转基因大米定量检测TT51
2013年10月15日为止发布的转基因检测标准详细清单
2013年10月15日为止发布的转基因检测标准详细清单:转基因作物检测大体分为两种：一是检测是否含有外源蛋白，即外源基因表达产物，主要采用酶联免疫吸附法和试纸条法；二是检测是否含有外源基因(DNA)，主要有Southern杂交技术、基因芯片法和PCR检测法。
一、农业部发布的转基因标准清单 (94项)（2013年10月15日更新）1转基因植物及其产品检测通用要求NY/T672－20032转基因植物及其产品检测抽样NY/T673－20033转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化NY/T674－20034转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法NY/T675－20035转基因大豆环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T719.1-20036转基因大豆环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T719.2-20037转基因大豆环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T719.3-2003 8转基因玉米环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T720.1-20039转基因玉米环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T720.2-200310转基因玉米环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T720.3-2003 11转基因油菜环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T721.1-200312转基因油菜环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T721.2-200313转基因油菜环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T721.3-2003 14转基因植物及其产品食用安全性评价导则NY/T 1101-200615转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素植酸、棉酚和芥酸的测定NY/T 1103.1-2006 16转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素胰蛋白酶抑制剂的测定NY/T 1103.2-2006 17转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素硫代葡萄糖苷的测定NY/T 1103.3-2006 18转基因植物及其产品食用安全检测大鼠90天喂养试验NY/T 1102-200619农业转基因生物标签的标识农业部869号公告－1－200720转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法农业部869号公告－2－200721转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－3－200722转基因植物及其产品成分检测抗除草剂杂交油菜Ms1、Rf1及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－4－200723转基因植物及其产品成分检测抗除草剂杂交油菜Ms8、Rf3及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－5－200724转基因植物及其产品成分检测抗除草剂杂交油菜Ms1、Rf2及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－6－200725转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米TC1507及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－7－200726转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－8－200727转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON810及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－9－200728转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON863及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－10－200729转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜GT73及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－11－200730转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米GA21及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－12－200731转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－13－200732转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米T25及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－14－200733转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米Bt10及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-1-200734转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米CBH351及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-2-200735转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜T45及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-3-200736转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Oxy-235及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-4-200737转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼性PCR方法农业部953号公告-5-200738转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因水稻定性PCR方法农业部953号公告-6-200739转基因植物及其产品环境安全检测育性改变油菜农业部953号公告-7-200740转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第1部分：抗虫性农业部953号公告-8.1-200741转