 Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶 液。
(3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫 卵悬液。
抗体制备流程
抗体制备流程1. 引言抗体制备是生物医学研究领域中常用的实验技术之一。
通过制备特定的抗体，我们可以用于检测特定的蛋白质、细胞或其他分子，从而在研究中获得更加准确和可靠的结果。
本文将详细介绍抗体制备的流程，包括免疫原制备、动物免疫、抗体纯化等几个主要步骤。
2. 免疫原制备2.1 选择免疫原免疫原是指能够引起机体免疫系统产生抗体反应的物质。
在选择免疫原时，需要考虑以下几个因素：•目标蛋白质：免疫原应该是目标蛋白质或其片段，可以是纯化的蛋白质、合成的多肽或重组蛋白等。
•抗原性：免疫原应该具有足够的抗原性，能够激发免疫系统产生抗体反应。
•稳定性：免疫原应该具有足够的稳定性，可以在制备和储存过程中保持其完整性和活性。
2.2 免疫原制备制备免疫原的方法多种多样，常见的包括以下几种：1.纯化蛋白质：从细胞或组织中纯化目标蛋白质，获取单一纯度的免疫原。
2.合成多肽：根据目标蛋白质的氨基酸序列合成相应的多肽片段，作为免疫原使用。
3.重组蛋白：利用基因工程技术在表达系统中表达目标蛋白质的重组形式，作为免疫原。
3. 动物免疫3.1 动物选择选择合适的动物作为免疫宿主是成功制备抗体的重要因素。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子、鸡等。
选择免疫动物时需要考虑以下几点：•易于操作：动物应该易于操作和养护，能够适应实验室环境。
•免疫系统：动物的免疫系统应该对免疫原有良好的反应。
•抗原性：动物对免疫原应有较好的抗原性，能够产生高效的抗体反应。
3.2 免疫程序动物免疫的程序通常包括以下几个步骤：1.初次免疫：将制备好的免疫原与适当的佐剂混合，注射到动物体内。
注射的途径通常选择腹腔或皮下注射。
2.强化免疫：在初次免疫后，根据需要可以进行一定次数的强化免疫，以提高免疫效果。
3.血清采集：在免疫程度达到一定水平后，从动物体内采集血清，其中含有目标抗体。
4.抗体效价测定：通过合适的方法，测定血清中目标抗体的效价。
4. 抗体纯化4.1 抗体提取通过离心等方法，将血清中的抗体分离出来。
抗体的制备原理及其应用实验
抗体的制备原理及其应用实验1. 引言抗体是一类由人体或动物体内产生的免疫分子，具有识别并结合特定抗原的能力。
抗体的制备原理包括免疫原制备、免疫动物的选择、免疫方法、抗体纯化和鉴定等。
在实验室中，抗体的制备得以广泛应用于生物学、医学以及其他领域的研究和实验中。
2. 抗体制备的基本原理抗体制备的基本原理是通过免疫动物对抗原的免疫反应，使其体内产生特异性抗体。
具体步骤如下：•第一步：免疫原制备–收集目标抗原，如蛋白质或多肽片段。
–对抗原进行纯化和浓缩，确保纯度和活性。
•第二步：免疫动物的选择–选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子或大鼠等。
–考虑动物的抗原相似性和体积适宜性。
•第三步：免疫方法–给免疫动物注射抗原，刺激其免疫系统产生抗体。
–定期采集免疫动物的血样，分离抗体。
•第四步：抗体纯化和鉴定–使用技术如亲和层析、离子交换层析等纯化抗体。
–使用免疫学方法验证抗体的特异性和活性。
3. 抗体应用实验抗体的制备在实验中具有广泛的应用价值，以下列举了一些常见的抗体应用实验：•酶联免疫吸附（ELISA）–抗体可用于ELISA实验，通过与特定抗原结合来检测其存在和浓度。
–ELISA广泛应用于血清学、药物检测、疾病诊断等方面。
•免疫组织化学（IHC）–抗体可用于IHC实验中，通过与组织中的抗原结合来检测其在组织中的位置和表达水平。
–IHC可用于病理学研究、癌症诊断等领域。
•免疫印迹（Western Blot）–抗体可用于Western Blot实验，通过与目标蛋白结合来检测其在细胞或组织中的表达水平。
–Western Blot广泛应用于蛋白质研究和疾病诊断等方面。
•流式细胞术–抗体可用于流式细胞术实验，通过与细胞表面或内部特定抗原结合来分析细胞的类型和数量。
–流式细胞术在免疫学、细胞生物学研究中得到广泛应用。
•免疫疗法–抗体可用于免疫疗法中，通过结合肿瘤细胞表面的抗原，识别和杀伤肿瘤细胞。
–免疫疗法是目前肿瘤治疗的重要方法之一。
抗体制备流程
抗体制备流程一、背景介绍抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，具有高度的特异性和亲和力，广泛应用于生命科学领域。
抗体制备是指从动物血清或单克隆细胞中提取纯化抗体的过程。
本文将介绍抗体制备的详细流程。
二、材料准备1. 动物：常用小鼠、大鼠、兔子等；2. 抗原：根据实验需要选择适当的抗原；3. 组织破碎液：可以使用高渗盐溶液、甘油等；4. 纯化柱：可以使用蛋白A/G，蛋白L等；5. 色谱柱：可以使用离子交换柱、大小分离柱等。
三、抗原制备1. 合成或提取目标分子作为抗原；2. 重组表达目标分子作为抗原；3. 从组织或细胞中提取目标分子作为抗原。
四、动物免疫1. 免疫前处理：（1）对动物进行基础检查，确保健康状态良好；（2）按照实验需要确定免疫计划，如免疫次数、免疫间隔等；（3）根据实验需要选择适当的免疫方式，如皮下注射、腹腔注射等。
2. 免疫过程：（1）将抗原与佐剂混合后注射到动物体内；（2）在免疫后的一定时间内采集血清；（3）根据实验需要重复进行免疫。
五、抗体检测1. 间接ELISA法：将抗原固定于微孔板上，加入动物血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
2. Western blotting法：将蛋白质分离并转移至膜上，然后加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
3. 免疫组化法：将组织切片或细胞涂片固定并处理后，加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
六、抗体纯化1. 亲和层析法：利用特异性结合亲和剂纯化目标抗体，如蛋白A/G、蛋白L等；2. 离子交换层析法：利用抗体表面带电性质与离子交换树脂上的离子进行吸附和洗脱；3. 大小分离层析法：利用抗体的分子量差异与分子筛或凝胶过滤树脂进行分离。
七、抗体保存1. 冷冻保存：将纯化后的抗体溶液加入甘油后冷冻保存在-20℃或-80℃；2. 溶液保存：将纯化后的抗体溶液加入保护剂后在4℃下保存。
八、总结以上就是抗体制备的详细流程，其中包括了材料准备、抗原制备、动物免疫、抗体检测、抗体纯化和抗体保存等步骤。
抗体的制备与使用指南
抗体的制备与使用指南一、抗体的制备。
1. 免疫原的选择。
- 对于制备抗体，首先要确定合适的免疫原。
如果是针对蛋白质抗原，要保证其纯度尽可能高。
例如，从细胞裂解物中纯化目标蛋白，可以采用亲和层析等方法。
对于小分子半抗原（如药物分子等），通常需要将其与大分子载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联，以增强其免疫原性。
- 免疫原的剂量也很关键。
一般来说，初次免疫时，对于小鼠等小动物，蛋白质抗原的剂量可在10 - 100μg之间，具体剂量需要根据抗原的性质和动物的种类进行优化。
2. 动物的选择与免疫。
- 动物选择。
- 常用的动物有小鼠、大鼠、兔子等。
小鼠因为繁殖快、成本低，是实验室制备单克隆抗体时常用的动物。
兔子则常用于制备多克隆抗体，其血清中抗体产量相对较高。
- 免疫程序。
- 对于小鼠，初次免疫可采用皮下注射或腹腔注射的方式。
以皮下注射为例，可在小鼠背部多点注射免疫原。
初次免疫后，间隔2 - 4周进行加强免疫，加强免疫的剂量可以适当减少，一般为初次免疫剂量的1/2 - 1/3。
经过2 - 3次加强免疫后，可检测动物血清中的抗体效价。
3. 单克隆抗体的制备。
- 细胞融合。
- 在小鼠免疫后，取其脾脏细胞（其中含有产生抗体的B淋巴细胞），与骨髓瘤细胞（如SP2/0细胞系）在聚乙二醇（PEG）的作用下进行融合。
融合后的细胞具有两种细胞的特性，既能产生特异性抗体，又能在体外无限增殖。
- 筛选阳性克隆。
- 利用次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷型的骨髓瘤细胞和HAT （次黄嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸腺嘧啶核苷）选择培养基进行筛选。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因为缺乏HGPRT酶而死亡，未融合的脾细胞在体外不能长期存活，只有融合成功的杂交瘤细胞能够生长。
然后通过ELISA等方法筛选出产生特异性抗体的阳性克隆。
- 克隆化培养。
- 对筛选出的阳性克隆进行克隆化培养，常用的方法有限稀释法和软琼脂平板法。
限稀释法是将细胞悬液进行连续稀释，使每个孔中理论上只含有一个细胞，然后培养这些细胞，形成单克隆的细胞集落，从而得到稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞系。
抗体制备流程
抗体制备流程抗体制备是一种用来生成特定抗体的实验方法，用于检测、治疗和研究各种疾病。
以下是一种通用的抗体制备流程，包括抗原选择、免疫动物的选择与处理、抗体的制备和纯化等步骤。
首先，我们需要选择合适的抗原。
抗原是导致免疫反应的物质，通常是一种蛋白质。
抗体的选择性依赖于抗原的选择性，因此我们需要选择具有高选择性且易于纯化的抗原。
接下来，我们需要选择合适的免疫动物。
常见的免疫动物包括小鼠、兔子和大鼠等。
选择免疫动物时，需要考虑抗原在动物体内的免疫原性、免疫系统的相似性以及免疫动物的体积等因素。
在选择好免疫动物后，我们需要对其进行处理。
通常情况下，我们会注射抗原到免疫动物体内，同时加入适当的免疫增强剂，以提高抗原的免疫原性。