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-8.2-200742转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第3部分：外源基因漂移农业部953号公告-8.3-200743转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-8.4-200744转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第1部分：对靶标病害的抗性农业部953号公告-9.1-200745转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-9.2-200746转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第3部分：外源基因漂移农业部953号公告-9.3-200747转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-9.4-200748转基因植物及其产品环境安全检测抗虫玉米第1部分：抗虫性农业部953号公告-10.1-200749转基因植物及其产品环境安全检测抗虫玉米第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-10.2-200750转基因植物及其产品环境安全检测抗虫玉米第3部分：外源基因漂移农业部953号公告-10.3-200751转基因植物及其产品环境安全检测抗虫玉米第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-10.4-200752转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第1部分：除草剂耐受性农业部953号公告-11.1-200753转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-11.2-200754转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第3部分：外源基因漂移农业部953号公告-11.3-200755转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-11.4-200756转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第1部分：对靶标害虫的抗虫性农业部953号公告-12.1-200757转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-12.2-200758转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第3部分：基因漂移农业部953号公告-12.3-200759转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-12.4-200760转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定性PCR方法农业部1193号公告-1-200961转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Topas19/2及其衍生品种定性PCR方法农业部1193号公告-2-200962转基因植物及其产品成分检测耐贮藏番茄D2及其衍生品种定性PCR方法农业部1193号公告-3-200963转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花MON1445及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-1-201064转基因微生物及其产品成分检测猪伪狂犬TK-/gE-/gI-毒株（SA215株）及其产品定性PCR1485号公告-2-201065转基因植物及其产品成分检测耐除草剂甜菜H7-1及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-3-201066转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化1485号公告-4-201067转基因植物及其产品成分检测抗病水稻M12及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-5-201068转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆MON89788及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-6-201069转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆A2704-12及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-7-201070转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆A5547-127及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-8-201071转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米59122及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-9-201072转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花LLcotton25及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-10-201073转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花定性PCR方法1485号公告-11-2010 74转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花MON88913及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-12-201075转基因植物及其产品成分检测抗虫棉花MON15985及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-13-201076转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范1485号公告-14-201077转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-15-201078转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MIR604及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-16-201079转基因生物及其产品食用安全检测外源基因异源表达蛋白质等同性分析导则1485号公告-17-201080转基因生物及其产品食用安全检测外源蛋白质过敏性生物信息学分析方法1485号公告-18-201081转基因植物及其产品成分检测基体标准物质候选物鉴定方法1485号公告-19-201082转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆356043及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-1-201283转基因植物及其产品成分检测标记基因NPTII、HPT和PMI定性PCR方法农业部1782号公告-2-201284转基因植物及其产品成分检测调控元件CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV 35S终止子定性PCR方法农业部1782号公告-3-201285转基因植物及其产品成分检测高油酸大豆305423及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-4-201286转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆CV127及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-5-201287转基因植物及其产品成分检测bar或pat基因定性PCR方法农业部1782号公告-6-2012 88转基因植物及其产品成分检测CpTI基因定性PCR方法农业部1782号公告-7-201289转基因植物及其产品成分检测基体标准物质制备技术规范农业部1782号公告-8-2012 90转基因植物及其产品成分检测标准物质试用评价技术规范农业部1782号公告-9-2012 91转基因植物及其产品成分检测转植酸酶基因玉米BVLA430101构建特异性定性PCR方法农业部1782号公告-10-201292转基因植物及其产品成分检测转植酸酶基因玉米BVLA430101及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-11-201293转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法农业部1782号公告-12-201294转基因生物及其产品食用安全检测挪威棕色大鼠致敏性试验方法农业部1782号公告-13-2012二、国家质检总局发布的标准（30项）（2013年10月15日更新）1转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495.1-20042转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495.2-20043转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T 19495.3-20044转基因产品检测核酸定性PCR检测方法GB/T 19495.4-20045转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T 19495.5-20046转基因产品检测基因芯片检测方法GB/T 19495.6-20047转基因产品检测抽样和制样方法GB/T 19495.7-20048转基因产品检测蛋白质检测方法GB/T 19495.8-20049基因检验实验室技术要求SN/T1193-200310植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法SN/T1194-200311大豆中转基因成分的定性PCR检测方法SN/T1195-200312玉米中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1196-200313油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1197-200314马铃薯中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1198-200315棉花中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1199-200316烟草中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1200-200317植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1201-200318食品中转基因植物成份定性PCR检测方法SN/T1202-200319食用油脂中转基因植物成份定性PCR检测方法SN/T1203-200320植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法SN/T1204-200321番茄中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1816-200622小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法SN/T 1943-200723主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法SN/T 2074-200824 蜂蜜中转基因成分检测方法普通PCR方法和实时荧光PCR方法SN/T 2135-200825 青椒中转基因成分定性PCR检测方法SN/T 2271-200926水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法 SN/T 2584-201027转基因成分检测玉米检测方法（2013年7月1日起实施）SN/T 1196-201228转基因成分检测大豆PCR-DHPLC检测方法（2013年9月16日起实施） SN/T 3576-2013 29牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法（2013年9月16日起实施）SN/T 3495-201330转基因成分检测番茄检测方法SN/T 1816-2013。
为什么严查大米转基因
为什么严查大米转基因作者：来源：《中国周刊》2014年第01期2009年，中国为两个转基因水稻品种颁发了安全证书。
此举引起了反对转基因人士的强烈反对。
而“中国检验检疫科学研究院举办输欧米制品转基因成分检测方法培训班”的新闻，更让许多人认为“严查对欧大米”说明“转基因大米有害”。
其实，中国的那两个品种并不是最早获得批准的转基因水稻品种。
早在2000年，拜尔开发的两个抗除草剂转基因水稻就在美国获得了批准。
此后，在加拿大和澳大利亚等国也得到了批准。
其中的一个品种也向欧盟申请进口作为食品或者动物饲料。
2007年，欧洲食品安全局发布了评估报告，结论是该大米对于人类健康、动物健康和环境安全都跟相应的非转基因品种一样安全。
也就是说，不管是美国、加拿大，还是欧盟，对于“转基因大米”都没有禁止，反而批准了一些品种。
但是，这两个品种的商业化都没有成功——它们在法律上具有合法的身份，但在现实中却没有吸引力，因而没有农民种植。
实际上，拜尔在转基因水稻上投入了很多，也开发过多种其他的品种。
还有一个品种代号LL601，在美国获准进行大田试验。
1998年开始，到2001年拜尔结束了试验，没有继续开发，也没有申请审批。
2006年，美国一些出口欧洲的大米中检测出了微量的LL601成分。
到了7月底，拜尔正式通报美国食品和药物管理局FDA，一些地区的大米出现了LL601“污染”。
此后的调查没有找到“污染”的来源，但这一“污染事件”对美国水稻产业造成了沉重打击。
日本和俄罗斯宣布停止进口美国大米，而欧盟和墨西哥虽未禁止，但加强了检测。
作为“危机公关”的举措之一，拜尔向美国农业部申请批准LL601转基因水稻。
2006年9月，农业部和FDA完成了对该品种的安全评估，结论是该品种没有安全性的问题。
2008年，这个品种在美国也获得了批准。
不过，这只能说明这些“污染”不会带来危害，并不能解决“污染事件”造成的贸易损失。
约有1.1万稻农受到影响，他们向拜尔提出索赔。
转基因大米定量检测TT51
转基因大米定量检测TT51转基因大米定量检测TT51-1品系1.范围本标准规定了稻谷和大米中TT51-1品系的数字PCR定量检测方法。