接种后，我们需要在一定时间间隔内反复注射多次，以激发免疫反应。
在反复注射抗原后，我们需要等待一段时间，使得免疫系统产生足够多的抗体。
这个时间因免疫动物的类型和免疫原性而有所不同。
待免疫系统产生足够多的抗体后，我们需要将免疫动物进行牺牲，并从其体内获得免疫血清。
免疫血清是含有大量抗体的血液，在实验中可以用来检测和纯化抗体。
获得免疫血清后，我们需要对其进行抗体的制备和纯化。
首先，我们可以通过离心等方法去除血液中的红细胞等非细胞成分。
接下来，我们可以采用亲和层析和凝胶过滤等方法，将目标抗体从血液中纯化出来。
在纯化抗体后，我们可以对其进行鉴定和评估，以确保其质量和活性。
常用的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blotting等。
最后，我们可以将纯化的抗体用于实验中。
抗体可以用于检测特定抗原的存在，也可以用于治疗疾病，比如单克隆抗体疗法。
总结起来，抗体制备流程包括抗原选择、免疫动物的选择与处理、抗体的制备和纯化等多个步骤。
这一流程需要耗费一定的时间和资源，但是通过这一流程我们可以获得高质量和高选择性的抗体，从而用于检测、治疗和研究各种疾病。
抗体制备流程
抗体制备流程抗体制备是生物学研究中常见的实验技术之一，也是一项复杂而精细的工作。
下面将介绍抗体制备的一般流程，以供参考。
1. 抗原制备。
首先，需要准备抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
通常情况下，我们会通过基因工程技术来表达和纯化抗原蛋白。
在这一步骤中，需要注意保持抗原的天然构象和活性。
2. 免疫动物的选择。
选择合适的免疫动物也是非常重要的。
常见的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
在选择免疫动物时，需要考虑到免疫动物的体积、生理特征、抗原的种类等因素。
3. 免疫程序。
将制备好的抗原充分混合并与免疫动物进行免疫。
免疫的途径可以是皮下注射、腹腔注射等。
在免疫过程中，需要根据实验要求进行多次免疫，以提高抗体的效价。
4. 血清收集。
在完成免疫程序后，需要定期采集免疫动物的血清样本。
血清中含有免疫动物产生的抗体，可以用于后续的实验。
5. 抗体纯化。
从采集到的血清样本中，可以通过蛋白A/G亲和层析柱或其他纯化手段来纯化抗体。
纯化后的抗体可以用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blot）等实验。
6. 抗体鉴定。
鉴定纯化后的抗体的效价和特异性也是必不可少的步骤。
常用的鉴定方法包括ELISA、Western blot、免疫组化等。
7. 抗体保存。
最后，需要将鉴定合格的抗体进行分装并保存。
在保存过程中，需要注意避免抗体的冻融循环，以保证抗体的稳定性和活性。
总结。
抗体制备是一项复杂的实验技术，需要研究人员具备扎实的实验技能和丰富的经验。
在实验过程中，需要严格控制各个步骤的条件和参数，以保证抗体的质量和稳定性。
希望本文介绍的抗体制备流程能对您有所帮助。
抗体的制备实验报告
一、实验目的本实验旨在了解抗体的制备原理和方法，掌握多克隆抗体制备过程，为后续的免疫学研究和应用提供实验基础。
二、实验原理抗体是机体免疫系统识别和清除抗原的重要物质。
抗体由B淋巴细胞分化而来的浆细胞产生，具有特异性结合抗原的能力。
根据抗体来源和特性，可分为单克隆抗体和多克隆抗体。
本实验主要制备多克隆抗体。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）抗原：猪链球菌全菌抗原（2）免疫动物：成年家兔（3）佐剂：福氏佐剂（4）抗体检测试剂：酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒2. 实验仪器：（1）恒温培养箱（2）低温高速离心机（3）酶标仪（4）微量移液器（5）恒温水浴锅四、实验方法1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔4只，进行适应性饲养，适应新环境后，进行免疫。
2. 免疫抗原的制备将猪链球菌全菌抗原与福氏佐剂等比例混合，制备成抗原悬液。
3. 免疫注射将制备好的抗原悬液分别注入4只家兔的皮下，每组注射2ml。
注射后观察动物的反应，如有异常，及时处理。
4. 免疫程序免疫注射后，每隔7天进行一次加强免疫，共进行3次。
5. 抗体采集免疫注射结束后，于第28天采集家兔血液，分离血清。
6. 抗体检测采用ELISA方法检测血清中的抗体水平，以确定抗体产生情况。
五、实验结果与分析1. 免疫动物的反应免疫注射过程中，家兔出现不同程度的局部肿胀和红斑，但无严重反应。
2. 抗体检测ELISA结果显示，免疫后28天，家兔血清中抗体水平达到最高，表明抗体产生成功。
六、实验结论本实验成功制备了多克隆抗体，为后续的免疫学研究和应用提供了实验基础。
七、实验讨论1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔作为免疫动物，确保实验结果的可靠性。
2. 免疫抗原的制备抗原的制备质量直接影响到抗体的产生。
本实验采用猪链球菌全菌抗原，确保抗原的有效性。
3. 免疫程序免疫程序的设置应根据抗原特性和动物个体差异进行调整，以获得最佳免疫效果。
4. 抗体检测ELISA方法具有灵敏度高、特异性强等优点，适用于抗体水平的检测。
抗体的制备与纯化
佐剂的作用机理
延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈 促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”
抗血清的采集
1、采集方法 2、血清的分离与灭活
采集方法
一次性采集 多次性采集
抗血清的分离与灭活
血清析出的温度 血清的灭活
第二节 单克隆抗体的制备方法
1ml
培养液 10ml
离心
37。C摇动、 离心
1000rpm 由慢渐快1min、 1000rpm
10min 静止1.5min 7min
加入HAT培养 液悬浮细胞， 置于培养孔内
选择性培养
随机融合后的细胞类型 HAT选择培养原理
随机融合后的细胞类型
细胞组合
淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤
对筛选方法的要求： 多——大量样品一次检测 快——迅速取得检测结果 准——检测结果可靠性高 灵——检测方法灵敏度高
常用筛选方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等
克隆化过程
概念：建立单一细胞克隆 方法：有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞
思考题
1、比较多克隆抗体与单克隆抗体的特点 并考虑其在应用上的差异
2、以杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要 技术步骤有哪些？
3、如何对获取的抗体进行鉴定？
有限稀释法
计数
103/ml 102/ml 10/ml 0.5-2/孔
单克隆抗体的制取
制取方式： 体外——培养罐法 体内——腹腔接种 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定——Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定——是否针对同一决定簇
详细介绍抗体的生产制备
详细介绍抗体的生产制备抗体是一种由人类或动物免疫系统产生的蛋白质分子，用于识别和抵御入侵体内的外来抗原，如细菌、病毒或其它异物。
它们起到了非常重要的免疫调节和防御作用。
抗体的生产制备可以通过以下步骤进行：免疫原选择、免疫动物筛选、抗原接种和免疫、细胞融合和克隆、抗体纯化和检测。
首先，选择合适的免疫原。
免疫原一般是指从目标病原体中提取出的具有抗原性的物质。
免疫原可以是细菌、病毒、真菌、寄生虫等。
选择合适的免疫原非常重要，因为它决定了抗体的特异性和亲和性。
其次，选择合适的免疫动物。
大多数情况下，小鼠是最常用的免疫动物。
它们具有一种高度多样化的基因组和良好的免疫系统。
其他常用的免疫动物还包括兔子、猴子、鸟类等。
第三，进行抗原接种和免疫。
将免疫原注射到免疫动物的体内，触发其免疫系统产生特异性抗体。
免疫过程可以通过多次接种来增强免疫效果。
根据需要，可以选择不同的免疫方法，如小鼠腹腔注射、小鼠尾静脉注射、兔子皮下注射等。
接下来的步骤是细胞融合和克隆。
细胞融合是将免疫细胞与肿瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞拥有免疫细胞的能力和肿瘤细胞的无限增殖能力。
杂交瘤细胞可以在体外持续产生特异性抗体，这使得抗体的大规模生产成为可能。
接下来，通过限稀克隆的方法，从杂交瘤细胞中筛选出特异性抗体的产生细胞株。
最后，抗体纯化和检测。
通过对培养物中的细胞和抗体的分离，可以获得纯化的抗体。
这可以通过多种方法实现，如亲和层析、凝胶渗透层析和蛋白质A/G结合等。
检测抗体的纯度和活性也是十分重要的。
常用的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blotting）和流式细胞术等。
总结起来，抗体的生产制备是一个复杂的过程，需要经过免疫原选择、免疫动物筛选、抗原接种和免疫、细胞融合和克隆、抗体纯化和检测等多个步骤。
这些步骤都需要仔细和精确地操作，以确保最终获得高质量和高效能的抗体产品。
抗体的生产制备能够为医学研究和临床诊断提供重要的工具和方法。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
抗体制备原理
抗体制备原理
抗体制备原理：
抗体是免疫系统中一种特殊的蛋白质，能识别和结合到体内外的抗原分子，并参与免疫反应。