本标准适用于稻谷和大米中TT51-1品系特异性的数字PCR定量检测。
本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1 %（w/w）。
2.规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.1 转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T 19495.5 转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T 19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法SN/T 1194 植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法3.术语、定义和缩略语3.1 术语和定义SPS基因：Sucrose Phosphate Synthase gene，水稻蔗糖磷酸合成酶基因。
TT51-1转化体特异性序列：Event-specific sequence of TT51-1，外源DNA插入受体水稻基因组后经重组产生的邻接区序列。
Taq酶：Taq DNA polymerase，源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。
模板：Template, 指数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。
定量检测低限：Limit of quantification（LOQ），在相对标准差不超过25 %的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。
质控样品：Quality control sample, 具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的TT51-1转化体基因组DNA。
微反应体系：Tiny reaction system, 将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其它微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。
武汉大米检测三成样品含转基因 公众被实验十年
武汉大米检测三成样品含转基因公众被实验十年2014年05月13日 12:49 新浪财经微博我有话说(25,134人参与)收藏本文【快讯】武汉大米检测三成样品含转基因食品安全股崛起【推荐阅读】华中农大转基因材料被窃未立案专家称举证难新浪财经讯5月13日，国际环保组织绿色和平发布报告称，湖北市场再次发现非法转基因大米，4个转基因大米样品中3个成分出自华中农业大学研发的转基因水稻Bt汕优63。
中国从未批准任何转基因水稻的商业化种植。
但十年间转基因水稻的非法流通仍屡禁不止，我国公众在不知情的状况下…被实验‟了十年。
”绿色和平食品与农业项目主任王婧说。
以下为报告新闻稿：北京，2014年5月13日：国际环保组织绿色和平今日发布报告，指出2013年底在武汉进行的大米和米制品检测显示近三成样品含转基因成分。
绿色和平还指出，2004年湖北首次爆出转基因水稻非法种植后的十年间，转基因水稻的非法种植和流通在中国从未停止，突显中国转基因生物安全管理亟待加强。
为持续追踪转基因大米非法流通的情况，绿色和平于2013年11月在湖北省武汉市的超市和农贸市场随机购买了大米及米制品共15份，采集的样品交由有资质的第三方检测机构进行检测。
检测结果显示，15个样品中的4个大米样品含有转基因成分，其中3个样品的转基因成分出自华中农业大学研发的转基因水稻Bt汕优63(详见附表)。
“中国从未批准任何转基因水稻的商业化种植。
尽管各地农业部门多年来一直在查处转基因水稻的非法种植，但十年间转基因水稻的非法流通仍屡禁不止。
可以说，这已经成为我国转基因生物安全管理的一块顽疾。
”绿色和平食品与农业项目主任王婧说。
2004年12月，Bt汕优63主要研发者华中农业大学教授张启发向美国《新闻周刊》承认，武汉一家种业公司已经在向农户销售转基因稻种，并指出种植面积至少有100公顷。
根据这一线索，绿色和平调查发现，转基因水稻Bt汕优63的稻种和大米已经在湖北多地非法售卖。
中外科研团队揭示被子植物繁衍关键机制
第20卷第5期转基因大米TT51-1品系精准定量检测方法的比较研究241Comparative Analysis on the Quantitative Detection of Genetically ModifiedRice(Oryza sativa L・)TT51-1EventDeng Tingting1,2Huang Wensheng1Ge Yiqiang2,3*Chen Ying1*('Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing100176'College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing100083'China Rural Technology Development Center,Beijing100045)Abstract This study designed two pairs of primers and probes and established a duplex digital PCR method for the quantitative detection of GM rice TT51-1event based on the sequence of sucrose phosphate synthase gene of rice and TT51-1event-specific gene,respectively.The absolute sensitivity and relative sensitivity were2copies/^L and0.1%respectively.The relative standard deviation(RSD)was among7.30%to18.63%while the deviation was among一8.77% to9.62%in6replicates,even the content of GM rice TT51-1event was as low as0.1%,met the requirements of standardized detection of GMO.The relative sensitivity of real-time PCR method established with the same pairs of primers and probes could reach only1%.In order to promote the standardization the application of this method,an intra-laboratory repeatability validation was performed on the chip-based digital PCR platform by different operators to verify the quantitative detection method established on the droplet digital PCR platform,and the results showed that the precision and accuracy of the assay still met the quantitative requirements.It was proved that this method could be applied to the quantitative detection of TT51-1GM rice ingredients in rice and its preliminary processing products.Keywords genetically modified rice；TT51-1event；quantitative detection；digital PCR科技动态中外科研团队揭示被子植物繁衍关键机制被子植物的受精过程是作物种子形成的关键环节，其繁衍受精讲求“独一无二”，这也是不同物种间存在生殖隔离的主要原因之一。