抗体制备是通过免疫原与免疫动物（如小鼠、兔子等）的免疫系统进行相互作用，使免疫动物产生特异性抗体的过程。
抗体制备一般包括以下几个关键步骤：
1. 免疫原选择：选择与目标抗原相关的合适免疫原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白等。
免疫原通常需要具备良好的纯度和完整性。
2. 免疫动物免疫：将选择的免疫原注射到免疫动物体内，通常会进行多次免疫，以激活免疫系统，使其产生针对免疫原的特异性抗体。
3. 抗体检测：在免疫动物免疫一段时间后，通过抗体检测方法（如ELISA、Western blot等）检查免疫动物体内是否已产生特异性抗体。
可选用已知抗原的标准抗体对比，以确定产生的抗体特异性。
4. 免疫细胞融合：将免疫动物的脾细胞或淋巴细胞提取出来，并与骨髓瘤细胞进行融合。
骨髓瘤细胞是一种恶性细胞，具有无限增殖潜力，融合后能够长期保存抗体合成所需的基因。
5. 杂交瘤筛选：将融合细胞进行限稀稀释，使其单个细胞分散
于培养基中，便于各个细胞独立地生长。
然后通过对培养基中的细胞进行筛选，选择出能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体培养：将筛选出的杂交瘤细胞进行分离和培养，使其形成单克隆细胞株。
每个单克隆细胞株都来自于同一个B 细胞，因此能够产生具有相同抗原特异性的抗体。
7. 抗体纯化：将培养出的单克隆抗体进行纯化，去除杂质和不需要的成分，得到高纯度的抗体样品。
以上是一般的抗体制备原理，不同实验室和具体实验会根据需要和条件进行微调或改进。
抗体的制备与使用指南
抗体的制备与使用指南
《抗体的制备与使用指南》
嘿呀，今天咱就来聊聊抗体这玩意儿。
你知道吗，就像我之前有一次感冒了，那可真是难受得要命啊！整天咳咳咳，感觉肺都要咳出来了。
这时候我就在想，要是有个什么东西能帮我快点好起来就好了。
后来我才知道，这抗体就像是我们身体里的小战士。
咱先来说说抗体的制备吧。
这就好比是在训练一支精锐部队，得有各种条件和步骤呢。
首先得找到合适的“原料”，就像做菜得有好食材一样。
然后经过一系列复杂的过程，慢慢培养出这些厉害的抗体小战士。
那抗体怎么使用呢？就像我感冒的时候，如果身体里有足够多的针对感冒病毒的抗体，它们就能迅速出击，把那些坏家伙给干掉。
这些抗体就像是一个个聪明的小精灵，知道该去对付谁，然后精准打击。
而且哦，抗体还挺有个性的。
不同的抗体针对不同的敌人，可不能乱来。
就像我们不能让步兵去打飞机一样，得让合适的抗体去对付合适的病原体。
哎呀，说了这么多，总之抗体就是我们身体的好帮手啦。
有了它们，我们才能在这个充满各种病菌的世界里好好地活着。
下次要是再感冒，我可得好好指望我身体里的这些抗体小战士啦！希望它们能像超级英雄一样，迅速把病魔赶跑，让我又能活蹦乱跳的啦！哈哈！
怎么样，这下你对抗体的制备和使用有点了解了吧！。
抗体制备过程
抗体制备过程抗体是一种重要的生物分子，具有广泛的应用价值，尤其在医学和生物学研究领域。
抗体制备过程是制作抗体的关键步骤之一，本文将详细介绍抗体制备的过程。
抗体制备的过程可以分为以下几个步骤：抗原的选择、免疫动物的选择、免疫程序的设计、抗血清的制备和纯化。
第一步是选择抗原。
抗原是诱导机体产生抗体的物质，可以是蛋白质、多肽、多糖或化合物。
抗原的选择应根据研究目的和需要进行，通常选择与研究对象具有相关性的抗原。
第二步是选择免疫动物。
常用的免疫动物有小鼠、兔子、大鼠等。
选择合适的免疫动物要考虑到其灵敏度、免疫反应强度和体积等因素。
通常情况下，小鼠是最常用的免疫动物，因为其体积小、繁殖周期短且易于操作。
第三步是设计免疫程序。
免疫程序的设计要考虑到抗原的适宜剂量、免疫次数和免疫间隔时间。
在设计免疫程序时，需要注意免疫次数过多可能导致免疫动物免疫抑制，而免疫间隔时间过短则可能导致免疫反应不充分。
第四步是抗血清的制备。
免疫程序完成后，免疫动物的血液中会产生特异性抗体。
在抗血清制备过程中，需要采集免疫动物的血液，并对血液进行离心分离得到血清。
血清中包含了特异性抗体，可以用于后续实验和分析。
第五步是抗血清的纯化。
抗血清中除了包含特异性抗体外，还有其他非特异性成分，如血浆蛋白和其他血清成分。
因此，在使用抗血清之前，需要对其进行纯化。
常用的纯化方法有盐析法、胶体蛋白聚集法、亲和层析法等。
抗体制备过程的关键是合理设计和严格执行免疫程序。
只有充分考虑抗原选择、免疫动物选择、免疫程序设计以及抗血清的制备和纯化，才能获得高质量的抗体。
总结起来，抗体制备的过程包括抗原的选择、免疫动物的选择、免疫程序的设计、抗血清的制备和纯化。
这个过程需要合理选择抗原和免疫动物，并设计适当的免疫程序。
制备好的抗血清还需要进行纯化处理，以去除其他非特异性成分。
抗体制备过程的成功与否将对后续的实验和研究结果产生重要影响。
抗体的生产制备及应用
（一）抗原制备
颗粒性抗原
细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫原性，可 不加佐剂。例如，直接腹腔注射1~2×107个细胞。
可溶性抗原
可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在 原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需与弗氏完全或不完 全佐剂混匀，进行免疫。
（二）免疫动物
免疫目的
B淋巴细胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形 成能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，有利于细胞 融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。多次免 疫可通过抗体亲和力成熟机制，使B细胞分泌高 亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌高亲 和力抗体，有更高的应用价值。
2）抗血清的采集
▪ 采集：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血 ▪ 分离：室温自然凝固1～2h，然后放4℃冰箱过夜，待血块收缩后分离
血清，有些血清须经56℃30min 使补体灭活。
（四）抗体纯化
1、目的：尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分 2、纯化方法 ▪ 硫酸铵盐析：先用50%饱和度去除白蛋白，再用2次33%饱和度沉淀免疫
（二）免疫动物
动物选择
采用与骨髓瘤供体同一品系的动物 免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞在
种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，获 得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。
动物对抗原刺激易产生免疫应答反应
8 ~ 12周龄雌性小鼠（最常用BALB/c）
（二）免疫动物
脾（spleen）
抗原
球蛋白。
▪ 离子交换层析：常用的离子交换剂有DEAE纤维素和QAE纤维素。以 QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多种蛋白质，但不能吸附IgG.
▪ 亲和层析法：将纯抗原交联到Sepharose4B，装柱后，将抗血清通过亲和 层析柱，特异性吸附IgG。
抗体合成流程
抗体合成流程包括以下几个步骤：1. 免疫原制备：准备用于免疫动物的抗原，通常可以是蛋白质、多肽或者多糖等，也可以是细胞组织、细胞培养上清液等。
抗原需要经过纯化和检测，确保其纯度和质量。
2. 动物实验和免疫：将动物（如小鼠、兔等）注射含有免疫原的佐剂，等待免疫反应发生。
这一过程中，需要选取合适的动物品种、注射剂量和免疫时间等因素。
3. 收集血清并分离血清中的IgG：免疫完成后，通过静脉采集动物的血液，离心收集血清。
然后，使用不同的技术（如硫酸铵沉淀、蛋白A/G柱层析等）分离出血清中的含有特异性抗体的IgG。
4. 抗体纯化和鉴定：分离出的IgG抗体可以通过各种方法（如亲和层析、电泳等）进一步纯化。
在商业化抗体制备程序中，通常利用高效的纯化技术和经过多重鉴定的质量控制手段保证抗体的质量一致性。
此外，抗体合成还需要在细胞层面进行，当人体遭遇细菌或病毒入侵时，体内的B淋巴细胞首先识别外来的抗原，然后被吞噬细胞吞噬，吞噬细胞呈递抗原给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞，从而导致B细胞分裂分化为浆细胞和记忆细胞，浆细胞产生抗体。
当同种抗原再次入侵时，记忆细胞快速分裂分化产生浆细胞，浆细胞产生抗体。
抗体的合成是一个复杂且精细的过程，其合成及分泌是在体液免疫的反应阶段进行的，合成部位是在效应B细胞内的粗面内质网上的核糖体上。
抗体的合成要受到相应基因的控制，控制其合成的基因为真核细胞基因，其结构包括编码区和非编码区，非编码区对编码区的表达起调控作用，编码区包括内含子和外显子。
基因控制抗体的合成包括转录和翻译过程。
人体内合成抗体所需要的原料-氨基酸的来源途径有：肠道吸收、自身蛋白质的分解、氨基转换作用（其它物质的转变）等。
1。
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单克隆抗体的应用
检验医学诊断试剂 ① 病原微生物抗原、抗体的检测 ② 肿瘤抗原的检测 ③ 免疫细胞及其亚群的检测 ④ 激素测定 ⑤ 细胞因子的测定
肿瘤的导向治疗—生物导弹 蛋白质的分离纯化
抗 原 31 2 4
免疫
BA LB /c
1234
31 2 4
传统抗血清
所有抗体混合
B 細胞 1
3 2
4
瘤細胞
思考题
n 细胞融合技术的发展及应用进展 n 用于细胞融合的酶缺陷骨髓瘤细胞株筛选方法
2. 细胞准备
细胞融合