用于转基因大米克螟稻品系特异性基因成分精准定量检测的引物探针
专利名称：用于转基因大米克螟稻品系特异性基因成分精准定量检测的引物探针、试剂盒及方法
专利类型：发明专利
发明人：黄文胜,陈颖,邓婷婷,葛毅强,周杰,吴亚君
申请号：CN201610257607.7
申请日：20160425
公开号：CN107312817A
公开日：
20171103
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及用于转基因大米克螟稻品系特异性基因成分的精准定量检测的寡核苷酸引物探针，包含所述引物探针的试剂盒。
本发明还涉及用于定量检测转基因大米克螟稻品系特异性基因成分的数字PCR检测方法，所述方法包括使用针对转基因大米克螟稻品系特异性基因的特异性寡核苷酸引物和荧光标记探针。
本发明还涉及针对转基因大米品系特异性基因的特异性寡核苷酸引物和荧光探针在定量检测转基因大米克螟稻品系特异性基因成分中的应用。
使用本发明的数字PCR检测方法，能够精准灵敏地测定样品中转基因大米克螟稻品系特异性基因成分含量，灵敏度可以达到0.5
copies/μL。
申请人：中国检验检疫科学研究院
地址：100123 北京市朝阳区高碑店北路甲三号
国籍：CN
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一种检测转基因水稻TT51-1的引物、探针及试剂盒和方法[发明专利]
![一种检测转基因水稻TT51-1的引物、探针及试剂盒和方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3cf39ff2a8114431b80dd8e2.png)
专利名称：一种检测转基因水稻TT51-1的引物、探针及试剂盒和方法
专利类型：发明专利
发明人：徐俊锋,汪小福,陈笑芸,彭城,徐晓丽,魏巍
申请号：CN201811222905.8
申请日：20181019
公开号：CN109136339A
公开日：
20190104
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种转基因水稻TT51‑1的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法。
引物组由2条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID No：1～2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
检测试剂盒包括检测引物与探针溶液、Buffer A、Buffer B和阳性对照。
检测方法是采用特异性引物及探针在重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、链置换DNA聚合酶和核酸外切酶的作用下，在37～42℃对样品DNA模板进行扩增，通过对探针荧光信号收集的方法，判断样品是否含有转基因水稻TT51‑1成分。
本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、灵敏度高、特异性强等特点，适合现场检测。
申请人：浙江省农业科学院
地址：310021 浙江省杭州市石桥路198号
国籍：CN
代理机构：北京众合诚成知识产权代理有限公司
代理人：夏艳
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转基因大米定量检测TT51-1品系1.范围本标准规定了稻谷和大米中TT51-1品系的数字PCR定量检测方法。
本标准适用于稻谷和大米中TT51-1品系特异性的数字PCR定量检测。
本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1 %（w/w）。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.1 转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T 19495.5 转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T 19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法SN/T 1194 植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法3.术语、定义和缩略语3.1 术语和定义SPS基因：Sucrose Phosphate Synthase gene，水稻蔗糖磷酸合成酶基因。
TT51-1转化体特异性序列：Event-specific sequence of TT51-1，外源DNA插入受体水稻基因组后经重组产生的邻接区序列。
Taq酶：Taq DNA polymerase，源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。
模板：Template, 指数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。
定量检测低限：Limit of quantification（LOQ），在相对标准差不超过25 %的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。
质控样品：Quality control sample, 具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的TT51-1转化体基因组DNA。
微反应体系：Tiny reaction system, 将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其它微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。
转换系数：Conversion factor，将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量(W/W)时所用系数。
荧光标记探针：Fluorescently tagged probe, 在5’末端和3’末端分别连接荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。
PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。
3.2 缩略语PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。
数字PCR：digital polymerase chain reaction。
DNA：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。
dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。
bp：base pair，碱基对。
TE：Tris-HCl、EDTA缓冲液。
NC：Negaitive Control，阴性对照。
NTC：No Template control，空白对照。
QC：Quality control，检测质量对照。
PC：Positive Control，阳性对照。
FAM：6-carboxyfluorescein，羧基荧光素。
4.防污染措施数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T 19495.2的规定。
5.原理数字PCR（digital PCR）是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数的测定。
通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的模板浓度。
依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（Event specific sequence）和作物内参照基因（Species specific gene）的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量。
6.仪器和设备6.1 超纯水发生器（分子生物学级别）。
6.2 分析天平：感量0.1 g 和0.1 mg。
6.3 生物安全柜。
6.4 PCR扩增仪。
6.5 数字PCR系统：微反应体系发生器或其它具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其它具有同样功能的仪器。
6.6 恒温孵育箱：控温精度±1.0 ℃。
6.7 样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60目左右的粉末。
6.8 核酸定量仪：Nanodrop3000 或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪。
6.9 涡旋振荡仪。
6.10 离心机：最大离心加速度大于15000 g，并适用0.2 mL和1.5 mL离心管。
6.11 移液枪：量程0.5 µL~10 µL；量程10 µL~100 µL；量程100 µL~1000 µL。
7.试剂和材料除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T 19495.1的要求。
7.1 实验用水：应符合GB/T 6682中一级水的规格。
7.2 数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5’-3’外切活性的热启动Taq DNA 聚合酶及缓冲液的数字PCR专用预混试剂。
7.3 引物和探针：SPS基因和TT51-1转化体特异性序列的数字PCR检测引物和探针信息详见表1。
表1SPS基因和TT51-1转化体特异性序列的引物和探针扩增基因名称序列( 5’-3’)PCR扩增片段长度SPS基因上游引物GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG122 bp 下游引物GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC探针VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1TT51-1转化体特异性序列上游引物CTAGAGGATCCCGGACGAGTG90 bp 下游引物ATGAGTGGTAGCGTCCAGAAGGAAA探针FAM-CTGGGGCAGATAAGCAGTAGTGGTGGG -BHQ1注：1. 表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整。
2. 荧光探针的发光基团应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5'-FAM/3'-BHQ1或5'-VIC/3'-BHQ1方式标记。
3. 新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至10 M后分装，-20℃避光保存。
7.4 数字PCR微反应体系生成联排管或芯片。
7.5 96孔荧光定量PCR反应板和封膜。
7.6 0.2 mL和1.5 mL离心管。
7.7 移液枪头，量程0.5 µL~10 µL；量程10 µL~100 µL；量程100 µL~1000 µL。
8.实验步骤8.1 抽样按照GB/T 19495.7的规定执行。
8.2 样品制备除另有规定外，样品制备按照GB/T19495.7或SN/T1194的规定执行。
将样品适度破碎、均一化，取出至少200g，全部放入样品研磨机中，研磨至60目左右粒度。
破碎和研磨过程中应调整设备的操作参数，避免过热并防止样品粘连。
8.3 核酸提取纯化按照GB/T 19495.3的规定执行。
8.3.1 核酸提取及PCR抑制物的判断除另有规定外，DNA提取纯化及PCR抑制物的判断按照GB/T 19495.3中的规定执行。
称取2份（每份2 g）研磨后样品作为测试样，分别提取基因组DNA。
8.3.2 模板浓度控制采用PicoGreen dsDNA荧光定量试剂盒或其它具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶液的浓度，具体操作步骤参照相关仪器/试剂盒说明书。
数字PCR体系中的模板数应不高于微反应体系数的5倍。
为保证定量结果的准确性，体系中总模板数应不低于400个拷贝。
将样品DNA溶液作适度稀释，选择模板浓度在100-20000拷贝/μL范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测。
8.4 数字PCR扩增8.4.1 数字PCR体系配制按表2将各组分加入洁净离心管中，充分混匀。
表2 数字PCR反应体系注：数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家、型号的数字PCR仪作相应调整。
PCR体系配制及转移时尽量避免产生气泡。
8.4.2 微反应体系生成、数字PCR扩增及结果读取根据仪器要求，将配制好的数字PCR反应混合液，加入微反应体系生成装置的加样孔中，按仪器操作说明生成微反应体系。
将微反应体系放置于PCR扩增仪中，按以下参数进行PCR扩增：95℃，5min （1℃/s）,1个循环；94℃，15 s，60℃，1 min（1℃/s），50个循环；98℃10 min（1℃/s），1个循环；12 ℃保存反应产物。
对微反应体系进行荧光检测，记录阳性和阴性微反应体系数量及其比值。
根据比值分别计算数字PCR反应体系中的SPS基因拷贝数（copies/μL）和TT51-1转化体特异性序列拷贝数（copies/μL）。
注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。
9.检测质量控制9.1 对照设置和检测结果有效性判定阴性对照（NC）、空白对照（NTC）和阳性对照（PC）的设置如下：NC：采用非转基因大米的基因组DNA作为数字PCR反应模板；NTC：采用水作为数字PCR反应模板；PC：采用质控样品的基因组DNA作为数字PCR反应模板；每个测试样和PC的SPS基因或TT51-1转化体特异性序列的数字PCR须设置至少3个平行，且3个平行实验结果的相对标准偏差应不高于20%。
9.2 以下结果中若有一项不符合，则样品检测结果无效，应查找原因并重做试验：NC 和NTC 的TT51-1 转化体特异性检测无阳性扩增；PC 的SPS基因或TT51-1转化体特异性序列检测有阳性扩增；PC 的定量结果与已知值相符。
10.结果计算数字PCR仪运行后经软件计算得出每个测试样的SPS基因拷贝数和TT51-1转化体特异性序列拷贝数，取3个平行试验的均值，按照下列公式计算测试样的转基因成分含量：转基因大米品系TT51-1的含量（%）＝TT51-1转化体特异性序列拷贝数×100% 水稻内标准基因SPS拷贝数×转换系数备注：不同的大米或水稻样品有不同的转换系数，具体为：市售杂交稻种样品（F1代）的转换系数为0.33，市售杂交稻谷和大米样品（F2代）的转换系数为0.50。