☆骨髓瘤细胞
•☆免选疫择脾对细数胞生长期的细胞进行传代培养 •••••••••••••☆饲细活避注存无拉无无脾计细常其饲养胞细免意于血颈菌血或数胞用中养细形胞细切清处取清淋、密小巨存-8胞0态计胞忌培死脾培巴备度鼠噬活℃浑数返过养小（养细用过腹细一或圆祖多液鼠或液胞低腔胞般液、，传洗，淋吹，不细还不氮透定代，酒巴出洗利胞有超中亮期培计精结法2于作清过～、用养数消）或细饲除23周均，，毒筛胞养死8次，-A一可备网生细亡不G、将用法长胞细处影排细研，胞理响列胞磨的2细×杂整分法作胞1交齐装游用0瘤4冻离细
（五）抗体效价的测定
1. 融合前 ELISA 效价（必须）和特异性（非必须）
2. 融合筛选时 ELISA，取样时防止污染 阳性（必须），阴性（必须），特异性 （非必须）
（六）抗体的保存
1. 同多克隆抗血清
☆56℃灭活30min，可加1/10000硫柳汞或 1/1000叠氮钠防腐
n 除菌后，4℃，3个月～半年 加甘油可延长保存期
胞的纯化
3. 细胞融合
细胞融合
• 取对数分裂期SP2/0与免疫鼠脾细胞，比例 为1:5～1:10，无血清培养基洗三次
• 1ml 50%的PEG（预温）在1分钟内滴完,静 置90秒,时间一到,将事先准备的无血清培养 液分步加入,终止PEG作用
• 加入HAT培养基（或24h后加HAT）, 分加 到96孔培养板（ 105个/孔）
食品免疫学检测技术
第四章 抗体的制备及处理
第一章 绪论 第二章 抗原 第三章 抗体
第四章 抗体的制备及处理
第五章 常见免疫学检测技术 第六章 免疫学检测技术在食品检测中的应用
第四章 抗体的制备及处理1（2学时）
l 第一节 多克隆抗体的制备 l 第二节 单克隆抗体的制备
第一节 多克隆抗体的制备
多克隆抗体(pAb)是研究和诊断领域广泛使用的 有效工具，主要用于免疫印迹、放免、ELISA、 间接和直接荧光抗体试验、红细胞凝集试验、 免疫组化、免疫沉淀试验、免疫扩散、亲和层 析、酶学以及分离基因产物等 多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的，针对某 一复杂抗原多个表位的不同抗体的混合物，又 称抗血清或免疫血清
多克隆抗体的制备
由不同B细胞克隆产生的针对抗原 上多种抗原决定簇的多种抗体混 合物
一、制备多克隆抗体的基本条件
抗原 实验动物 免疫 抗血清鉴定 抗血清收集 抗血清保存
二、多克隆抗体制备流程
（一）免疫原的制备 （二）实验动物的选择 （三）免疫的实施 （四）免疫血清的收集/采血 （五）免疫血清的鉴定/筛选 （六）免疫血清的保存
未融合的 脾细胞
骨髓瘤-骨髓 瘤杂交细胞
脾-脾杂交 细胞
四、单克隆抗体制备的流程
（一）免疫原的制备 （二）免疫的动物 （三）免疫的实施 （四）采血 （五）抗体效价的测定 （六）抗体的保存 （七）细胞融合 （八）抗体生产
（一）免疫原的制备
1. 参见第2章（抗原） 2. 制备单克隆抗体对免疫原的纯度要求不是
髓瘤细胞融合 4. 兔：兔B细胞和兔骨髓瘤细胞融合
（三）免疫的实施
1. 免疫接种时间表 2. 免疫效果
血清效价、特异性
3. 冲击/加强免疫 效价符合要求à适当休息à冲击免疫 不加佐剂 静脉à3天后融合 腹腔à4天后融合
（四）采血
☆以小鼠为例 n 效价测定
断尾采血 1大滴 n 融合前放血（阳性血清） 眼眶，0.2ml 37℃，1h，4℃过夜，离心取血清 n 对照血清
☆剂量还与抗原种类、免疫途径、免疫次 数、免疫周期等其它条件关联
（三）免疫的实施
2. 免疫途径：静脉(i. v.)、肌肉（i. m.)、皮下 （s. c.)、腹膜内（i. p.)、皮内 (i. d.) 等 ☆静脉受抗原形式、物种、注射量限制 ☆腹腔注射途径在小鼠中经常使用 ☆皮下注射途径在兔等经常使用 ☆淋巴结、脾可直接注射 ☆足垫免疫也被使用 不同注射途径比较见表：
细胞DNA合成途径及HAT筛选原理
主要途径
次黄嘌呤（H） HGPRT
氨 基酸 谷氨酰胺 尿核苷单磷酸
鸟嘌呤核苷酸 胸腺嘧啶核苷酸
替代途径
A
TK
胸腺嘧啶核苷（T）
A：氨甲喋呤，为叶酸拮抗剂 TK：胸腺嘧啶核苷激酶
HGPRT：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶
HAT作用的结果
SP2/0Байду номын сангаас 用8-AG筛选的 HGPRT- ，TK-，无限 增殖特性
（二）实验动物的选择
1. 抗原与免疫动物的亲缘关系，如兔、小 鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊、鸡等
2. 抗血清需要量 3. 动物性别、年龄
雌性攻击性小、低剂量免疫可能更敏感、 更高的循环抗体、较强的免疫反应 4. 抗原性质：蛋白质抗原对多数动物都适合 但一些特殊的如IgE对绵羊，胰岛素对家 兔，胃蛋白酶原对山羊，不易产生抗体
6. 影响细胞融合的因素
• 细胞生长状态 • 骨髓瘤和淋巴细胞比例 • PEG • 血清质量 • 细菌、霉菌、支原体等污染 • 操作手法 • 筛选时机
细胞融合
（八）抗体生产
1. 体外培养法 2. 悬动浮物培体养内诱生法
固腹相水载制体备培，养抗体浓度可达2～5mg/mL 灭菌石蜡油致敏，0.5ml/只à，1～2周后每 只小鼠腹腔注射2×106个杂交瘤细胞，7～ 10天后，当小鼠腹部膨胀且行动迟缓时抽 取腹水， 3000rpm离心10min，弃去脂 肪，收集中间澄清腹水，冻存备用
（三）免疫的实施
4. 抗原注入的体积
（四）免疫血清的收集/采血
☆及时、采前禁食24h n 颈动脉采血
家兔、山羊 n 心脏采血
豚鼠、大鼠、鸡 n 静脉多次采血
家兔耳缘静脉、山羊颈静脉
（五）免疫血清的鉴定/筛选
1. ELISA 2. 双向琼脂扩散 3. 凝集试验
（六）免疫血清的保存
☆56℃灭活30min，可加1/10000硫柳汞或 1/1000叠氮钠防腐
三、杂交瘤细胞的筛选原理（HAT筛选法）
n 细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途 径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的 合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过 程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合 成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它 是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核 苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两 种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个 效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺 乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细 胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤— 鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途 径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖 而很快死亡。唯有融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途 径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在 HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖
脾细胞: 正常细胞， HGPRT+ ，TK+ ， 5~10天自然死亡
HAT
杂交瘤细胞: 从脾细胞 获得了HGPRT+ 和 TK+，可无限增殖
8-氮鸟嘌呤筛选HGPRT缺陷株原理
n HGPRT是嘌呤核苷酸合成替代途径的关键酶， 可直接利用次黄嘌呤进行核酸的应急合成。但 HGPRT可把嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤掺入核酸中， 对细胞的核酸合成产生干扰作用
n 用于细胞融合的骨髓瘤细胞，先用8-氮鸟嘌呤的 培养基培养，正常的细胞能将8-氮鸟嘌呤掺入核 酸中而干扰核酸的合成，因此全部死亡；而少数 HGPRT缺陷型却能存活下来
n 同理，也可用5-溴-2-脱氧尿嘧啶筛选TK酶缺陷 株用于细胞融合
细胞融合的结果及命运
未融合的骨 髓瘤细胞
骨髓瘤-脾 杂交瘤细胞
（三）免疫的实施
3. 免疫间隔时间：是抗血清制备中的重要因 素，特别是首免和二免 ☆若在抗原识别阶段，B细胞正在增殖，如 过早注入抗原，可能会引起免疫抑制 ☆一般首免和二免间隔10～20天，以后间 隔7～10天 ☆免疫次数可达5～8次，半抗原可能需要 较长时间
（三）免疫的实施
4. 抗原注入的体积
（一）免疫原的制备
1. 免疫原制备方法参见第2章（抗原） 2. 制备多克隆抗体对免疫原的纯度要求十分
严格，一般要求电泳纯或层析纯。纯度越 高，特异性越好 3. 考虑抗原的大小、聚集状态及构象状态 >5kDa、小的多肽、是否天然蛋白 4. 避免细菌污染和杂质混入（如内毒素，影 响免疫应答的一些化合物）
m m
m m
细胞融合
1 23
4
阳性筛选
12 34
克隆 培养
各抗体分开
一、单克隆抗体制备的原理
抗体由B细胞合成，每个B细胞含有合成一种抗 体的基因 抗原分子上不同表位分别激活具有不同基因的B 细胞 筛选出分泌专一抗体的B细胞，克隆化培养 B细胞不能体外培养，但骨髓瘤细胞能在体外无 限增殖 应用杂交瘤技术将两者融合，得到杂交瘤细胞 杂交瘤细胞扩大培养，获得单克隆抗体